Verfahren zur Herstellung eines avirulenten Antitumorpräparates aus Streptococcus hemolyticus
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Präparates, das Streptococcus hemolyticus enthält, und im besonderen auf die Herstellung eines Präparates, das avirulent ist und zur Behandlung und Hemmung von Tumorbildungen nützlich ist.
Es war bereits bekannt, dass Arten von Streptococcus hemolyticus (auch Streptococcus pyogenes genannt) Antitumorwirkung aufweisen, aber es war gefährlich, einen solchen lebenden Mikroorganismus als ein Antitumormittel anzuwenden, da durch diese die gleichen Zustände wie durch Erysipelas verursacht werden. Um diesen Nachteil des pathogenen Effekts zu überwinden, wurde vorgeschlagen, den Mikroorganismus in seiner abgetöteten Form oder in Form des zellenfreien Extraktes anzuwenden. Die so erhaltenen Präparate haben sich jedoch als unbefriedigend erwiesen.
Wir haben früher schon gefunden, dass die Antitumorwirksamkeit der Zellen von Streptococcus hemolyticus in enger und umgekehrter Beziehung zur Fähigkeit Streptolysin S zu bilden steht, dass seine Antitumorwirksamkeit durch Kultivieren des Mikroorganismus in einem Medium, das Ribonucleinsäure (hier in der Folge RNA genannt) oder Ribonucleasekern, Bernheimer, A. W. und Rodbardt, M: J. Exp. Med. 88, 149 (1948); Fujimura, A.: Ann. Rep. Tbc.
(Kanazawa), 21, 97 (1963); The Japanese Journ. of. Exp.
Medicine, Band 35, Nr. 4, Seiten 249-254, 1965; (hier in der Folge RNC) enthält, erhöht wird und dass eine weitere Erhöhung der Antitumorwirksamkeit resultiert, wenn die durch Kultivieren erhaltenen Zellen in einem Suspensionsmedium unter Zusatz von Penicillin bei 30-38 C inkubiert wurden. Jedoch ist das auf diese Weise erhaltene Produkt noch nicht ganz zufriedenstellend.
Deshalb haben wir diese Forschungen fortgesetzt, um ein befriedigendes Präparat zu erhalten, und haben gefunden, dass durch nachfolgendes Erhitzen der auf obige Weise erhaltenen Zellen auf 38-50" C Mikroorganismuszellen ohne Virulenz und ohne hämolytische Wirkung und mit stärkerer Antitumorwirksamkeit erhalten werden können.
Die vorliegende Erfindung schafft ein neues Verfahren zur Herstellung eines Präparates, das durch eine neuartige Behandlung der Zellen von Streptococcus hemolyticus erhalten wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung besteht in grossen Zügen im Kultivieren von Streptococcus hemolyticus in einem glucosefreien Kulturmedium, Inkubieren der erhaltenen Mikroorganismuszellen in einem Suspensionsmedium unter Zusatz von Penicillin und Weitererhitzen in diesem Suspensionsmedium.
Die für dieses Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind vorzugsweise Streptococcus hemolyticus ATCC 21059 und ATCC 21060. Als Kulturmedium kann z.B. eine glucosefreie Fleischbrühe, die vorzugsweise etwa 0,5-1 Gewichtsprozent pro Volumen RNA oder RNC enthält, verwendet werden. An Stelle von Fleischbrühe können auch andere natürliche oder halbsynthetische Media zum Kultivieren verwendet werden, aber es darf diesen keine Glucose zugesetzt werden, da deren Anwesenheit die Antitumorwirksamkeit wesentlich herabsetzt.
Die Penicillinkonzentration im Suspensionsmedium soll von 27 000 bis 60 000 Einheiten/ ml betragen, und die bevorzugte Inkubationstemperatur der Suspensionsmischung liegt bei 30-38 C. Das Weitererhitzen erfolgt bei 38-50 C. Die bevorzugte Dauer der ersten Inkubation ist 10-30 Minuten und die der letzteren ist 2(3-60 Minuten. Die Kultivierungsdauer der Mikroorganismen beträgt vorzugsweise 13-20 Stunden, je nach der Qualität des Mediums und Menge der eingeimpften Mikroorganismen.
