DE2613943C3 - Herstellung von Vaeeinen auf Ribonucleinsäurebasis - Google Patents

Herstellung von Vaeeinen auf Ribonucleinsäurebasis

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Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch gekennzeichnete Verfahren.
Die bekannten Vaccine sind zwar wirksam, besitzen jedoch eine Antigenaktivität, die variiert je nach verwendeten Mikroorganismen und Zubereitung, nämlich je nach Verwendung von abgetöteten, abge- schwächten oder gelösten, als Krankheitserreger wirkenden Mikroorganismen. In jedem Falle ist die Antigenaktivität dieser bekannten Vaccine eindeutig geringer als diejenige von lebenden Mikroorganismen.
Aufgabe der Erfindung ist es, die aufgezeigten Nachteile zu beheben und Vaccine zu schaffen, die im Laufe ihrer Herstellung keinen Verlust an Antigenaktivität erleiden.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die Antigenaktivität bestimmter Mikroorganismen in der RNS lokalisiert ist und daß es möglich ist, acelluläre Vaccine auf der Basis von RNS herzustellen (vgl. insbesondere »Infect, and Immunity«, 1, 574-82, 1970). Ein Hauptproblem dieses Vaccintyps ist jedoch die vergleichsweise labile Natur der RNS, weshalb es wichtig erschien, die RNS mit einem Hilfsmittel zu kombinieren, das die Stabilisierung der RNS sicherstellt und die Aufrechterhaltung einer Antigenwirkung bewirkt, die derjenigen von lebenden Zellen vergleichbar ist
Erfindungsgemäß wird daher ein acelluläres Vaccin auf Ribonucleinsäurebasis dadurch geschaffen, daß man pro 100 Gewichtsteile Ribonucleinsäure des oder der dem Vaccin entsprechenden Mikroorganismen zwischen 100 und 200 Gewichtsteile aus Bakterien extrahierte Membranlipopolysaccharide oder -polysaccharide miteinander vermischt.
Typische Bakterien, deren Lipopolysaccharide und Polysaccharide in besonders günstiger Weise verwendbar sind, sind die folgenden:
Klebsiella:
Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoscleromatis
Serratia:
Serratia corallina Serratia indica Serratia keilensis Serratia kiliensis Serratia marsescens Serratia plymuthica
Corynebacterium:
Corynebacterium avidum Corynebacterium bovis Corynebacterium enzymicum Corynebacterium equi Corynebacterium fascians
Corynebacterium flaccumfaciens Corynebacterium flavidum Corynebacterium fusifonne Corynebacterium granulosum Corynebacterium helvoium Corynebacterium hypertrophicans Corynebacterium insidiosum Corynebacterium liquefaciens Corynebacterium parvum Corynebacterium parvum infectiosum Corynebacterium paurome tabolum Corynebacterium pyogenes Corynebacterium tumescens Corynebacterium xerosis
Erfindungsgemäß sind in besonders günstiger Weise die folgenden Vaccine herstellbar:
ein Broncho ORL-Vaccin der Zusammensetzung Ribosomen-RNS von Klebsiella Pneumoniae ^o Ribosomen-RNS von Hemophilus Influenzae Ribosomen-RNS von Streptococcus Ai2 Ribosomen-RNS von Pneumococcus Typ II und Membranlipopolysaccharide von Klebsiella;
ein antipyorrhoetisches Vaccin der folgenden Zusammensetzung:
Ribosomen-RNS von Rothia Dentocariousus Ribosomen-RNS von
Streptococcusmutante Salivarius Jn Ribosomen-RNS von Lactobacillus Casei und
Membranlipopolysaccharide von Serratia Marsescens;
ein Intestinal-Vaccin der folgenden Zusammensetzung: Ribosomen-RNS von Bacterium coli
Ribosomen-RNS von Salmonella Paratyphi A Ribosomen-RNS von Salmonella Paratyphi B Ribosomen-RNS von Shigella dysentariae Ribosomen-RNS von Enterococcus und Membranlipopolysaccharide von Serratia Marsescens.
