DE1492243B2

DE1492243B2 - Injizierbare Impfstoffe

Info

Publication number: DE1492243B2
Application number: DE1492243A
Authority: DE
Inventors: David Dr. London Gall
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1963-10-01
Filing date: 1964-09-28
Publication date: 1978-12-21
Also published as: FR3941M; DE1492243A1; BR6463076D0; FR1575506A; DE1492243C3; GB1089767A; US3429966A

Description

A—

CH₃

—A

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in der A den Octadecyl-Rest und R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten, als Adjuvantien.

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Diese Erfindung betrifft den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand.

Injizierbare Impfstoffe sind Zubereitungen von Antigenmaterial, die nach ihrer Verabreichung in dem Empfänger eine Immunität gegenüber Infektion oder Intoxikation durch ein gegebenes infizierendes Mittel hervorrufen. Injizierbare Impfstoffe können von Viren, Rickettsien, Bakterien, Protozoen und Metazoen erhalten werden. Inaktivierte, injizierbare Impfstoffe können sterile Suspensionen von abgetöteten Organismen oder von Toxoiden oder anderem antigenen, von Organismen herrührenden Material sein. Injizierbare Impfstoffe können entweder einfache Impfstoffe, hergestellt von einer einzigen Spezies oder Varietät eines Organismus, oder gemischte Impfstoffe sein, welche zwei oder mehrere einfache Impfstoffe enthalten. Obgleich die Herstellungsverfahren in Abhängigkeit von den Impfstoffen variieren, werden sie in einer solchen Weise hergestellt, daß das Antigenmaterial nicht zerstört wird. Die Endprodukte werden unter aseptischen Bedingungen in sterile Behälter abgefüllt, welche dann zum Ausschluß von verunreinigenden Mikroorganismen luftdicht verschlossen werden. Den sterilen und inaktivierten Impfstoffen kann ein pharmazeutisch verträgliches Bakteriostatikum zugegeben werden, besonders für die Lieferung von injizierbaren Impfstoffen in Behältern, die so verschlossen sind, daß sie die wiederholte Entnahme erlauben. w

Adjuvantien werden zur Steigerung der Fähigkeit des Antigenmaterials verwendet, in einem Impfstoff die gewünschte Immunitätsanregung zu veranlassen, und bei vielen, nur schwach antigenen Materialien hängt der Erfolg von der Anwesenheit eines geeigneten Adjuvans in dem Impfstoff ab. Das Adjuvans wird dem Impfstoff in geeigneter Weise zugesetzt, bevor dieser in Behälter abgefüllt wird, obwohl man es auch getrennt aufbewahren und mit dem antigen Material erst unmittelbar vor der Verabreichung durch Injektion mischen kann.

Aus der FR-PS Med. 287 ist eine Aktivierung von Impfstoffen mit Hexadecylamin bekannt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nun darin, injizierbare Impfstoffe aus Antigenmaterial, Adjuvantien und gegebenenfalls weiteren üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zu schaffen, die den bisher bekannten in ihrer Immunitätsanregung überlegen sind.

Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen injizierbaren Impfstoffe gemäß dem obigen Anspruch vorteilhaft gelöst.

Dioctadecylmethylamin und Salze der allgemeinen Formel gemäß Anspruch sind wirksamere Adjuvantien für injizierbare Impfstoffe als solche von ähnlicher Struktur mit kleineren aliphatischen Resten oder nur einem höheren aliphatischen Rest.

Die Natur des Anions in den Salzen der organischen Basen der allgemeinen Formel gemäß Anspruch ist von geringerer Bedeutung, vorausgesetzt, daß das Anion pharmazeutisch verträglich ist und das Salz pahrmazeutisch verträgliche, physikalische Eigenschaften aufweist.

Dioctadecylmethylamin und die Salze der allgemeinen Formel gemäß Anspruch werden einfacherweise in Form von Lösungen, Dispersionen oder Suspensionen in einem flüssigen Trägerstoff verwendet. Die Materialien sind im allgemeinen in Wasser nicht uneingeschränkt löslich, obgleich sie in vielen Kohlenwasserstoffen und anderen organischen Lösungsmitteln löslich sind.

Dioctadecylmethylamin, sowie die Salze der allgemeinen Formel gemäß Anspruch und die diesen Salzen zugrunde liegenden Basen können nach den üblichen chemischen Verfahren für die Herstellung von Aminen \ und ihrer Salze erhalten werden.