Die nach solchem Kultivieren erhaltenen Mikroorganismen (hier in der Folge Kokken genannt) werden, zum Beispiel durch Zentrifugieren, abgetrennt, und die auf diese Art erhaltenen abgetrennten Kokken werden in einem geeigneten Suspensionsmedium, wie zum Beispiel einer Salzlösung, suspendiert, und zwar vorzugsweise in Bernheimers Grundmedium (hier in der Folge BBM genannt), das eine Lösung vom pH-Wert 6,8-7 ist, hergestellt durch Zusatz von Maltose, KH2PO4 und MgSO4 7H2O zu destilliertem Wasser. Als Suspensionsmedium kann auch eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.
Das Penicillin kann vorgängig zugesetzt werden, das heisst es kann dem vorgängig beschriebenen Suspensionsmedium zu erst erst zugesetzt und die Kokken darauffolgend suspendiert werden, oder es kann auch zur Suspension der Kokken im Suspensionsmedium zugesetzt werden. Die wirksamste Menge von Penicillin ist mehr als 25 000 Einheiten/ml, speziell 27 000 bis 60 000 Einheiten/ml.
Die so erhaltene penicillinhaltige Kokkensuspension wird vorerst bei 30-38 C länger als 10 Minuten, vorzugsweise von 10-30 Minuten, inkubiert und sodann während 20-60 Minuten auf 38-50" C weitererhitzt. Vorallem ergibt eine erste Inkubation bei 37 C während 20 Minuten und ein darauffolgendes Erhitzen während 30 Minuten auf 45" C die besten Resultate.
Gemäss einem solchen Verfahren kann die Antitumorwirksamkeit von Streptococcus hemolyticus erhöht werden, ungeachtet dessen, ob die Kokken virulent oder avirulent sind. Gleichzeitig nimmt die Virulenz der Kokken bedeutend ab, und die Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S verschwindet gänzlich.
Um ein zur Verabreichung geeignetes Präparat zu erhalten, wird die Kokkensuspension nach dem Kultivieren aseptisch gemacht und die so erhaltene aseptische Suspension auf die erwünschte Konzentration verdünnt.
Die folgenden spezifischen Beispiele in Übereinstimmung mit dieser Erfindung sind nur illustrativ und sind nicht als Begrenzung für die Reichweite der Erfindung aufzufassen.
Beispiel 1
Bevorzugte Penicillinkonzentration in einer
Streprokokkensuspension
Die bevorzugte Konzentration von Penicillin in Streptokokkensuspension wurde durch das folgende Vorgehen bestimmt (in vitro-in vivo Antikrebs-Versuche):
Lebende Zellen von Streptococcus hemolyticus ATCC 21 060, herrührend von 100 ml einer 20 stündigen Brühekultur, wurden zweimal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 5 ml BBM suspendiert. Die so erhaltene Originalkokkensuspension wurde in allen Beispielen mit BBM weiter verdünnt, um Suspensionen in Verdünnungen von 1:5 und 1:10 zu erhalten.
Zu 0,5 ml physiologischer Salzlösung von Penicillin G (2-32 x 104 Einheiten/ml) wurden 2,5 ml der 1: 10 verdünnten Kokkensuspension zugesetzt. Die Röhre, die die erhaltene Mischung enthielt, wurde dann während 20 Minuten in ein Bad von 37 C gestellt.
Anderseits wurde die milchige Ascitesflüssigkeit (30 ml) von Mäusen, die 8 Tage alte Ehrlich Ascitestumore trugen, abgesogen und während 5 Minuten bei 1500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die sedimentierten Carcinomzellen wurden einmal mit kalter physiologischer Salzlösung und einmal mit kaltem BBM gewaschen und in BBM wieder suspendiert, so dass diese Suspension 60 x 106 Zellen pro ml enthielt.