Diese Vaccine enthalten 100 bis 200 Gew.-Teile Membranlipopolysaccharide pro 100 Gew.-Teile Gesamt-Ribosomen-RNS.
In den vorstehend angegebenen Vaccinen sind zwar die Membranlipopolysaccharide aus einem einzigen Bakterientyp extrahiert, doch ist es selbstverständlich auch möglich, Membranlipopolysaccharide zu verwen-■>o den, die aus mehreren Typen von Bakterien extrahiert sind.
Mit der Formulierung »Mikroorganismen, die den Vaccinen entsprechen« soll zum Ausdruck gebracht werden, daß die gleichen Mikroorganismen wie zur Herstellung in einem Vaccin aus abgetöteten, abgeschwächten oder gelösten Mikroorganismen des Standes der Technik verwendet werden.
Gemäß einer zweckmäßigen Ausführungsform werden die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide de aus einer die Membranen enthaltenden, wäßrigen Suspension extrahiert durch Behandlung der wäßrigen Suspension mit Phenol, wobei diese Operation mehrere Male wiederholt werden kann, bevor die dabei erhaltene wäßrige Lösung, welche die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide enthält, isoliert wird. Die letzten Spuren von Phenol werden aus der wäßrigen Phase am besten durch Dialyse der wäßrigen Lösung gegen fließendes Wasser entfernt. Die Extrak-
tion wird zweckmäßig in der Wärme bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und 80° C, am besten bei 650C, mit einer 90%igen Phenollösung durchgeführt
Die Membransuspension wird zweckmäßig aus einem homogenen Brei von Mikroorganismen dadurch gewonnen, daß eine erste Zentrifugation bei einer solchen Beschleunigung durchgeführt wird, daß die intakten Zellen und Zellbruchstücke sedimentieren, worauf eine zweite Zentrifugation unter einer Beschleunigung durchgeführt wird, die die Sedimentation von Membra- ι ο nen, nicht jedoch von Ribosomen sicherstellt, wobei am besten die erste Sedimentation bei einer Beschleunigung in der Größenordnung von 5000 bis 10 000 g und die zweite Sedimentation bei einer Beschleunigung von 30 000 bis 50 000 gerfolgt is
Der Bodensatz der zweiten Zentrifugation, der die Membranen enthält, wird sodann in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert, z. B. in destilliertem Wasser, unter Erzielung der Suspension, die wie angegeben mit Phenol extrahiert wird.
Zweckmäßig wird die Lösung vor der zweiten Zentrifugation mit Desoxyribonuclease behandelt durch 30 Minuten lange Induktion bei 15°C
Gemäß einer Ausführungsform wird die RNS hergestellt aus einem homogenen wäßrigen Brei von Mikroorganismen, aus dem man durch eine oder mehrere Zentrifugationen die intakten Zellen, die Zellbruchstücke und die Membranen extrahiert, die in der erhaltenen Lösung enthaltenen Ribosomen werden sodann durch Polyäthylenglycol ausgefällt und der 3η erhaltene Niederschlag wird in einer wäßrigen Lösung suspendiert, am besten in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 bei 4°C, worauf die Suspension ein oder mehrere Male mit Phenol behandelt und jedes Mal die wäßrige Phase gesammelt und die organische Phase verworfen wird, wobei die wäßrige Phase die RNS enthält Gemäß einer Abwandlung dieses Verfahrens enthält die organische Extraktionsphase Phenol, Natriumdodecylsulfat und EDTA in Form des Dinatriumsalzes, und am günstigsten enthält diese Phase 80% Phenol, 4» das im Gleichgewicht steht mit dem gleichen Phosphatpuffer, wie er für die Suspension verwendet wird, ferner 0,5% Natriumdodecylsulfat und 0,001 M-EDTA.
