DE2756851A1 - Adjuvantien unspezifischer immunitaet - Google Patents

Adjuvantien unspezifischer immunitaet

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DE2756851A1
DE2756851A1 DE19772756851 DE2756851A DE2756851A1 DE 2756851 A1 DE2756851 A1 DE 2756851A1 DE 19772756851 DE19772756851 DE 19772756851 DE 2756851 A DE2756851 A DE 2756851A DE 2756851 A1 DE2756851 A1 DE 2756851A1
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DE
Germany
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ribosomes
rna
mannitol
vaccine
corynebacterium
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DE19772756851
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Jacques Durand
D Hinterland Lucien Dussourd
Gerard Normier
Anne-Marie Pinel
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Pierre Fabre SA
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Pierre Fabre SA
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Description

WILHELMS & KILIAN
PATENTANWÄLTE
DR. ROLF E. WILHELMS DR. HELMUT KILIAN
QEIBELSTRASeE β
ΘΟΟΟ MÜNCHEN 8O
TELEFON CO 80) 47 40 73*
TELEX 62 34 07 (wtp-cO TELEGRAMME PATRANS MÖNCHEN
P 680
PIERRE FABRE S.A.
Adjuvantien unspezifischer Immunität
Priorität: 21. Dezember 1976 - FRANKREICH - 76 38 566
809825/1025
Pierre Fabre S.A. P 680
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft Adjuvantien unspezifischer Immunität.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß die Ribosomen und die Ribosomen-Ribonucleinsäure (Ribosomen-RNS) gewisser Bakterien zusätzlich zu ihrer spezifischen Immunogenität unspezifische immune— stimmulierende Eigenschaften besitzen, die durch Stimmulation des retothelialen (reticuloendothelialen)
Systems die immunitären Abwehrkräfte des Organismus im allgemeinen verstärken und stimmulieren können.
Die unspezifische Immunogenität kann auf zwei Arten ausgenutzt werden: zum einen durch Verstärkung der allgemeinen Abwehrkräfte des Organismus hinsichtlich infektiöser bakterieller Erkrankungen, wobei das oder die
Immunitätsadjuvantien in der verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung als wesentlicher Wirkstoff verwendet werden; andererseits können sie verwendet werden, um die Wirkung eines spezifischen Impfstoffes zu potenzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Adjuvans unspezifischer Immunität, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Ribosomen oder Ribosomen-RNS mindestens einer der
folgenden Bakterien besteht:
Corynebacterium acnei,
Corynebacterium parvum,
Corynebacterium granulosum,
Corynebacterium flavidum,
Mycobacterium smegmatis,
Mycobacterium chelonei,
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Pierre Fabre S.A. P 680
Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia rhodocrans, Nocardia opaca,
Nocardia rubra.
Diese erfindungsgemäßen Adjuvantien unspezifischer Immunität liegen vorzugsweise gefriergetrocknet vor.
Die Erfindung betrifft ebenfalls immunotherapeutisehe Mittel mit Gehalt an mindestens einem der erfindungsgemäßen Adjuvantien in einem therapeutisch verträglichen Trägermaterial.
Insbesondere betrifft die Erfindung immunotherapeutische Zusammensetzungen, die parenteral, oral, rectal oder lokal anwendbar sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls iniraunotherapeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Adjuvantien unspezifischer Immunität als einzigen Hauptwirkstoff enthalten.
In dem Fall, in dem die erfindungsgemäßen Adjuvantien unspezifischer Immunität der einzige Hauptwirkstoff der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind, liegen die Zusammensetzungen vorzugsweise in einer Form vor, die injiziert werden kann, und enthalten vorzugsweise 0,1 bis 1 Gewichtsprozent Adjuvantien unspezifischer Immunität, wobei jede Dosiereinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung vorzugsweise zwischen 1 und 10 mg beträgt.