1 ml der Krebszellensuspension wurde zu 3 ml einer jeden mit Penicillin vorbehandelten Kokkensuspension zugesetzt und die Mischung während 90 Minuten in ein Bad von 37" C gestellt. Die so inkubierte Suspensionsmischung (penicillinhaltig) wurde zur intraperitonealen Impfung von Mäusen verwendet; 0,5 ml für jede Maus (eine Gruppe: 6 Mäuse).
Tiere, die während der Versuche verendeten, wurden auf die Todesursache untersucht, und Tiere, die 50 Tage nach der Impfung noch lebten, wurden getötet und autopsiert.
Gleichzeitig wurden Kontrollversuche durchgeführt, wofür eine Mischung von 0,5 ml Penicillinlösung (32 x 104 Einheiten/ml), 2,5 ml BBM und 1 ml Krebszellensuspension verwendet wurde. Hier folgen die erhaltenen Resultate:
Tabelle I Erhöhung der Antikrebswirksamkeit von Streptococcus hemolyticus ATCC 21060 durch
Penicillinvorbehandlung im Verhältnis zur Penicillinkonzentration Vorbehandlung von Kokkensuspension während 20 Minuten In vitro-in vivo bei 370 C Antikrebs-Versuche
Verdünnung von Einheiten von Penicillin, enthalten in der Anzahl der Üb erleb enden
Originalkokkensuspension verdünnten Kokkensuspension nach Tagen in BBM (Einh./ml) 10 20 30 40 50
5,4 X 104 6 6 6 6 6::
2,7 X 104 6 6 5 5 5,::
1 :
10 1,3 X 104 6 6 1 1 1
0,7 X 104 6 4 2 1 1
0,3 X 104 6 1 0 -
Kontrolle 5,4 X 104 6 5 1 0 (BBM ohne Kokken) (ohne Penicillin) 6 3 0 -
Die Tiere wurden getötet und autopsiert, ohne dass ein Tumor gefunden wurde.
Wie in der Tabelle I gezeigt, waren Kokkensuspensionen, die mit Penicillin in Konzentrationen über 2,7 > < x 104 10 Ein- heiten/ml vorbehandelt wurden, sehr wirksam zur Verhinderung des Eindringvermögens von Krebszellen in Mäuse. Bei geringeren Konzentrationen von Penicillin als 0,7-1,3 x 104 Einheiten/ml wurde nur 1 Maus von 6 Mäusen vor dem Eindringen der Krebszellen geschützt.
Beispiel 2 Dauer der Präinkubation von Streptococcus hemolyticus
ATCC 21060 in einer penicillinhaltigen BBM Suspension
Die Penicillinkonzentration im Beispiel 1 wurde fixiert 2,7 x 104 Einheiten/ml. Die Antikrebswirksamkeit in Abhängigkeit von der Dauer der Präinkubation wurde durch in vitro-in vivo-Methode geprüft. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle II gezeigt.
Tabelle II
Wirkung der Dauer der Präinkubation auf dieAntikrebswirksamkeit von Streptokokken in Penicillin enthaltender BBM-Suspension Verdünnung der Original- Minuten der Präinkubation bei 370 C In vitro-in vivo kokkensuspension in BBM verd. Kokkensuspension enthält Penicillin Antikrebsversuche (2,7 X 104 Einh./ml) Anzahl der Überlebenden nach Tagen
10 20 30 40 50
0 6 4 3 1 0
10 6 6 6 6 6* 1:5 20 6 6 6 6 6*
40 6 6 6 6 6*
60 6 6 6 6 6*
0 6 6 6 0
10 6 6 6 3 3* 1 :
: 10 20 6 6 6 6 6*
40 6 6 6 6 6*
60 6 6 6 6 5*
BBM Penicillin enthaltend Kontrolle (ohne Kokken) (2,7 X 104 Einh./ml) 6 3 0 - (37 C, 30') Kontrolle (ohne Kokken BBM allein und Penicillin) (370 C, 30') 6
Die Tiere wurden getötet und autopsiert, ohne dass ein Tumor gefunden wurde.