Die Extraktion wird zweckmäßig in der Wärme bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und 700C, am besten bei etwa 65° C durchgeführt, und das Abheben der Phasen erfolgt zweckmäßig bei 4° C. Das restliche Phenol wird aus der wäßrigen Phase mit Hilfe bekannter Techniken entfernt, z. B. durch Extraktion mit Äther. Die RNS wird aus der wäßrigen Lösung so durch Ausfällen gewonnen, z. B. mit Hilfe von Äthanol, und im Bedarfsfall wird der restliche Äther zuvor aus der wäßrigen Lösung entfernt, z. B. durch Einleiten eines Inertgases, wie z. B. Stickstoff. Selbstverständlich kann die RNS auch mit Hilfe eines anderen Verfahrens aus den Mikroorganismen extrahiert werden, z. B. nach dem in der angegebenen Druckschrift »Infect and Immunity«, 1,574 -82,1970, beschriebenen Verfahren.
Werden die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide aus den gleichen Mikroorganismen extrahiert, die auch zur Herstellung der RNS dienen, wird die Extraktion von Ribosomen-RNS aus dem Bakterienbrei in zwei Stufen durchgeführt, nämlich einer ersten Zentrifugation, die die Sedimentation der intakten Zellen und der Zellbruchstücke ermöglicht, und einer zweiten Zentrifugation, die die Sedimentation der Membranen unter in Lösunglassen der Ribosomen-Ribonucleinsäuren ermöglicht. Gehören die behandelten Mikroorganismen mehreren Typen an, so können sie entweder gemeinsam oder separat behandelt werden.
Der homogene Brei aus Mikroorganismen bzw. Bakterien wird ebenso für die Extraktion der RNS als auch der Lipopolysaccharide und der Polysaccharide hergestellt aus einer Kultur, die in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 gewaschen und anschließend in dem gleichen Phosphatpuffer, der 10-2N-MgCk und 3 χ ΙΟ-4 % Polyvinylsulfat enthält, aufgenommen wird, um die Aktivität endogener Ribonucleasen zu vermindern.
Die auf diese Weise erhaltene Bakteriensuspension wird sodann mit Hilfe einer sogenannten Manton-Gaulin-Vorrichtung unter einem Druck in der Größenordnung von 630 kg/cm2 zerkleinert oder auch durch Behandlung mit Ultraschall.
Die folgenden Versuche zeigen die Aktivität von erfindungsgemäß erhaltenen Vaccinen:
Broncho ORL-Vaccin
Ribosomen-RNS von
Klebsieila Pneumoniae
Ribosomen-RNS von
Hemophilus Influenzae
Ribosomen-RNS von
Streptococcus A12
Ribosomen-RNS von
Pneumococcus Typ II
Membranlipopolysaccharide von Klebsiella
Antipyorrhoe-Vaccin
Ribosomen-RNS von
Rothia Dentocariosus
Ribosomen-RNS von
Streptococcenmutante
Salivarius
Ribosomen-RNS von
Lactobacillus Casei
Membran-Lipopolysaccharide von Serratio Marsescens
Intestinal-Vaccin
Ribosomen-RNS von
Bacterium CoIi
Ribosomen-RNS von
Salmonella Paratyphi A
Ribosomen-RNS von
Salmonella Paratyphi B
Ribosomen-RNS von
Shigella dysentariae
Ribosomen-RNS von
Enterococus
Membran-Lipopolysaccharide von Serratia Marsescens
35 5
30 30 150
33
33 33
150
30 20 20 10 20 150
Das Versuchstier, Maus oder Kaninchen, wurde, mit Hilfe einer der vorstehend angegebenen, erfindungsgemäß erhaltenen Vaccine immunisiert. Die Ummunisierung erfolgte bei der Maus durch subcutane Verabreichung einer Injektion von 2, 12 bzw. 24 γ Vaccin alle zwei Tage.
Nach 45 Tage langer Immunisierung wurden die 1 ijektionen 15 Tage lang eingestellt und es wurde eine erneute Injektion verabreicht 48 Stunden vor der intracardialen Punktion des Versuchstiers, wobei das Blut entnommen und das Serum untersucht wurde nach der Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrodiffu-
sion auf Gesamt-Bakterienantigea aus dem das Ribosomenantigen extrahiert worden war.