Der therapeutisch verträgliche Träger für diese Zusammensetzungen kann beliebig sein; er ist jedoch vorzugsweise Mannitol, gegebenenfalls in einem Puffer, wie beispielsweise einem Phosphatpuffer.
Im folgenden werden einige Formulierungsbeispiele derartiger Zusammensetzungen gegeben:
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Formulierung Typ I
Ribosomen-RNS des Corynebacterium parvum 30 uq Mannitol 5 mg
Formulierung Typ II
Ribosomen von Corynebacterium acnei 50 ug
Mannitol 5 mg
(Tris KCl 0,01 M )
( )
Puffer pH 7 (MgCl9 0,01 M) 0,5 ml gefriergetrocknet ( )
(NaCl 0,15 M )
Formulierung Typ III
RNS von Mycobacterium smegmatis 30 \iq
Membran-Glycopeptide von
Serratia marcessens 75 μg
Mannitol 5 mg
Verwendet man als Adjuvantien unspezifischer Immunität RNS'n, kann die Gewichtsmenge je Dosis der Zusammen-
_j. setzung viel geringer als die sein, wenn man die entsprechende Ribosomenfraktion verwendet.
Die Formulierung vom Typ III ist eine Zusammensetzung, in der die erfindungsgemäßen Adjuvantien unspezifischer Immunität zusammen mit anderen Immunitätsadjuvantien, wie
2Q im vorliegenden Fall mit Membran-Glycopeptiden, enthalten sind. Man kann gleichermaßen andere Immunitätsadjuvantien verwenden wie Glycopeptidextrakte aus Zellwänden oder Membranen von Bakterien, Glycoproteinextrakte aus Bakterien·
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membranen oder ganzen Bakterien; Polysaccharide aus externen und capsularen Membranen von gramnegativen Bakterien.
Werden die Adjuvantien unspezifischer Immunität verwendet, um die Wirkung von Impfstoffen zu potenzieren, soll die Gewichtsmenge an Adjuvantien unspezifischer Immunität zwischen 10 und 100 Gewichtsprozent des aktiven Wirkstoffteils des Impfstoffs betragen.
Im folgenden werden einige beispielhafte Formulierungen wiedergegeben:
Formulierung Typ IV
RNS von Mycobacterium smegmatis 30 μg
Broncho-Impf stoff-ORL 24 μg
Mannitol 5 mg
Formulierung Typ V
Ribosomen von Corynebacterium parvum 10 ng
Broncho-Impfstoff-ORL 25 μg
Mannitol 5 mg
Formulierung Typ VI
25
Ribosomen-RNS von Corynebacterium parvum 7 ug
Broncho-Impfstoff-ORL 25 μg
Mannitol 5 mg
Formulierung Typ VII
Ribosomen RNS von Corynebacterium parvum 10 ug Broncho-Impfstoff-ORL 25 μg
Mannitol 5 mg
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Vergleichsformulierung
Broncho-Impfstoff-ORL 25 ng
Mannitol 5 mg
Der Broncho-Impfstoff-ORL dieser Zusammensetzungen besteht aus:
Ribosomenfraktionen (gefriergetrocknetes Produkt^ entsprechend 0,005 ng Ribosomen mit 70% RNS), 0,010 ng erhältlich durch Extraktion aus mikrobischen Kulturen und in den folgenden Mengen enthalten:
Ribosomen von Klebsiella pneumoniae 35 Teile
Ribosomen von Diplococcus pneumoniae 30 Teile Ribosomen von Streptococcus pyogenes
Gruppe A 30 Teile
Ribosomen von Hemophilus influenzae 5 Teile
Membranfraktionen von Klebsiella pneumoniae (gefriergetrocknetes Produkt, entsprechend 0,008 μ9 Glycoproteinen und maximal 0,0012 ug Quecksilberthiolat des Natrium enthaltend) 0,015 ng
Dieser Impfstoff kann gemäß der französischen Patentschrift 73 43 957 hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin verwendet werden.