Beispiel 3
In vivo Antikrebswirksamkeit verschiedener Streptokokken
Präparate auf krebstragende Mäuse
Lebende Zellen von Streptococcus hemolyticus, erhalten aus 300 ml einer 20stündigen Kulturbrühe nach zweimaligem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung, wurden in
15 ml BBM suspendiert. Die Originalkokkensuspension wurde mit BBM im Verhältnis 1:5 weiter verdünnt.
i) Zu 30 ml der 1:5 verdünnten Kokkensuspension wurden 6 ml einer Penicillinlösung (16 x 104 Einheiten/ml physiologische Kochsalzlösung) zugesetzt.
ii) Zu 30 ml der 1:5 verdünnten Kokkensuspension wurden 6 ml physiologische Kochsalzlösung zugesetzt.
Je ein Teil davon wurde folgendermassen behandelt: a) Physiologische Kochsalzlösung enthaltende Kokkensuspension wurde während 20 Minuten bei 37 C inkubiert ............................... A b) Physiologische Kochsalzlösung enthaltende Kokkensuspension wurde zuerst während 20 Minuten bei 37 inkubiert und dann während 30 Minuten auf 45 C weiter erhitzt ................................. B c) Penicillin enthaltende Kokkensuspension wurde wäh rend 20 Minuten auf 37 C erhitzt ....... C d) Penicillin enthaltende Kokkensuspension wurde während 20 Minuten bei 37 C inkubiert und dann während 30 Minuten auf 45 C weiter erhitzt .........
D
Kontrollversuche, in welchen krebszellentragenden Mäu sen entweder BBM-physiologische Kochsalzlösung-Mischung oder BBM-Penicillinmischung der folgenden Mischungen verabreicht wurde, wurden parallel durchgeführt.
e) BBM-phys. Kochsalzlösung Mischung während 20
Minuten bei 37 C inkubiert .............. A' f) BBM-phys. Kochsalzlösung Mischung während 20 Minuten bei 370 C inkubiert und während 30 Minuten auf
45 C weiter erhitzt ................... B' g) BBM-Penicillin Mischung 20 Minuten bei 37" C inkubiert ............................ C' h) BBM-Penicillin Mischung während 20 Minuten bei 37 C inkubiert und während 30 Minuten auf 45 C weiter erhitzt ........................... D'
Die Antikrebswirksamkeit wurde durch das folgende Vorgehen bestimmt:
Die milchige Ascitesflüssigkeit, abgesogen aus Mäusen, die 8tägige Ehrlich-Ascitescarcionome trugen, wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf einen ungefähren Krebszellengehalt von 23 x 106 pro ml verdünnt.
Alle Mäuse (eine Gruppe: 6 Mäuse) wurden intraperitoneal mit 0,2 ml der Krebszellensuspension geimpft, und 24 Stunden später wurden 0,5 ml des Versuchspräparates von Streptokokken intraperitoneal injiziert, und die gleiche Dosis wurde während 4 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert.
Tabelle Ill
Vergleichende in vivo Antikrebsversuche mit vier verschiedenen Streptokokkenpräparaten
Serie Art des zur Behandlung von Anzahl der Überlebenden krebstragenden Mäusen verwendeten nach Tagen
Streptokokkenpräparates 10 20 30 40 50
1: 5 verdünnte Kokken- A 6 4 2 2 20 suspension in BBM B 6 5 5 4 3*
C 6 4 2 2 2*
D 6 6 6 6 6*
Kontrolle (ohne Kokken) A' 6 0 - - -
B' 6 0 - - C' 6 0 -
D' 6 0 - -
Die Tiere wurden getötet und autopsiert, ohne dass ein Tumor gefunden wurde.