Ein im Handel erhältliches Präparat, welches für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann, enthält Kationen der allgemeinen Formel

[A-N(CH₃J₂-A]+

als Chlorid (75%), zusammen mit Natriumchlorid (0,5%), Propan-2-ol (18%) und Wasser (6,5%), wobei die höheren aliphatischen Gruppen A 24% Hexadecyl, 75% Octadecyl und 1% Octadecenyl umfassen. Diese Mischung wird in den Beispielen 1 bis 8 als Adjuvans gemäß Erfindung eingesetzt und dort als »Handelspräparat« bezeichnet

Das Dioctadecylmethylamin oder ein Salz der allgemeinen Formel gemäß Ansprch wird mit dem antigenen Material zur Bildung eines injizierbaren Impfstoffes gemischt Die erforderlichen relativen Mengen an Adjuvans und antigenem Material hängen von den immunologischen Eigenschaften des Antigens ab, und die von beiden pro Dosis erforderliche Gesamtmenge kann ferner noch in gewissem Ausmaß ( von der Spezies und der Größe des Empfängers und der Natur der Infektion oder Intoxikation abhängen, gegen welche immunisiert werden soll. Bei kleinen Tieren, wie bei Mäusen und Meerschweinchen, wurde gefunden, daß die Menge an Adjuvans vorzugsweise zwischen 0,01 mg/Dosis und 1 mg/Dosis liegt In jedem Fall ist die zu verwendende Dosis gegenüber dem Empfänger nichttoxisch.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine wässerige Dispersion mit einem Gehalt von ] 1,0 mg/ml an dem oben beschriebenen Handelspräparat wurde durch Erwärmen des Materials auf 70⁰C in einem isotonischen Borat/Succinat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 hergestellt Dieser Puffer enthielt Natriumborat

Na₂B₄O₇ ■ 10 H₂O

(0,9% Gewichtsteile/Volumteile), Bernsteinsäure (0,29% Gewichtsteile/Volumteile) und Natriumchlorid (0,75% Gewichtsteile/Volumteile).

Diphtherie- Formol-Toxoid, hergestellt durch Behandeln von gereinigtem Diphtherie-Toxin mit wässerigem

Formaldehyd, wurde in dem isotonischen Borat/Succinat Puffer vom pH-Wert von 7,5 bis auf eine Konzentration von 10 Ausflockungsäquivalenten (lQLf)/ml verdünnt. Hierbei ist ein Wert von 1 Lf/ml einer Ausflockung in vitro von 1 Antitoxineinheit äquivalent. Zu dieser Lösung wurde ein gleiches Volumen einer Dispersion des oben beschriebenen Handelspräparates zur Herstellung eines injizierbaren Diphtherie-Impfstoffes zugegeben.

Die Wirksamkeit des Impfstoffes wurde durch Injektion desselben an Gruppen von 5 Meerschweinchen und anschließender Bewertung des induzierten Antikörper-Titers nachgewiesen. Jedem Meerschweinchen wurden subkutan zwei Dosen zu 0,2 ml Impfstoff im Abstand von 28 Tagen injiziert 10 Tage nach der zweiten Injektion wurde den Meerschweinchen Blut entnommen und der Antikörper-Titer gegen Diphtherie nach dem Meerschweinchen-Intrakutan-Test nach Römer und Sames (Z. Immun. Forsch, 3, 344, 1909), modifiziert-von G1 e η η y und Llewellyn — Jones (J. Path. Bact, 34,143,1931), festgestellt In diesem Test wird der antitoxische Titer aus der Serummenge bestimmt, die erforderlich ist, die Wirkung einer festgesetzten Toxindosis in der Haut zu neutralisieren, im Vergleich zu der Menge einer standardisierten Diphtherie-Antitoxin-Zubereitung, deren antitoxischer Titer aus einer früheren Standardisierung bekannt ist. Die Dosis an Antikörperzubereitung, die zum Schutz der Meerschweinchen gegen die Wirkung einer bestimmten Dosis Diphtherie-Toxin erforderlich war, wurde mit der Dosis einer Standard-Zubereitung von Diphtherie-Antitoxin verglichen, welche zur Erreichung des gleichen Schutzes erforderlich war. Der mittlere Antikörper-Titer betrug 13 Einheiten/ml, im Vergleich zu einem Titer von weniger als 0,001 Einheiten/ml, welcher mit Diphtherie-Toxoid ohne Hilfsmittel erhalten wurde. Bei sonst gleichen Versuchsbedingungen wurde mit dem aus der FR-PS Med. 287 als Adjuvans bekannten Hexadecylamin ein Antikörper-Titer von nur 4,4 Einheiten pro ml gefunden.

Beispiel 2

Eine wässerige Dispersion mit einem Gehalt von 1,0 mg/ml an dem oben beschriebenen Handelspräparat wurde durch Erwärmen des Materials auf 70⁰C in einem isotonischen Borat-Puffer mit einem pH-Wert von 8,2 hergestellt. Dieser Puffer enthielt Natriumborat

Na₂B₄O₇ · 10 H₂O

(0,30 Gewichtsteile/Volumteile), Borsäure (0,44% Gewichtsteile/Volumteile) und Natriumchlorid (0,76% Gewichtsteile/Volumteile).

