Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Antitumorwirksamkeit und Herabsetzung der pathogenen Wirkung von Streptococcus hemolyticus, und zwar betrifft die Erfindung ein Verfahren, nach welchem eine Suspension lebender Zellen von Streptococcus hemolyticus, mit Antitumorwirksamkeit mit Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder Cycloserin behandelt wird.
Bekanntlich gibt es lebende Streptokokkenzellen, die Antitumorwirksamkeit besitzen, jedoch ist es äusserst gefährlich, lebende Streptokokkenzellen in genügender Menge zur Tumortherapie zu verwenden, da sie Krankheitserreger von Erysipelas u. a. m. sind. Vor kurzem aber wurde berichtet, dass die Pathogenität (dieses Wort umfasst in dieser Beschreibung auch Virulent und Toxizität) abnimmt und die Antitumorwirksamkeit ansteigt, wenn Zellen von Streptococcus hemolyticus mit Antitumorwirksamkeit während kurzer Zeit in einem Medium, das Penicillin in verhältnismässig hoher Konzentration enthält, bei etwa 37 C behandelt werden.
( GANN , Band 55, Seiten 233-236, 1964.) Es ist ebenfalls bekannt, dass ein günstigeres Resultat erzielt werden kann, wenn diese Zellen in einem penicillinhaltigen Medium nach der Behandlung bei etwa 37" C während kurzer Zeit einer Hitzebehandlung bei ungefähr 45" C unterworfen werden.
(The Japanese Journal of Experimental Medicine, Band 36, Seiten 161-174, 1966.)
Durch das Verfahren einer solchen Penicillinbehandlung kann die Antitumorwirksamkeit von Streptococcus hemolyticus gesteigert und die Pathogenität vermindert werden, aber es tritt hier ein Nachteil auf, nämlich dass das nach der oben erwähnten Penicillinbehandlung erhaltene Präparat Patienten, bei denen die Gefahr eines anaphylitischen Penicillinschocks besteht, nicht verabreicht werden kann, und dies ist in letzter Zeit kein geringes Problem, da die Anzahl hypersensitiver Personen zugenommen hat als Ergebnis des raschen Anstiegs der Anwendung von Penicillin für verschiedene Krankheitsarten.
Ausserdem ist zu befürchten, dass infolge der Leichtigkeit, mit welcher Penicillin und Protein einander im allgemeinen in alkalischem Zustand binden, die Verbindung von Penicillinzellen mit Protein eine Steigerung der Antigenität des Penicillin hervorruft, was schwere allergische Reaktionen verursacht.
Die Erfinder haben eine Vielfalt von Substanzen untersucht, um zu ermöglichen, der Tumortherapie Streptococcus hemolyticus zur Verfügung zu stellen, ohne dass die Antigenität der Bakterien in Betracht gezogen werden muss und um ein Präparat ohne diesen Nachteil zu erhalten. Dabei haben sie gefunden, dass nur Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C und Cycloserin verglichen mit Penicillin hervorragend gesteigerte Wirkung der Antitumorwirksamkeit ergeben und eine die Virulenz der Bakterien eliminierende Wirkung besitzen, im Gegensatz zur Tatsache, dass Streptomycin und viele andere Antibiotika und auch Chemotherapeutika dem Streptococcus hemolyticus überhaupt keine Erhöhung der Antitumorwirksamkeit verleihen.
Da ferner Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C und Cycloserin keiner Querallergien mit Penicillin aufweisen, besteht keine Gefahr eines anaphylaktischen Schocks, und eine langfristige, kontinuierliche Verabreichung der nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Präparate ist selbst an Patienten, die gegen Penicillin hypersensitiv sind, möglich.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Entdeckung und betrifft eine Methode zur Behandlung von Streptococcus hemolyticus, die dadurch gekennzeichnet ist, dass Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder Cydoserin sowohl auf eine Suspension lebender Zellen von Streptococcus hemolyticus mit Antitumorwirksamkeit als auch auf entsprechende Präparate, welche die gleichen Bakterien enthalten, zur Einwirkung gebracht werden.