Es wurden 5 Gruppen von jeweils 10 Mäusen verwendet, davon
— eine Vergleichsgruppe von Versuchstieren, die nicht behandelt worden waren,
— eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem Gesamt-Bakterienantigen immunisiert worden waren,
— eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vaccin in Dosierungen von 2 γ immunisiert worden waren,
— eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vaccin in Dosierungen von 12 γ immunisiert worden waren, und
— eine Gruppe von Versuchstieren, die mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vaccin in Dosierungen von 24 γ immunisiert worden waren.
Nach Ouchterlony enthielten die Seren der Versuchstiere, die mit Hilfe des erfindungsgemäß erhaltenen Vaccins immunisiert worden waren, alle Antigenfraktionen des Bakteriums unabhängig von der injizierten Dosis, mit der die Tiere das gesamte Antigen erhalten haben.
Nach der Immunoelektrodiffusion war ersichtlich, daß bei den Mäusen, welche mit Hilfe des erfindungsgemäß erhaltenen Vaccins immunisiert worden waren, die Antikörper sehr viel schneller und in höheren Konzentrationen auftraten.
Die Vaccinaktivität dieser Vaccine ist somit höher als diejenige der Bakterien, aus denen sie extrahiert wurden und der Zeitraum bis zum Auftreten von Antikörpern ist kürzer.
Diese Vaccine sind zur Behandlung derselben Infektionskrankheiten verwendbar, wie die Vaccine anderer entsprechender Typen, die aus den gleichen, abgetöteten, abgeschwächten oder gelösten Mikroorganismen gewonnen wurden.
Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden eine Ausführungsform beschrieben.
Herstellung der Ribosomen-RNS
Die verwendeten Bakterienstämme wurden aus pathologischen Abstrichen isoliert, diese Mikroorganismen wurden durch Passage durch Laboratoriumstiere, ggf. Mäuse, reaktiviert und in geeigneten Kuitivierungsmedien konserviert. Aus den auf diese Weise erhaltenen Stämmen wurden Inokulate hergestellt durch Einimpfen jedes Mikroorganismus in ein flüssiges Nährmedium, das 24 Stunden lang bei 35° C inkubiert wurde. Dieser Impfstoff wurde zum Beimpfen einer Batterie von Fermentern verwendet, die zur Vacänherstellung bestimmt waren. Nach 24 Stunden Kultivierung unter Rühren wurden die Bakterienzellen isoliert durch Durchleiten des Nährmediums durch eine entsprechende Klärvorrichtung. Die Zellen wurden sodann mit einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 gewaschen, danach in einem 0,01 M-Phosphatpuffei von pH 7,1, der ΙΟ-* N-MgCl2 und 3 χ 10-·· % Polyvinylsulfat enthielt, aufgenommen. Die Bakterimiuispension wurde sodann zerkleinert durch Duichieiten durch eine entsprechende Vorrichtung bei 630 kg/cm2 (3 Passagen) und 4° C. Diese Zerkleinerung kann auch durch Behandeln der Suspension mit Ultraschall bewirkt werden.
Das auf diese Weise erhaltene zerkleinerte Zellmaterial oder der Zellbrei wurde 15 Minuten lang bei 2500 UpM bei 4° C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 5μ^/πι1 Desoxyribonuclease versetzt und 30 Minuten lang bei 15°C inkubiert. Die Membranen wurden sodann sedimentiert durch 30 Minuten langes Zentrifugieren bei einer Beschleunigung in der Größen-5 Ordnung von 30 bis 40 000 g bei 4°C Die im Überstand enthaltenen Ribosomen wurden ausgefällt durch Zugabe von 100 g/l Polyäthylenglycol 4000 bei 4°C während einer Zeitspanne von 30 Minuter.. Die ausgefällten Ribosomen wurden durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 10 000 g und 4'C gesammelt.