Tetanus-Toxoid wurde in dem isotonischen Borat-Puffer vom pH-Wert 8,2 auf 0,5 Lf/ml verdünnt. Zu dieser Lösung wurde als Adjuvans ein gleiches Volumen des oben beschriebenen Handelspräparates in Form einer Dispersion zur Herstellung eines injizierbaren Tetanus-Impfstoffes zugegeben.

Die Wirksamkeit des Impfstoffes wurde bei Meerschweinchen nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren nachgewiesen. Der Antikörper-Titer gegen Tetanus wurde durch den Mäuse-Subkutan-Test in analoger Weise zu dem Verfahren von Beispiel 1 bestimmt Der mittlere Antikörper-Titer betrug 2,0 Einheiten/ml, im Vergleich zu einem Titer von weniger als 0,01 Einheiten/ml, welcher mit Tetanus-Toxoid ohne Adjuvans erhalten wurde. Bei einem ähnlichen Versuch, bei welchem man den Impfstoff an Meerschweinchen

verabreichte, betrug der mittlere Antikörper-Titer 4,75 im Vergleich zu einem Titer 'von weniger als 0,05 Einheiten/ml, welcher mit einem Tetanus-Toxoid ohne Adjuvans erhalten wurde, und einem'. Titer von .0,05 Einheiten/ml, welcher mit einem Impfstoff erhalten wurde, welcher N.N.N-Trimethyl-N-octadecylammoniumchlorid (50%'ige Lösung), anstelle der gleichen Menge des oben beschriebenen Handelspräparates enthielt.

Beispiel 3

Kulturfiltrate von Clostridium perfringens Typ D (ein Stamm, der bei Schafen die »pulpy kidney«-Erkrankung verursacht), welche zur Produktion einer hohen Konzentration an Epsilon-Tpxin gezüchtet worden waren, wurden mit Formaldehyd zur Umwandlung des Toxins in das Toxoid behandelt. Das Filtrat wurde so verdünnt, daß ungefähr 150 Einheitsäquivalente an Epsilon-Toxoid pro Dosis erhalten wurden. Das oben beschriebene Handelspräparat wurde in dem verdünnten Impfstoff zur Erzielung einer Konzentration von 0,10 mg/Dosis und Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung gegen Enterotoxaemia durch Clostridium perfringens Typ D, dispergiert. Als Bakteripstatikum wurde Natrium-o-(äthylmercurithio)-benzoat in einer Menge von 0,01 % Gewichtsteile/Volumteile zugesetzt

Beispiel 4

Eine wässerige Dispersion mit einem, Gehalt von

so 1,33 mg/ml an oben beschriebenem Handelspräpärat wurde durch Erwärmen des Materials auf 55° C in einem isotonischen Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 73 hergestellt. Dieser Puffer enthielt Kaliumdihydrogenphosphat (0,27% Gewichtsteile/Volumteile) und

Natriumchlorid (0,68%), und war mit 1 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,3 gebracht und sterilisiert worden.

Eine antigene Zubereitung, welche gegen die »louping«-Krankheit (eine bei Schafen auftretende Encephalitis, die durch einen von Zecken übertragenen Virus verursacht wird) immunisiert, wurde durch intracerebrales Infizieren von Schafen mit »louping«- Viren, Entfernen von Hirn, Rückenmark und Milz 4,5 Tage später, Homogenisieren und Zentrifugieren und 14tägige Behandlung der oben schwimmenden Schicht mit 0,10% Gewichtsteile/Volumteile Formaldehyd, hergestellt Die erhaltene inaktivierte Viruszubereitung wurde mit der 20fachen Menge isotonischem Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,3) verdünnt und mit einem gleichen

so Volumen der Dispersion des oben beschriebenen Handelspräparates gemischt. Der erhaltene Impfstoff gegen die »louping«-Krankheit wurde 48 Stunden lang stehengelassen und dann in 20-ml-Anteilen in Vielfachdosis-Behälter abgefüllt, wobei 0,01% Gewichtsteile/ Volumteile Natrium-o-(äthylmercurithio)-benzoat als Bakteriostatikum zugegeben wurde. Es war eine Immunisierungsdosis von 2.0 ml erforderlich.