Die Methode zur Behandlung von Streptococcus hemolyticus wird gemäss der vorliegenden Erfindung praktisch folgendermassen durchgeführt: Die Einwirkung der Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder Cycloserin auf Streptococcus hemolyticus wird dadurch erreicht, das eines der genannten Antibiotika einer lebenden Zellensuspension von Streptococcus hemolyticus zugesetzt wird und vorzugsweise durch Erwärmen weiterbehandelt wird.
Die Zellensuspension wird beispielsweise durch Züchten von Streptococcus hemolyticus mit Antitumorwirksamkeit in einem Medium erhalten, das hauptsächlich aus Hefeextrakt besteht, und Suspendieren der abgetrennten Zellen nach einem herkömmlichen Verfahren, zum Beispiel in Bernheimers Grundmedium (Zusammensetzung: 675 mg Maltose, 6 mg einer 20%gen wässrigen Lösung von Kaliumhydrogenphosphat, die mit Natriumhydroxyd auf pH 6,9 bis 7,0 eingestellt wird, 12 ml einer 2 %igen wässrigen Lösung von Magnesiumsulfat-7hydrat, 66 ml destilliertes Wasser; in der Folge BBM abgekürzt). Ein Antibiotikum mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder Cycloserin wird der Suspension in der Regel bis zu einer Endkonzentration von 3 x 10-2 Mol oder mehr pro Liter zugesetzt.
Es ist freilich auch möglich, eines der vorgenannten Antibiotika vorgehend in BBM zu lösen und sodann die lebenden Zellen darin zu suspendieren.
Das Ringsystem des Cephalosporins C, welches den im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbaren Antibiotika gemeinsam ist, entspricht der Formel
EMI1.1
Anstelle des BBM kann als Suspensionsmedium auch eine Salzlösung, zum Beispiel phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, mit guter Wirksamkeit zur Zellensuspension angewendet werden.
Zwecks guter Einwirkung der Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder des Cycloserins ist ein Erwärmen der Suspension auf 30-38 C während 20-60 Minuten vorteilhaft, besonders günstig ist eine Temperatur von 37 C. Im allgemeinen genügt eine Behandlungsdauer von 20 Minuten. Besonders wirksam ist eine weitere Temperaturerhöhung auf 38-50 C, vorzugsweise auf etwa 45" C, und Fortsetzung des Erhitzens während etwa 20-60 Minuten.
Durch diese Behandlung wird die Antitumorwirksamkeit des lebenden Streptococcus hemolyticus gesteigert, verglichen mit derjenigen bei Penicillinbehandlung, während die Pathogenität sinkt. Besonders bei Verwendung von Cephalosporin C wird auch die Fähigkeit der Bildung von Streptolysin S verringert.
Ein so erhaltenes Präparat von Streptococcus hemolyticus kann nach entsprechender Verdünnung in der Tumortherapie angewandt und langfristig und kontinuierlich auch solchen Patienten mit Sicherheit verabreicht werden, welche eine konstitutionell prädisponierte Überempfindlichkeit gegen Penicillin zeigen.
Hier in der Folge werden Beispiel und Versuchsbeispiele der vorliegenden Erfindung aufgeführt.
Beispiel 1
9 g Hefeextrakt (hergestellt von Ebios Yakuhin Kogyo K. K.) werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 10%igem Natriumhydroxyd wird der pH auf 7,0-7,2 gestellt und dann während 60 Minuten auf 100" C erhitzt. Der nach dem Abkühlen gebildete Niederschlag wird abfiltriert, der pH des Filtrates wird mit 10 %igem Natriumhydroxyd nachgestellt, dann wird während 30 Minuten auf 100" C weiter erhitzt und abfiltriert. Das Filtrat wird mit destilliertem Wasser auf 300 ml ergänzt, diese Lösung wird in sterilisierte Kolben gefüllt und bei einem Druck von 1 kg/cm2 während 10 Minuten dampfsterilisiert.