Die Ribosomen und die Ribosomen-RNS können in an sich bekannter Weise, beispielsweise gemäß den französischen Patentschriften FR-PS 73 43 957 und 75 10 252 hergestellt werden.
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Insbesondere kann man die bakteriellen Ribosomen, die erfindungsgemäß als Adjuvantien unspezifischer Immuni-, tat verwendet werden, wie folgt herstellten:
Ein zerstampftes Gemenge von Bakterienzellen wird bei 30 000 g in wässriger Lösung zentrifugiert; die obere Phase wird abgenommen; die darin enthaltenen Ribosomen werden, vorzugsweise durch Äthylalkohol, ausgefällt.
Die auf diese Weise ausgefällten Ribosomen werden gegebenenfalls beispielsweise durch Behandlung mit Natriumdodecylsulfat gereinigt.
Das zerstampfte Gemenge kann auf beliebige Weise, beispielsweise durch Behandlung einer Bakterienkultur in einem Homogenisator erhalten werden.
Die Ribosomen-RNS werden aus Ribosomen in wässriger Phase durch Extraktion mit Phenol hergestellt, wobei sich die Ribonucleinsäuren am Ende der Extraktion in der wässrigen Phase befinden. Sie können aus der wässrigen Phase durch Ausfällung mit Äthylalkohol gewonnen werden.
Sie können darüber hinaus gereinigt werden, falls dieses notwendig sein sollte.
Im folgenden wird in Form eines Beispiels ein Herstellungsverfahren für Ribosomen und RSN, die in den vorhergehenden Formulierungen verwendet wurden, erläutert. Der Corynebacterium-parvum-Stamm wird in Geflügelleber-Agar eingebracht und alle zwei Monate erneut geimpft. Ein Agar-Röhrchen wird als Nährboden für die Vorkultur verwendet. Die Vorkultur wird in 300 ml reduzierendem Medium (Thioglycolat-Cystein) als statische Kultur bei 37° C über 24 Stunden im Heizschrank angelegt.
Genau genommen wird die Kultur in einer Fermentationsvorrichtung mit einem Fassungsvermögen von 20 1 angelegt, die 15 1 eines Nährbodens aus Fleischextrakt, Hefe-
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extrakt, Trypton, Glucose, NaCl und Natriumthiocflycolat enthält. Die Vorkultur wird in die Fermentationsvorrichtung durch Verwendung eines Überdruckes steriler Luft umgefüllt; das Wachstum erfolgt bei 37° C unter leichter Bewegung bei schwacher Belüftung, wobei der pH-Wert 7 durch automatische Zugabe von Soda gehalten wird. Die Wachstumszeit beträgt 48 bis 72 Stunden und die Kontrolle wird durch Messung der optischen Dichte in gleichmäßigen Abständen durchgeführt.
Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase werden die Zellen durch Zentrifugieren (Sharpies) abgetrennt, wobei die Fermentationsvorrichtung mit der Trennvorrichtung (Separator) steril und unter überdruck steriler Luft verbunden wird. Der Nährboden wird nach Dekontermination beseitigt und die Biomasse durch Zentrifugieren mit einem sterilen Puffer (Tris-HCl 0,01 m, pH 7, mit 0,01 m Gehalt MgCl2 und 0,15m Gehalt NaCl) bei +4° C gereinigt. Das bakterielle Konzentrat wird zur Verwendung sofort eingefroren. In diesem Stadium wird eine bakteriologische Kontrolle durchgeführt, um den Stamm sowie die Anzahl der wiederbelebungsfähigen Keime ebenso wie die Abwesenheit von Verunreinigungen zu bestimmen.
Um bedeutendere Biomassen zu erhalten, wird die Fermentationsvorrichtung mit dem Fassungsvermögen von 20 1 zum Voriermentieren für eine Fermentationsvorrichtung mit einem Fassungsvermögen von 600 1 verwendet, wobei Aufzucht und Gewinnung der Zellen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden.