Beispiels

Leishmania enriettii (eine Protozoen-Spezies, welche bei Meerschweinchen Leishmaniasis verursacht) wurden in der leptomonaden Form in Glucose-Salzlösung-Oberschichtnähragar, welches 20% defibriniertes Pferdeblut enthielt, gezüchtet Die Flagellaten wurden von dem Kulturmedium abgenommen, gewaschen und in Glucose-Salzlösung (10⁸⁰ZmI) erneut suspendiert. Die Suspension wurde dann rasch eingefroren und dreimal zur Abtötung der Flagellaten aufgetaut Die erhaltene

IO

Antigenzubereitung wurde mit dem gleichen Volumen einer wässerigen Dispersion des oben beschriebenen Handelspräparates (5,0 mg/ml) zur Herstellung eines Leishmaniasis-Impfstoffes gemischt.

Dieser Impfstoff schützte Meerschweinchen bei Verabreichung von zwei Dosen von 0,2 ml im Abstand von zwei Wochen gegen Infektion durch Leptomonaden von Leishmania enriettii. .'■·"■:

Beispiel 6

Aus Leptomonaden aus Leishmania tropica major (verantwortlich für die Orientbeulenkrankheit beim Menschen) wurde ein Impfstoff unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens hergestellt

Die Wirksamkeit dieses Impfstoffes wurde an mit Leptomonaden Leishmania tropica major befallenen Mäusen nachgewiesen.

Beispiel 7

Aus Trypänosomen, welche man aus dem Blut von hochgradig mit Trypanosoma congolense, Stamm NIMR (einer Spezies, welche Erkrankung bei Vieh verursacht) infizierten Mäusen abgetrennt hatte, wurde ein Antigen hergestellt. Ein Agglutinierungsmittel (geeigneterweise ein Antiserum gegen die roten Blutkörperchen der Maus oder ein Phytohaemagglutinin) wurde dem Blut zugegeben, um die Erythrozyten zu agglutinieren. Viele Trypanosomen verblieben in der überstehenden Lösung und mehr wurden durch Waschen der agglutinierten Erythrozyten mit kalter Glucose-Salzlösung gesammelt. Die Trypanosomen wurden gewaschen und in kalter Glucose-Salzlösung (10⁸⁰ Trypanosomen/ml) erneut suspendiert. Die Suspension wurde rasch (unter Verwendung einer Alkohol/Trockeneismischung) eingefroren und dreimal aufgetaut, um die Trypanosomen abzutöten. Die erhaltene Antigenzubereitung wurde bei — 20⁰C bis zur Verwendung gelagert. Durch Mischen der Antigenzubereitung mit einem gleichen Volumen einer wässerigen Dispersion des oben beschriebenen Handelspräpärates (5,0 mg/ml) wurde ein injizierbarer Tripanosomiasis-Impfstoffhergestellt. :ί π ;>; /,

Dieser Impfstoff schützte Mäuse bei Verabreichung in zwei Dosen von 0,2 ml im Abstand von 2 Wochen zwei Wochen später gegen Befall mit Trypanosomen von Trypanosoma congolense, Stamm NIMR.

Beispiel 8

Das Antigen wurde aus Trypanosomen hergestellt, erhalten aus dem Blut von Mäusen, welche' mit Trypanosoma cruzi, Stamm Y (verantwortlich für die Chagaskrankheit beim Menschen) infiziert worden waren, wobei das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren angewandt wurde. Die Parasitaemia bei Mäusen mit Trypanosoma cruzi ist viel schwächer als mit Trypanosoma congolense, und es wurde viel weniger Antigen erhalten. Die Antigenzubereitung, welche 10⁶·⁸ abgetötete Trypanosomen/ml enthielt,, wurde mit einem gleichen Volumen einer wässerigen Dispersion des oben beschriebenen Handelspräparates (5,0 mg/ml) zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Chagaskrankheit gemischt.

Dieser Impfstoff schützte Mäuse, denen er in zwei Dosen, jede zu 0,2 ml im Abstand von 2 Wochen injiziert worden war, zwei Wochen später gegen Befall mit Trypanosomen von Trypanosoma cruzi, Stamm Y.

Beispiel 9

Es wurde eine wässerige Suspension von N-Methyl-Ν,Ν-diocta-decylamin, welche 1,0 mg/ml eines isotonischen Borat/Succinat-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5 enthielt, hergestellt und einem gleichen Volumen von | Diphtherie-Toxoid-Lösung (10 Lf/ml), wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Herstellung eines Diphtherie-Impfstoffes zugegeben.

Bei Untersuchungen mit Meerschweinchen induzierte dieser Impfstoff einen mittleren Titer von 8,7 Einheiten/ml an Diphtherie-Antitoxin.

Claims

Patentanspruch:

Injizierbare Impfstoffe, bestehend aus Antigenmaterial, Adjuvantien und gegebenenfalls weiteren üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Dioctadecylmethylamin oder einem Salz der Formel