Eine Kulturbrühe von Streptococcus hemolyticus der Art Su, ATCC Nr. 21060 (fast avirulante Art), die vorher während 20 Stunden in 15 ml einer Fleischinfusionsbrühe kultiviert worden war, wird in 300 ml des oben erwähnten Hefeextrakt-Kulturmediums eingeimpft, während 20 Stunden stillstehend bei 37 C kultiviert, darauffolgend wird die Kulturbrühe mit Eis abgeschreckt und zentrifugiert und die erhaltenen Zellen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 15 ml BBM suspendiert. Die Absorbanz dieser Zellensuspension beträgt bei 660 mu 7,80.
Zu 5 ml BBM-Suspension dieser so erhaltenen Zellen wird 1 ml 0,258 M Cephaloridin-physiologische Kochsalzlösung zugesetzt und während 20 Minuten auf 37" C erwärmt, um das Cephaloridin zur Einwirkung zu bringen. Das Resultat des Antitumortestes an der auf diese Weise erhaltenen Streptokokkensuspension wird im Versuch 1 und der Tabelle 1, die hier in der Folge aufgeführt werden, gezeigt.
Beispiel 2
Eine Suspension von Streptococcus hemolyticus der Art Su, ATCC Nr. 21060, auf welche Cephaloridin ähnlich wie in Beispiel 1 zur Einwirkung gebracht wurde, wurde zur weiteren Einwirkung des Cephaloridins während zusätzlichen 30 Minuten auf 45 " C erhitzt. Die so erhaltene Streptokokkensuspension zeigte ein günstigeres Resultat als die in Beispiel 1 erhaltene.
Beispiel 3
30 g Hefeextrakt (hergestellt von Ebios Yakuhin Kogyo K. K.) wurden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 10 %igem Natriumhydroxyd auf pH 7,0-7,2 eingestellt, während 60 Minuten auf 100" C erhitzt und der nach dem Abkühlen entstandene Niederschlag abfiltriert. Dann wurde der pH des Filtrates mit 10 O/oigem Natriumhydroxyd nachgestellt und mit destilliertem Wasser auf eine totale Menge von 1000 ml aufgefüllt, sodann wurde in sterilisierte Kolben abgefüllt und bei einem Druck von 1 kg/cm2 während 10 Minuten dampfsterilisiert.
Eine Kulturbühne von Streptococcus hemolytis der Art Su, ATCC Nr. 21060 (fast avirulente Art), welche vorher während 20 Stunden in 50 ml einer Fleischinfusionsbrühe kultiviert worden war, wurde in 1000 ml des oben aufgeführten Hefeextraktmediums eingeimpft und stillstehend während 14 Stunden bei 37 Q C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde darauffolgend mit Eis abgeschreckt, zentrifugiert und die erhaltenen Zellen wurden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und sodann in 50 ml BBM suspendiert.
Die Absorbanz dieser Zellensuspension beträgt bei 660 mlc 9,7.
Zu 5 ml der so erhaltenen Zellensuspension in BBM wurde 1 ml einer 0,258 M Cycloserin-physiologische Kochsalzlösung zugesetzt und, um das Cycloserin zur Reaktion zu bringen, während 20 Minuten auf 37" C erhitzt. Auf diese Art wird eine Suspension von Streptococcus hemolyticus mit günstiger Antitumorwirksamkeit erhalten.
Beispiel 4
Auf eine Zellensuspension von Streptococcus hemolyticus der Art Su, ATCC Nr. 21060, auf welche Cycloserin in gleicher Weise wie in Beispiel 3 zur Einwirkung gebracht wurde, wird Cycloserin durch Erhitzen während 30 Minuten auf 45" C zur weiteren Einwirkung gebracht und dadurch erhielt man eine Suspension von Streptococcus hemolyticus, die günstigere Antitumorwirksamkeit als die in Beispiel 3 erhaltene aufwies.