Der Zentrihigationsbodensatz wurde suspendiert in 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 bei 4°C Die Suspension wurde sodann versetzt mit dem gleichen Volumen 80%igem Phenol, das zuvor ins Gleichgewicht gebracht worden war im gleichen Puffer, der jedoch zusätzlich 0,5% Natriutndodecylsulfat und 0,001 M-Äthylendiamintetraessigsäure in Form des Dinatriumsalzes enthielt Das erhaltene Gemisch wurde sodann 10 Minuten lang unter kräftigem Rühren auf 65° C gebracht und anschließend auf 4° C abgekühlt Die wäßrige Phase wurde sodann abgehoben und erneut unter den gleichen Bedingungen mit Phenol extrahiert
Die dabei erhaltenen beiden neuen Phasen wurden getrennt durch 5 Minuten langes Zentrifugieren bei 10 000 g bei 4°C 4/5 der wäßrigen Phase wurden vorsichtig abgehoben und dreimal mit einem Volumen Äther 3 Minuten lang bei Raumtemperatur extrahiert, um das restliche Phenol zu entfernen.
Der restliche Äther wurde durch Einleiten von W Stickstoff verjagt und die RNS wurde durch Zugabe von
2 Volumen 95%igem Äthanol bei 20° C während 4
Stunden ausgefällt, worauf die wäßrige Phase auf einen Gehalt von 0,1 M-NaCI eingestellt wurde. Die erhaltene Suspension wurde 10 Minuten lang bei
10 000 g zentrifugiert und der Bodensatz an RNS wurde in einem 0,01 M-Phosphatpuffer von pH 7,1 bei 4°C
gelöst Auf diese Weise wurde die Ribosomen-RNS erhalten, die zur erfindungsgemäßen Herstellung der
Vaccine durch Kombination mit den Membranlipopoly-
sacchariden und -polysacchariden verwendbar ist
Herstellung der Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide
Der zur Herstellung der Membranlipopolysaccharide
und -polysaccharide bestimmte homogene Bakterienbrei wurde in gleicher Weise hergestellt wie derjenige, der, wie oben beschrieben, zur Herstellung der Ribosomen-RNS Verwendung findet. Der homogene Zellbrei wurde sodann so wie oben 15 Minuten lang bei
2500 UpM bei 4° C zentrifugiert Der Überstand wurde mit 5 μg/ml Desoxyribonuclease versetzt und 30 Minuten lang bei 15°C inkubiert. Die Membranen wurden sodann sedimentiert durch Zentrifugieren bei einer Beschleunigung in der Größenordnung von 30 bis 40 000 g bei 4° C.
Der auf diese Weise erhaltene Bodensatz wu>-de in destilliertem Wasser von 65° C suspendiert und danach bei der gleichen Temperatur mit einem gleichen Volumen einer 90%igen Phenollösung versetzt.
Es wurde 5 Minuten lang kräftig gerührt und
anschließend rasch auf 4° C abgekühlt Die beiden
Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 3000UpM
während 30 Minuten getrennt
Die wäßrige Phase wurde vorsichtig abgehoben und
danach gegen fließendes Wasser bis zur Entfernung des Phenols dialysiert Das innere Dialysat enthielt die Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide, die
im PatentanSDruch definierten Oemisrh mit rlpn wip
oben beschrieben hergestellten Ribosomen-Ribonucleinsäuren des Vaccin gemäß der Erfindung ergeben.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Vaccine sind als Arzneimittel selbstverständlich sowohl für die Humanais auch für die Veterinärmedizin verwendbar und können in jeder beliebigen üblichen bekannten Form für Vaccinzubereitungen vorliegen, insbesondere in Form von Trockenaerosolen, injizierbaren lyophilisierten Ampullen, Suppositorien, Tabletten oder gelüberzogenen Kapseln.

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen auf Ribonucleinsäurebasis, dadurch gekennzeichnet, aaß man pro 100 Gewichtsteile Ribonucleinsäure des oder der dem Vaccin entsprechenden Mikroorganismen zwischen 100 und 200 Gewichtsteile aus Bakterien extrahierte Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide miteinander vermischt
DE2613943A 1975-04-02 1976-04-01 Herstellung von Vaeeinen auf Ribonucleinsäurebasis Expired DE2613943C3 (de)

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