Aus der Tabelle III kann ersehen werden, dass von den Erhitzen der mit Penicfflin vorbehandelten Kokkensuspension 4 Streptokokkenpräparaten das Präparat D, welches durch hergestellt worden war, als am wirksamsten befunden wurde.
Beispiel 4
Virulenztest mit vier verschiedenen Streptokokkenpräparaten an Tieren
Die ursprüngliche Kokkensuspension in BBM wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt.
Die folgenden vier verschiedenen Streptokokkenpräparate wurden bereitet: a) Kokkensuspension (in BBM) während 20 Minuten bei 37 C inkubiert (Präparat B); b) Kokkensuspension (in BBM) Penicillin enthaltend (2,5 x 104 Einheiten/ml) während 20 Minuten bei 37 C inkubiert (Präparat PC-B); c) Kokkensuspension (in BBM) während 20 Minuten bei 37 C inkubiert und während 30 Minuten auf 45" C weiter erhitzt, (Präparat B45); d) Kokkensuspension (in BBM), Penicillin (2,5 x 104 Einh./ml) enthaltend, während 20 Minuten bei 37 C inkubiert und dann während 30 Minuten bei 45" C weiter erhitzt (PC-B-45 Präparat).
Jedes Präparat wurde serienweise mit BBM verdünnt, und 0,5 ml jeder Verdünnung wurden einer Maus intraperitoneal injiziert (eine Gruppe: 2 Mäuse). Die Resultate bei Anwendung einer fast avirulenten Art (ATCC 21 060), eines Mutantes der virulenten Art (ATCC 21 059), sind die folgenden:
Tabelle IV
Vergleichender Virulenztest mit 4 verschiedenen
Streptokokkenpräparaten der Su Art Anzahl des Mäuse, die innerhalb 24
Stunden an infektion verendeten Streptokokkenpräparat Verdünnung ATCC 21060 unverdünnt* 1 : 2 1: 20 1 : 50 1: 100 B 2 2 0 0 0 PC-B 2 0 0 0 0 B-45 2 2 1 0 0 PC-B-45 0 0 0 0 0 Zwanzigfache Kokkenkonzentration derjenigen der Mutterbrühekultur.
Es kann gesehen werden, dass die Mäuse, die mit 0,5 ml des unverdünnten PC-B-45 intraperitoneal geimpft wurden, überlebten, ohne Streptokokkeninfektion zu zeigen, während Mäuse, die unverdünnte B, PC-B oder B45 erhielten, innerhalb 24 Stunden an Streptokokken-Septicemia verendeten.
Ferner verursachte sowohl 1:2 verdünntes B als auch 1:2 verdünntes B-45 das Verenden von Mäusen durch Infektion.
Bei Anwendung einervirulenten Art ATCC 21 059 wur- den folgende Resultate erhalten:
Tabelle V
Vergleichender Virulenztest mit 4 verschiedenen Streptokokkenpräparaten der Art ATCC 21059 (Anzahl der Mäuse, die an Infektion innerhalb 48 Stunden verendeten)
Streptokokkenpräparat Verdünnung
ATCC 21059 1: 2,000* 1: 2 X 104 l: 2 X 105 l: 2 X 106 1 : 2 X 107 1 : 2X108 l: 1 : 2 > < 100 B 2 2 2 2 0 0 0 PC-B 2 2 2 2 1 0 0 B-45 2 2 2 2 0 0 0 PC-B45 0 0 0 0 0 0 0 * Kokken enthalten in einer 1: 2000 Verdünnung jedes Streptokokkenpräparates entspricht einer Verdünnung von 1 : 100 des Kokkengehaltes in der Mutterbrühekultur.
Wie aus der Tabelle V ersichtlich, trat Tod der Mäuse infolge Infektion bis zu einer Verdünnung von 1:2 000 000 der Präparate B, PC-B und B-45 ein. Im Gegensatz dazu zeigte PC-B-45 selbst bei einer Verdünnung von 1:2 000 keine Virulenz gegen Mäuse.