Im folgenden wird die Herstellung der ribosomalen Fraktion beschrieben.
Die Biomasse wird in dem Puffer Tris-HCl, MgCl2* NaCl, pH-Wert 7 suspendiert, so daß etwa 1 g trockne Zellen in 20 ml der Suspension enthalten sind. Nach schneller Homo-
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genisierung in einem Ultra-Turrax wird die Suspension durch dreimaliges Durchleiten durch einen Homogenisator APV, der mit Zerkleinerungsklappen ausgestattet ist, bei Maximaldruck, beispielsweise 560 kg/cmJ, zerkleinert. Dann wird die Suspension in einem Lamellenaustauscher abgekühlt.
Nach der Zerkleinerung wird die Suspension durch Durchtritt durch einen Sharpies bei 10 000 g zur Beseitigung der Zellenreste geklärt. Die Oberphase wird 45 Minuten bei 30 000 g und 4° C zentrifugiert, um die Wände, Membranen und andere Fraktionen hohen Molekulargewichts zu entfernen.
Die obere Phase des 30 000 g-Zentrifugierens, die die Ribosomen enthält, wird aufbewahrt und die Fraktion mit den rohen Ribosomen durch Zugabe von 0,8 Volumen 96%igen Äthylalkohols bei Vorkühlung auf -20° C ausgefällt. Nach 30 Minuten bei 4° C wird der Niederschlag in einem Sharpies gesammelt; die obere Phase wird entfernt.
Der Niederschlag an rohen Ribosomen wird durch einstündiges Rühren in einem Volumen Puffer (Tris-HCl-MgCl2-NaCl, Ph-Wert 7) bei 15° C suspendiert; dann setzt man so viel Natriumdodecylsulfat zu, um eine Abschlußkonzentration von 0,5% zu erhalten (einstündiges lebhaftes Schütteln bei Zimmertemperatur).
Die gewaschenen Ribosomen werden erneut durch Zugabe von 0,7 Volumen Äthylalkohol bei -20° C ausgefällt. Dann wird das Produkt 30 Minuten bei Zimmertemperatur sich selbst überlassen.
Die ausgefällten gewaschenen Ribosomen werden im Sharpies bei 10 000 g gesammelt; die obere Phase wird entfernt.
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Der Niederschlag wird im gleichen Puffer (0,4 Volumen des anfänglichen Suspensionsvolumens) durch leichtes Schütteln über Nacht bei 0° C aufgenommen.
Dann wird durch 60 minütiges Zentrifugieren bei 30 000 g und 0° C geklärt, wobei die obere Phase, die die Robosomen enthält, durch Gerinnen, Gefrieren oder Gefriertrocknen nach Sterilisation durch eine Membran (Porosität 0,22 u) konserviert.
Im folgenden wird die Extraktion von Ribosomen-RNS beschrieben.
Die RNS wird durch Phenol unter den folgenden Bedingungen aus dem vorhergehenden Ribosomenpräparat extrahiert:
Eine 80%ige Phenollösung wird mit dem Puffer Tris-HCl 0,001 m, pH-Wert 7, mit Gehalt an EDTA 0,001 m und 0,5% Natriumdodecylsulfat hergestellt. Diese Lösung wird bei 65° C thermostatisiert.
Die Extraktion wird bei gleichen Volumen während 10 Minuten bei 65° C unter Rühren bzw. Schütteln durchgeführt. Die Mischung wird dann schnell auf +4° C abgekühlt; die wässrige Phase wird durch Einleiten in einen Sharpies, der mit einer Trennschale versehen ist, gesammelt. Die Phenolphase wird entfernt.
Die wässrige Phase wird erneut zweimal unter den gleichen Bedingungen mit einem halben Volumen Phenol extrahiert. Die wässrige Endphase wird dreimal mit einem Volumen Äther zur Entfernung des rückgebliebenen Phenols extrahiert. Der verbleibende Äther in der wässrigen Phase wird durch Stickstoff ausgetrieben.