Versuchsbeispiel 1 (Antitumortest)
Eine in Beispiel 1 erhaltene, behandelte Zellensuspension wird stufenweise mit BBM von 10- bis 40fach verdünnt und sogleich als eine Zellensuspension von Streptococcus hemo lyticus getestet.
Vergleichsweise wurde in ähnlicher Art mit Penicillin-G Kaliumsulfat oder mit Dihydrostreptomycinsulfat behandelte Zellensuspensionen, eine unbehandelte Zellensuspension und BBM ohne Zellensuspension ebenfalls dem Test unterworfen.
Mäuse-Ascites wurden am 8. Tag nach einer Impfung mit Ehrlichs Ascites-Carcinomzellen gesammelt und diesen nach Abschrecken mit Eis eine kalte physiologische Kochsalzlösung zugesetzt und sodann während 5 Minuten mit 800 bis
1000 U./min. zentrifugiert. Die abgesetzten Carcinomzellen wurden in ähnlicher Weise zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in BBM so suspendiert, dass die Anzahl gezählter Zellen pro ml 6 x 107 betrug. 1 ml dieser
Carcinomzellensuspension wurde mit 3 ml der oben aufgeführten Suspension von Streptococcus hemolyticus vermischt, während 90 Minuten bei 37" C inkubiert, und diese Mischlö sung wurde darauffolgend Mäusen (ddY Art, vom durch schnittlichen Körpergewicht von etwa 20 g) je 0,5 ml intra peritoneal injiziert.
Für jede Gruppe wurden 5 Mäuse ver wendet und das Überleben von Mäusen jeder Gruppe nach der Injektion wurde beobachtet. Das Resultat dieser Beobach tungen wird in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 Suspension von Streptococcus hemolyticus tSberleben von Mäusen Gruppe zugesetzte Konzentration Verdünnungs- nach nach nach nach
Droge wässriger zahl 10 20 30 50 physiologischer Tagen Tagen Tagen Tagen
Kochsalzlösung 1 Cephaloridin 108 mg 10 5/5 5/5 5/5 5/5 (Potenz)/ml 20 5/5 5/5 5/5 5/5 (0,258M) 30 5/5 4/5 4/5 3/5
40 5/5 4/5 2/5 2/5 II Penicillin- 1,6x105 10 5/5 5/5 5/5 5/5
G-Kalium Einheiten/ml 20 5/5 4/5 2/5 2/5 (0,258M) 30 5/5 4/5 1/5 1/5
40 5/5 3/5 1/5 0/5 III Dihydro- 188 mg 10 5/5 1/5 0/5 0/5 streptomycin- (Potenz)/ml 20 5/5 2/5 0/5 0/5 sulfat (0,258M) 30 5/5 2/5 0/5 0/5 IV keine Droge 10 5/5 3/5 1/5 1/5 nur wässrige 20 5/5 2/5 1/5 0/5 physiologische 30 5/5 2/5 0/5 0/5
Kochsalzlösung V Kontrolle 5/5 0/5 0/5 0/5 (BBM ohne
Zellen suspension) Bemerkung
Die Konzentration jeder Droge in der wässrigen physiologischen
Kochsalzlösung war so eingestellt, dass sie einer Penicillin-G-Kaliumkonzentration von 1,6x105 Einheiten/ml äquimolar war. Die Berechnung setzte 1 mg Penicillin-G-Kalium = 1667 Einheiten und 1,6x 105 Einheiten/ml = 0,258 M voraus. Ferner wurde bei der Berechnung des Dihydrcstreptomycin 3/2 Sulfat vorausgesetzt.
Die in der Tabelle 2 gezeigten Resultate wurden von Gruppen zu je 8 Mäusen durch Verwendung einer nach dem Verfahren des Beispiels 2 auf gleiche Art hergestellten Suspension von Streptococcus hemolyticus erhalten.