Als Resultat dieser Versuche ergab Hitzebehandlung des virulenten Präparates PC-B das weitaus weniger virulent
Präparat PC-B-45.
Beispiel 5
Wirkung des Penicillins auf die Fähigkeit der
Streptokokkensuspension [Streptococcus hemolyticus (ATCC 21 060)] Streptolysin S (SLS) zu bilden.
Eine Reihe von Röhren, von denen jede 3 ml einer Mi schung von 2,5 ml Originalkokkensuspension (in BBM) und
0,5 ml Penicillinlösung (24 x 104 Einh./ml) enthielt, und eine Reihe von Kontrollröhren, von denen jede eine Mi schung von 2,5 ml Originalkokkensuspension (in BBM) und 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung enthielten, wurden hergerichtet, und alle Röhren beider Serien wurden während 20 Minuten in ein Bad von 37 C gestellt. Dann wurden zwei Röhren, eine, die die Kokkensuspension mit 4 X 104 Einh./ml Penicillin enthielt, von der ersten Serie, und eine andere mit der Kokkensuspension ohne Penicillin von der zweiten Serie während 30 Minuten in ein Wasserbad gestellt bei bestimmten Temperaturen (0, 37, 45, 56 oder 70 C).
Die zwei
Suspensionsmischungen wurden nach dieser Behandlung den folgenden Versuchsverfahren unterzogen, zur Prüfung der Kokken auf ihre Fähigkeit SLS zu bilden.
1. Abtrennen der Kokken von ihrer vorbehandelten Suspen sion, 2. Suspension der abgesetzten Kokken in verbliebenem
Zellensystemmedium (0,1% RNC BBM), gefolgt von
Inkubation während 2 Stunden bei 370 , 3. Erhalten einer klaren obenstehenden Flüssigkeit durch
Zentrifugieren (3500 r.p.m. 20') der übrigen so inku bierten Zellensuspension,
4. Bestimmung der hämolytischen Wirksamkeit der oben stehenden Flüssigkeit.
Die klare obenstehende Flüssigkeit wurde serienweise mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Zu je 1 ml verdünnter, obenstehender Flüssigkeit wurde 1 ml einer
3 %igen gewaschenen Kaninchen-Erythrocytensuspension zu gesetzt und dies in ein Bad von 37 C während 2 Stunden gestellt. Die hämolytische Wirksamkeit der obenstehenden Flüssigkeit wurde in Einheiten ausgedrückt, worin eine hämolytische Einheit (1 H.U.) die Menge von SLS ist, die graduelles Verschwinden der Hälfte der Erythrocyten (50% Hämolyse) unter diesen Bedingungen bewirkt. Somit wurde der Wert der hämolytischen Einheiten als Kriterium für die Fähigkeit der SLS-Bildung der Streptokokken verwendet.
Das Resultat ist in der Tabelle VI gezeigt.
Tabelle VI
Vorbehandlung der Kokkensuspension
Zur Herstellung der Kokken- Inkubation Einstellen Streptolysin S suspension verwendetes Medium bei 370 C während während 30, bei (H. U./ml)
20' ooc 1,971
20' 370 C 1,318 BBM enthaltend Penicillin 20' 450 C 1 (4 X 104 Einh.lml) 20' 560 C 1
20' 700C 1
20' 0 C 2,457
20' 370 C 2b076 BBM 20' 450C 3,456
20' 560 C 1
20' 700 C 1
Erhitzen während 30 Minuten bei 45" C der in BBM suspendierten Kokken mit einem Penicillingehalt von 4 X 104 Einh./ml bewirkte einen vollständigen Verlust ihrer Fähigkeit SLS zu bilden.
Beispiel 6
Zu 100 ml einer Fleischinfusionsbrühe wurde RNC zugesetzt, um 0,8 % RNC Konzentration im Medium zu beschaffen; das Medium wurde sterilisiert (pH 7,56).