Dann wird der wässrigen Phase Natriumchlorid zugesetzt, um eine Molaiität von 0,1 m zu erhalten. Die RNS wird dann durch Zugabe von 2 Volumen Äthylalkohol über vier Stunden bei -20° C ausgefällt.
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Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei 10 000 g und 0° C in einem Sharpies gesammelt und in einem Puffer Tris-HCl 0,025 m, pH-Wert 8,1, mit Gehalt an 0,025 m NaCl bei 2° C aufgenommen, um etwa 2 mg RNS je ml Lösung zu erhalten.
Im folgenden wird die Reinigung der Ribosomen RNS beschrieben.
Die Ribosomen-RNS kann noch mit Spuren von Kohlehydraten verunreinigt sein, die wie folgt entfernt werden können:
Der vorhergehenden RNS-Lösung werden ein Volumen einer 2,5 m Kaiiumhydrogenphosphatlösung und ein Volumen 2 Methoxyäthanol zugesetzt. Dann wird zwei bis drei Minuten kräftig gerührt und anschließend fünf Minuten bei 10 000 g und 4° C zentrifugiert. Die klare überstehende Phase wird vorsichtig abgenommen und mit einem Volumen 0,2 m Natriumacetat gemischt.
Dann wird die RNS durch langsame Zugabe von 0,5 Volumen einer wässrigen Lösung, die 1%ig an Cetyltrimethylammoniumbromid ist, ausgefällt. Die Reaktionsmischung wird fünf Minuten bei 4° C sich selbst überlassen; dann wird der Niederschlag durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 4° C gesammelt. Der Niederschlag wird zweimal mit Überschuß an 70%igem Alkohol, der 0,1 molar an Na- 2'., triumacetat ist, gewaschen und in Lösung in einen Puffer Tris-HCl 0,01 m, pH-Wert 7, aufgenommen und eine Nacht bei 2° C gegen 20 Volumen des Puffers dialysiert.
Das Dialysat wird schließlich gefriergetrocknet.
Zum Nachweis der Aktivität des erfindungsgemäßen Adjuvans unspezifischer Immunität wurde die immunologische Aktivität der Formulierungen vom Typ V, VI, VII und die des ORL-Impfstoffs allein untersucht. Jede Formulierung wurde an jeweils 10 Mäusen untersucht.
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Jedes Tier erhielt eine Halbdosis bei jeder Injektion, wobei die Injektionen im Rhythmus von 5 Injektionen in Tagen subcutan verabreicht wurden. Nach 10 Tagen Ruhe wird das Tier sinus-retro-orbital punktiert. Die Seren werden hinsichtlich ihrer Immunodiffusion (Ouchterlony) und hinsichtlich ihrer Immunoelektrodiffusion (Laurell) gegen die vollständigen bakteriellen Antigene, aus denen die Ribosomen extrahiert wurden, untersucht.
In diesem Fall enthielt der ORL-Impfstoff Ribosomen der Klebsiella pneumoniae.
Bei der Immunoelektrodiffusion ist die Höhe der "Rockets" proportional der Konzentration an spezifischen Antikörpern des Antigens (hier Kelbsiella pneumoniae 600 μΐ).
Man stellt fest, daß die "Rockets",die den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, d.h., die die Adjuvantien unspezifischer Immunität enthalten, entsprechen, insgesamt erheblich wichtiger als der "Rocket" ist, der dem ORL-Impfstoff alleine entspricht, und daß man deshalb eine deutliche Erhöhung der immunologischen Abwehrkraft der erfindungsgemäßen Impfstoffe im Vergleich zu dem ORL-Impfstoff feststellen kann.