Tabelle 2 Suspension von Streptococcus hemolyticus Überleben von Mäusen Gruppe angewandte Konzentration Verdünnungs- nach nach nach nach
Droge wässriger zahl 10 20 30 50 physiologischer Tagen Tagen Tagen Tagen
Kochsalzlösung 1 Cephaloridin 108 mg 20 8/8 8/8 8/8 8/8 (Potenz)/ml 40 8/8 8/8 8/8 8/8 (0,258M) 60 8/8 8/8 7/8 7/8
80 8/8 7/8 5/8 5/8 II Penicillin- 1,6x105 20 8/8 8/8 8/8 8/8
G-Kalium Einheiten/ml 40 8/8 8/8 6/8 6/8 (0,258M) 60 8/8 4/8 2/8 2/8
80 8/8 3/8 1/8 1/8 III Kontrolle 8/8 0/8 0/8 0/8 (BBM ohne
Zellensus pension)
Versuchsbeispiel 2 (Antitumortest)
Herstellung der Probe: Die Bakterie wurde nach dem in Beispiel 3 aufgeführten Verfahren kultiviert und die Zellen in BBM suspendiert.
1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung von Cycloserin, Penicillin-G-Kalium oder Dihydrostreptomycinsulfat wurde 5 ml dieser Zellensuspension zugesetzt, wähnend 20 Minuten bei 37 C behandelt, gefolgt von einer weiteren Behandlung durch Hitze während 30 Minuten bei 45" C und dann wurde mit BBM auf das Zweifache, Vierfache und Achtfache verdünnt und diese Suspensionen sogleich für den Antitumorversuch verwendet.
Antitumorversuch: Männlichen Mäusen der Art ddY (vom durchschnittlichen Körpergewicht von etwa 20 g), welchen pro Maus 106 Ehrlichs Ascites Carcinomzellen (Mäuse Ascites am 8. Tag nach dem Einimpfen) intraperitoneal eingeimpft worden waren, wurde die obige die BBM verdünnte Lösung intraperitoneal während 5 Tagen einmal täglich, 0,8 ml pro Maus, injiziert. Pro Gruppe wurden 8 Mäuse verwendet und das Überleben nach Verabreichung der Zellensuspension an Mäuse jeder der Gruppen wurde beobachtet.
Das Resultat dieser Beobachtungen wird in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Suspension von Streptococcus hemolyticus übergeben von Mäusen Gruppe zugesetzte Konzentration Verdünnungs- nach nach nach nach
Droge wässriger zahl 10 20 30 50 physiologischer Tagen Tagen Tagen Tagen
Kochsalzlösung I Cycloserin 26,4 mg x4 8/8 8/8 8/8 8/8 (Potenz)/ml x8 8/8 7/8 5/8 5/8 (0,258M) II Penicillin- 1,6x105 x4 8/8 7/8 6/8 6/8
G-Kalium Einheiten/ml x8 8/8 3/8 2/8 2/8 (0,258M) III Dihydro- 188 mg x4 8/8 2/8 0/8 0/8 streptomycin- (Potenz)/ml x8 8/8 2/8 0/8 0/8 sulfat (0,258M) IV Kontrolle 8/8 0/8 0/8 0/8 (BBM ohne
Zellensus pension) Bemerkung
Die Konzentration jeder Droge in wässriger physiologischer Kochsalz-Lösung wurde äquimolar zu 1,6x105 Einheiten/ml Penicillin-G-Kalium eingestellt. Die Berechnung setzte 1 mg Penicillin-G-Kalium = 1667 Einheiten und 1,6x 105 Einheiten/ml = 0,258 M voraus.
Ferner wurde bei der Berechnung des Dihydrostreptomycinsulfates 3/2 Sulfat vorausgesetzt.