Die 20stündige Brühkultur von Streptococcus hemolyticus ATCC 21 060 wurde in das Medium eingeimpft und während 20 Stunden bei 37 C inkubiert.
Am Ende der Inkubationszeit wurde die Brühenkultur abgekühlt und zentrifugiert, und die abgesetzten Kokken wurden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 5 ml BBM suspendiert, welches aus 675 mg Maltose, 6 ml 20%igem KH2PO4 (mit NaOH auf pH 6,9 eingestellt), 12 ml 2 %ige MgSO4 -7H2O und 66 ml destilliertes Wasser zusammengesetzt ist.
Die so erhaltene Kokkensuspension wurde mit BBM zu einer zehnfach verdünnten Suspension weiter verdünnt, und zu 2,5 ml der verdünnten Kokkensuspension wurden 0,5 ml einer Penicillinlösung zugesetzt, welche separat durch Auflösen von Penicillin G-Kaliumsalz in physiologischer Kochsalzlösung zu einer Konzentration von 16 x 104 Einh./ml hergestellt wurde, und diese Mischung wurde während 20 Minuten bei 37 C inkubiert und dann während 30 Minuten bei 450 C weiter erhitzt.
Zu der so erhaltenen Kokkensuspension wurde 1 ml der gleichen Krebszellensuspension, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, zugesetzt und die Mischung während 60 Minugen bei 37 C inkubiert. Dann wurden 0,5 ml der gemischten Suspension Mäusen intraperitoneal injiziert. 50 Tage nach dem Impfen wurde die Anzahl der Überlebenden festgestellt. Nur eine von 6 Mäusen verendete an Krebs. Die 5 lebenden Mäuse wurden getötet und autopsiert, und es wurde kein Tumor gefunden. In den Kontrollversuchen unter Verwendung von BBM allein und von penicfflinhaltigem BBM verendeten jedoch alle 6 Mäuse innerhalb 35 Tagen nach der Impfung.
Zusätzliche Versuche
1. Herstellung der Proben Probe A:
Eine Zellensuspension wurde wie im Beispiel 3-d) durch erfindungsgemässe Behandlung von Streptokokkenzellen mit Penicillin erhalten.
Probe B:
Streptokokkenzellensuspension in BBM.
Probe C:
Streptokokkenzellensuspension, erhalten durch Behandlung von Streptokokkenzellen in BBM suspendiert, während 20 Minuten bei 37"C und dann während 30 Minuten bei 45 C.
Probe D:
Mischung der Zellensuspension der Probe C mit einer Penicillinlösung in BBM, welch Letztere während 20 Minuten auf 37 C und dann während 30 Minuten auf 45" C erhitzt worden war.
Probe E:
Eine Zellensuspension, erhalten durch Zentrifugieren der Probe A, zwecks Abtrennung der Zellen, zweimaliges Waschen der abgetrennten Zellen mit physiologischer Kochsalzlösung und nachfolgendes Suspendieren der Zellen in BBM.
2. Antitumorversuch
Die Versuche wurden nach dem im Beispiel 3 beschrie benen Verfahren ausgeführt und die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle I Probe Verdünnung Zahl der überlebenden Tiere/Zahl der Versuchstiere (50 Tage nach interperitonealer
Einimpfung des Tumors)
A X 5 6/6
B X 5 2/6
C X5 2/6
D X 5 2/6
E X 5 5/6 Die Anzahl von Streptokokkenzellen wurde in jeder Probe auf den definierten Wert gebracht.
3. Prüfung der Fähigkeit Streptolysin-S zu bilden Die Versuche wurden nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Resultate werden in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Probe Prüfung der Fähigkeit StreptolysinS zu bilden (H. U.*/ml)
A < 1
B 2,340 C 3,510
D 3,370
E < 1 * H. U. bedeutet hämolysierende Einheit.
Die aufgeführten Versuchsresultate lassen den Schluss zu, dass zwischen der Zellensubstanz von Streptococcus hemolyticus und Penicillin eine chemische Reaktion erfolgt ist.