Die erfindungsgemäßen Präparate können deshalb allgemein zur Vorbeuge gegen Krankheiten bakteriellen Usprungs oder zur Vermeidung bestimmter Krankheiten für den Fall, daß sie einen Impfstoff enthalten, verwendet werden. 25
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Claims (12)

Pierre Fabre S.A. P PATENTANSPRÜCHE
1. Adjuvans unspezifischer Immunität, dadurch gekennzeichnet , daß es mindestens eine Fraktion der Ribosomen und/oder der Ribosomen-RNS mindestens einer der Bakterien: 5
Corynebacterium acnei, Corynebacterium parvum, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium flavidum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium chelonei, Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia rhodocrans, Nocardia opaca,
Nocardia rubra
enthält.
2. Immunotherapeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet , daß es als aktive Komponente mindestens ein Adjuvans unspezifischer Immunität gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem therapeutisch verträglichen
Träger enthält.
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3. Inununotherapeutisches Präparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich einen Impfstoff enthält.
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INSPECTED
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4. Immunotherapeutisches Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß es 0,1 bis 1 Gewichtsprozent Adjuvans unspezifischer Immunität, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, enthält.
5. Immunotherapeutisches Präparat nach mindestens einem der Ansprüche 2 und 4, dadurch gekennzeichnet , daß es in einer Dosisform von 1 bis 10 mg vorliegt.
6. Immunotherapeutisches Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß es zwischen 10 und 100 Gewichtsprozent Adjuvans unspezifischer Immunität, bezogen auf den Impfstoff, enthält.
7. Immunotherapeutisches Präparat nach mindestens einem der Ansprüche 1, 2,4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß es einer der folgenden Zusammensetzungen entspricht:
a) Ribosomen-RNS von Corynebacterium parvum 30 μg Mannitol 5 mg
b) Ribosomen von Corynebacterium acnei 50 ng
Mannitol 5 mg
( tris KCl 0,01 m )
Puffer pH-Wert 7 j MgCl, 0,01 m J 0,5 ml gefrier-
( NaCl 0,15 α ) ^trocknet
c) RNS von Mycobacterium smegmatis 30 ug Membran-Glycopeptide von Serratia marcessens 75 ng Mannitol 5 mg
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8. Immunotherapeutisches Präparat nach mindestens einem der Ansprüche 2, 3 und 6, dadurch gekennzeichnet , daß es einer der folgenden Zusammensetzungen entspricht:
5
a) RNS von Mycobacterium smegmatis Broncho-Impfstoff-ORL
Mannitol 5 mg
b) Ribosomen von Corynebacterium parvum Bronoch-Impfstoff-ORL
Mannitol 5 mg
c) Ribosomen-RNS von Corynebacterium parvum Broncho-Impfstoff-ORL
1- Mannitol 5 mg
d) Ribosomen-RNS von Corynebacterium parvum Broncho-Impfstoff-ORL
Mannitol 5 mg
9. Verfahren zur Herstellung von bakteriellen Ribosomen, die als Adjuvantien unspezifischer Immunität gemäß Anspruch 1 verwendbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß man eine zerstampfte Masse bakterieller Zellen, die den zu extrahierenden Ribosomen entsprechen, bei 30 000 g in wässrigem Medium zentrifugiert, und daß man die überstehende wässrige Phase abhebt und aus dieser die Ribosomen ausfällt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man die Ribosomen aus der wässrigen Phase durch Äthylalkohol ausfällt.
30 ng 24 ng 10 ng 25 ng 7 ng 25 ng 10 ng 25 ng
80982b/ 1 0? S
Pierre Fabre S.A. P
11. Verfahren zur Herstellung von Ribosomen-RNS,
die als Adjuvans unspezifischer Immunität gemäß Anspruch verwendbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Suspension von Ribosomen, die der zu extrahierenden RNS entsprechen, mit Phenol behandelt, und daß man die wässrige Phase zur Ausfällung der RNS abtrennt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die RNS aus der wässrigen Phase mit Äthylalkohol ausfällt.
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