Versuchsbeispiel 3
Ein gleicher Versuch wie in Versuchsbeispiel 2 wurde ausgeführt, indem die Konzentration von Cycloserin in physiologischer Kochsalzlösung auf 26,4 mg/ml und die physiologische Kochsalzlösung von Penicillin-G-Kalium auf die gleiche Gewichtskonzentration eingestellt wurde. Das Resultat wird in der Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Suspension von Streptococcus hemolyticus Überleben von Mäusen Gruppe zugesetzte Konzentration Verdünnungs- nach nach nach nach
Droge physiologischer zahl 10 20 30 50
Kochsalzlösung Tagen Tagen Tagen Tagen I Cycloserin 26,4 mg x4 8/8 8/8 8/8 8/8 (Potenz)/ml x8 8/8 7/8 5/8 5/8 (0,258M) II Penicillin- 4,4x104 x4 8/8 3/8 2/8 1/8
G-Kalium Einheiten/ml x8 8/8 2/8 0/8 0/8 (= 26,4 mg/ml) III Kontrolle 8/8 0/8 0/8 0/8 (BBM ohne
Zellensus pension)
Versuchsbeispiel 4 (Toxizitätstest)
Zu 1 ml einer in derselben Art wie in Beispiel 1 erhaltenen BBM-Suspension von Zellen des Streptococcus hemolyticus der Art Su, ATCC Nr.
21060 (fast avirulente Art) wurde eine physiologische Kochsalzlösung von Cephaloridin oder von Penicillin-G-Kalium in einer Menge von je 0,2 ml zuge setzt und während 20 Minuten auf 37 C und darauffolgend während 30 Minuten auf 45" C erhitzt. 0,1 ml dieser behan delten Lösung wurde subkutan in den Rücken jeder Maus (ddY-Familie, durchschnittliches Körpergewiclft etwa 20 g) injiziert und das Verenden innerhalb 24 Stunden wurde beobachtet. Die bei Verwendung von 10 Mäusen für jede Gruppe erhaltenen Resultate werden in der Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Behandlungsdroge Anzahl der verendeten Mäuse
Cephaloridin 0/10
Penicillin-G-Kalium 0/10 ohne Drogenanwendung 8/10
Versuchsbeispiel 5 (Toxizitätstest)
1 ml BBM-Zellensuspension von Streptococcus hemolyticus der Art Su, ATCC Nr. 21060 (fast avirulente Art), welche auf gleiche Art wie in Beispiel 3 erhalten worden war, wurde mit 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung von Cycloserin oder von Penicillin-G-Kalium von gleicher Konzentration wie in Versuchsbeispiel 2 zugesetzt, während 20 Minuten auf 37 C und darauffolgend während 30 Minuten auf 45"C erhitzt. 0,1 ml der so behandelten Lösung wurde jeder Maus (ddY-Art, durchschnittliches Körpergewicht etwa 20 g) injiziert, und das Verenden innerhalb 7 Tagen wurde beobachtet. Das Resultat unter Verwendung von 10 Mäusen für jede Gruppe wird in der Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Behandlungsdroge Anzahl der verendeten Mäuse Cycloserin 0/10 Penicillin-G-Kalium 0/10 ohne Drogenanwendung 8/10
Versuchsbeispiel 6 (Test der Fähigkeit Streptolysin-S zu bilden)
1 ml Natriumribonucleatlösung (Konzentration 8 %) in BBM wurde 1 ml einer zellenbehandelten Lösung, die in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 4 hergestellt worden war, zugesetzt, während 2 Stunden bei 37 C inkubiert und nach dem Zentrifugieren wurde die hämolytische Wirksamkeit der obenschwimmenden Schicht durch Verwendung roter Kaninchenkorpuskeln nach der herkömmlichen Methode bestimmt.
Das Resultat wird in der Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7 Behandlungsdroge Streptolysin-S-Bildungsfähigkeit Cephaloridin < 1 (Hämolyseneinheit/ml) Peniailin-G-Kalium < 1 (Hämolyseneinheit/ml) ohne Drogenanwendung 2260 (Hämolyseneinheit/ml)
Zwei weitere Versuchsreihen wurden mit den hier in der Folge beschriebenen Proben A-H durchgeführt und die Resultate in den Tabellen la und 2a zusammengefasst.
1. Herstellung der Versuchsproben
Probe A: Zellensuspension, hergestellt nach Beispiel 2.
Probe B: Zellensuspension, hergestellt nach Beispiel 4.
Probe C: Zellensuspension, erhalten durch Suspension der Zellen in Bernheimers Grundmedium.
Probe D: Zellensuspension, erhalten durch Erhitzen der Probe C während 20 Minuten auf 37 C und sodann während 30 Minuten auf 45" C.
Probe E: Mischung der Probe D mit einer Suspension von Cephaloridin in Bernheimers Grundmedium, Inkubieren während 20 Minuten bei 37 C und Erhitzen während 30 Minuten auf 45" C.
Probe F: Mischung, hergestellt wie Probe E, nur unter Ersetzen des Cephaloridins durch Cycloserin.
Probe G: Suspension, erhalten durch Zentrifugieren der Probe A, zwecks Gewinnung der Zellen, Waschen der abgeschiedenen Zellen mit einer kalten physiologischen Salzlösung und Suspendieren der Zellen in Bernheimers Grundmedium.
Probe H: Suspension, erhalten durch das gleiche Verfahren wie in Probe G, unter Verwendung der Probe B.
2. Prüfverfahren
Antitumorversuch: Die Versuche wurden mit Gruppen von je 8 Maulwurfsmäusen (ddY-Art, durchschnittliches Körpergewicht etwa 20 g) durchgeführt. Diese Mäuse wurden mit Ehrlichs Ascitencarcinomzellen (Mäuseasciten, am 8.
Tag nach der Impfung) in einer Menge von 106 pro Maus intraperitoneal geimpft. Die so geimpften Mäuse wurden mit den oben aufgeführten Proben A-H in einer Menge von 0,1 ml pro Maus einmal täglich, während 5 Tagen, intraperitoneal geimpft. Die nach der Impfung überlebenden Tiere wurden beobachtet und die Resultate in die Tabelle la eingetragen.
Versuch zur Bestimmung der Fähigkeit Streptolysin-S zu bilden:
1 ml Natriumnucleatlösung (Konzentration 8%) in Bernheimers Grundmedium wurde zu je 1 ml einer jeden der Proben A zugesetzt, dann während 2 Stunden bei 37 C inkubiert und nach dem Zentrifugieren wurde die hämolytische Wirkung der oberen Flüssigkeitsschicht nach den üblichen Verfahren unter Verwendung roter Blutkörperchen von Kaninchen bestimmt. Die Resultate dieser Versuche werden in der Tabelle 2a aufgeführt.
Tabelle la Probe Verdünnungs- Anzahl überlebender verhXÅaltnis Mäuse (50 Tage nach intraperitonealer
Tumorimpfung) A x4 8/8 B x4 8/8 C x4 3/8 D x4 3/8 E x4 3/8 F x4 7/8 G x4 7/8 H x4 7/8 * Die Anzahl der Kokkenzellen wurde in jeder Probe auf den angegebenen Wert gebracht
Tabelle 2a Probe* Fähigkeit der Bildung von Streptolysin-S A 1 (hämolyt. Einheit/ml) B 1 (hämolyt. Einheit/ml) C 2,280 (hämolyt. Einheit/ml) D 3,870 (hämolyt. Einheit/ml) E 3,240 (hämolyt. Einheit/ml) F 3,460 (hämolyt. Einheit/ml) G 1 (hämolyt. Einheit/ml) H 1 (hämolyt.
Einheit/ml) * Anzahl der Kokkenzellen jeder Probe entspricht dem angegebe nen Wert
Wie aus den Tabellen la und 2a hervorgeht, wird einerseits die Antitumorwirksamkeit der mit einem der Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder Cycloserin behandelten Suspensionen der Zellen von Streptococcus hemolyticus (Proben A, B, G und H) erhöht und deren Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin-S herabgesetzt, während anderseits bei den Zellensuspensionen der Proben C-F diese Eigenschaften unverändert bleiben.
Die aufgeführten Versuchsresultate lassen den Schluss zu, dass zwischen der Zellsubstanz von Streptococcus hemolyticus und einem der Antibiotika mit dem Ringsystem des Cephalosporins C oder auch Cycloserin eine chemische Reaktion erfolgt ist.