DE1617416C - Verfahren zur Herstellung hamolyti scher Streptococcen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung hamolyti scher StreptococcenInfo
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Description
Es ist bekannt, daß die Zellen von hämolytischen Streptococcen die Fähigkeit haben, Streptolysin S
zu bilden, ein Hämolysin mit tumorstatischer Wirkung. Zur Züchtung hämolytischer Streptococcen wurde
bislang ein modifiziertes Todd-Hewitt-Nährmediüm oder häufiger ein Nährmedium aus Rindfleischbrühe
verwendet. Dieses Nährmedium aus Fleischbrühe eignet sich jedoch nicht zur Großproduktion der
Bakterienzellen, weil das Ausgangsmaterial nur in beschränktem Umfang zur Verfugung steht und die
tumorstatische Wirkung der nach diesem Züchtungsverfahren erhaltenen Bakterien verhältnismäßig niedrig
ist und je nach der Qualität des als Ausgangsmaterial verwendeten Rindfleisches die Aktivität
schwankt.
Der in Chemical Abstracts, Bd. 63 (1965), Spalte 3504d bis f, referierte Aufsatz von Okamotoetal
beschreibt die Züchtung hämolytischer Streptococcen in folgenden Kulturmedien:
1. 0,8%ige RNA-Fleischbrühe,
2. 0,8%ige RNasekern-Fleischbrühe,
3. Fleischbrühe,
4. 0,8%ige Glucose-Fleischbrühe und
5. 0,8%ige RNA-0,8%ige Glucose-Fleischbrühe.
Dieser Veröffentlichung ist jedoch zu entnehmen, daß man bei einer Züchtung in 0,8%iger RNA-0,8%iger
Glucose-Fleischbrühe hämolytische Streptococcen erhält, die· ebensowenig wirksam sind wie
die in der Konfrollprobe und in 0,8%iger Glucose-Fleischbrühe gezüchteten Zellen. Die Antitumoraktivität
der Zellen ist erhöht, wenn sie in einem üblichen Pepton-Fleischbrühe-Medium mit 0,8% Hefe-RNA
oder Ribonucleasekernen gezüchtet werden; die Antitumoraktivität der Zellen ist stark vermindert
oder verlorengegangen, wenn sie in dem "Pepton-Fleischbrühe-Medium
mit 0,8% RNA und 0,8% Glucose gezüchtet werden. Daraus folgt, daß die Aktivität der Zellen sehr empfindlich gegen selbst
geringe Änderungen der Zusammensetzung des Nährmediums reagiert.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein für die Großproduktion geeignetes Verfahren zur Herstellung
hämolytischer Streptococcen zu schaffen, die sich ihrerseits zur Herstellung von Streptococcenpräparaten
zur unterstützenden Behandlung maligner Tumoren eignen. Nach diesem Verfahren sollen Zellen
mit höherer Aktivität je Gewichtseinheit erhalten werden, als es bei bisherigen Verfahren in üblichen
Nährmedien der Fall ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung hämolytischer Streptococcen durch Züchtung
in einem Nährmedium vom pH-Wert 7,0 bis 7,4 bei 30 bis 40° C, welches dadurch gekennzeichnet ist,
daß man die Züchtung der hämolytischen Streptococcen in einem aus 3 bis 6% Hefeextrakt oder
Hefeautolysat bestehenden Nährmedium durchführt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können Zellen mit höherer tumorstatischer Aktivität je Gewichtseinheit
erhalten werden als bei der Züchtung z. B. in Fleischbrühe.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Nährmedium wird z. B. durch Auslösung von
Hefeextrakten oder Hefeautolysaten in Wasser, Neutralisation und Erhitzen der Lösung und anschließendes
Filtrieren zur Abtrennung unlöslicher Stoffe hergestellt. Der pH-Wert des Nährmediums hat einen
Wert von 7,0 bis 7,4, und die Konzentration des Hefeextraktes beträgt 3 bis 6%. Bei einer Konzentration
von unterhalb 3% fallt die tumorstatische Aktivität der erhaltenen Bakterienzellen etwas ab. Der Zusatz
anderer Bestandteile zum Nährmedium ist nicht unbedingt erforderlich, jedoch können Nährquellen,
.wie Pepton, oder Extrakte von Fischmehl, Rindfleisch, Pferdefleisch oder Walfleisch, und anorganische Salze,
wie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat oder Natriumbicarbonat, zugesetzt werden. Bessere Ergebnisse
erhält man auch beim Zusatz von Ribonucleinsäure oder Ribonucleasekernen.
Vorteilhaft setzt man als hämolytische Streptococcen den Stamm Streptococcus hemolyticus ATCC
21060 ein.
Im allgemeinen wird die Züchtung so durchgeführt, daß man zunächst die Bakterienzellen in einem Nährmedium
bei 30 bis 40° C, vorzugsweise bei 37° C, vorzüchtet. Zur Vorzüchtung werden z. B. Hefeextrakt-Nährmedium
(vgl. Beispiel 1) oder Fleischbrühe (vgl. Beispiel 1) verwendet. Bei der Verwendung von Hefeextrakt-Nährmedium
zur Vorzüchtung fällt die tumorstatische Aktivität der Bakterienzellen bei längerer
Züchtungsdauer wieder etwas ab, und aus diesem Grunde wird die Züchtung 10 bis 14 Stunden nach
der Bebrütung bei 37°C abgebrochen. Bei der Vorzüchtung in Fleischbrühe kann eine längere Züchtungsdauer geduldet werden. Vorzugsweise läßt man das
bebrütete Medium 12 bis 30 Stunden bei 37° C stehen. In diesem Falle wird kein Abfall der tumorstatischen
Aktivität beobachtet. Die zur Vorzüchtung verwendeten Nährmedien sind nicht auf Hefeextrakt-Nährmedium
und Fleischbrühe beschränkt. Ähnliche Ergebnisse können mit anderen Nährmedien erhalten
werden, wie Fleischextrakt-Pepton-Medium, das Fleischextrakt, Pepton und Natriumchlorid enthält.
Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe abgekühlt, und die Bakterienzellen werden abgeschleudert.
Die erhaltenen Zellen der hämolytischen Steptococcen werden anschließend 10 bis 30 Minuten bei
30 bis 38° C und weitere 20 bis 40 Minuten bei 40 bis
5O0C in geeigneten Nährmedien, z.B. Bernheimers
Basalmedium, die eine Penicillinverbindung enthalten, einer fraktionierten Hitzebehandlung unterworfen,
um ihre Virulenz und Hämolysin bildende Aktivität auszuschalten. Bernheimers Basalmedium (BBM) ist
eine Lösung aus 6 ml einer 67,5 mg Maltose enthaltenden 20%igen Kaliumhydrogenphosphatlösung, die
mit Natriumhydroxyd auf pH 6,9 bis 7,0 eingestellt ist, 12 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung von Magnesiumsulfatheptahydrat
und 66 ml destilliertem Wasser.
In den nachstehenden Beispielen wird die Gewinnung von Zellen hämolytischer Steptococcen mit
erhöhter tumorstatischer Aktivität erläutert und mit bekannten Verfahren verglichen, bei denen die Züchtung
in Fleischbrühe bzw. einem modifizierten Todd-Hewitt-Nährmedium durchgeführt wurde.
Versuchsbeispiel
Herstellung der Proben
Herstellung der Proben
Probe I
Eine Bakterienzellensuspension mit einer Konzentration, die einem Absorptionswert von 7,6 bei 660 πΐμ
entspricht und die durch Suspendieren der im Beispiel 1 erhaltenen Bakterienzellen in 15 ml BBM erhalten
wurde, wird mit BBM weiter auf das 2- bis 4fache verdünnt. Anschließend werden diese verdünnten
Zellensuspensionen mit einer physiologischen Kochsalzlösung von Penicillin G, d. h. Benzylpenicillin,
in einer Menge von 4 · 105 Einheiten/2,5 ml in einer Menge von 3 ml je 15 ml der verdünnten Zellensuspensionen
versetzt, 20 Minuten auf 37° C und anschließend 30 Minuten auf 43° C erhitzt.
Probe II
Eine Bakterienzellensuspension in einer Konzentration, die einem Absorptionswert von 7,8 bei 660 ηΐμ
entspricht und die durch Suspendieren der im Beispiel erhaltenen Bakterienzellen in 15 ml BBM erhalten
wurde, wird auf die gleiche Weise behandelt, wie es für die Probe I beschrieben ist.
Probe III
Eine Bakterienzellensuspension in einer Konzentration, die einem Absorptionswert von 8,4 bei 660 ηΐμ
entspricht und die durch Suspendieren der im Beispiel 3 erhaltenen Bakterienzellen in 15 ml BBM erhalten
wurde, wird auf die gleiche Weise behandelt, wie es für die Probe I beschrieben wurde.
Probe IV
300 ml einer 10 Minuten bei 1 atü sterilisierten Fleischbrühe, die gemäß Beispiel 1 aus Rindfleisch
hergestellt wurde, werden mit einer Vorkultur beimpft, die durch 24stündige Züchtung bei 37° C der Bakterienzellen
im gleichen Nährmedium erhalten wurde. Die Züchtung wird 14 Stunden bei 37° C durchgeführt.
Danach werden die Bakterienzellen abgetrennt. Hierauf werden die Zellen in 15 ml BBM suspendiert. Die
Zellenkonzentration entspricht einem Absorptionswert von 6,2 bei 660 πΐμ. Die erhaltene Zellensuspension
wird dann auf die gleiche Weise behandelt, wie es für die Probe I beschrieben ist.
die durch 24stündige Züchtung der Bakterienzellen bei 37° C in 10 ml des gleichen Nährmediums erhalten
wurde. Das beimpfte Nährmedium wird 14 Stunden bei 37° C kultiviert. Danach werden die Bakterienzellen
abgetrennt und in 15 ml BBM suspendiert. Die Zellenkonzentration entspricht einem Absorptionswert von
10,4 bei 660 πΐμ. Die Zellensuspension wird auf die
gleiche Weise behandelt, wie es für die Herstellung der Probe I beschrieben ist.
Das modifizierte Todd-Hewitt-Nährmedium wird folgendermaßen hergestellt: Frisches Rinderherz wird
nach dem Abtrennen von Fett und Sehnen fein zerkleinert. 500 g des zerkleinerten Rinderherzes werden
mit 11 destilliertem Wasser versetzt und nach 15stündigem Stehen im Kühlschrank und Abfiltrieren 30 Minuten
auf 85° C erhitzt. Ein Liter des Filtrats wird mit
20 g Pepton versetzt und durch Erwärmen gelöst. Danach wird der pH-Wert auf 7,2 eingestellt. Anschließend
werden 2,0 g Natriumchlorid, 2,0 g Natriumbicarbonat, 0,5 g Natriumhydrogenphösphat und
2,0 g Glucose zugegeben. Hierauf wird die Lösung 30 Minuten erhitzt und nach dem Abkühlen filtriert
und in sterilisierte Flaschen abgefüllt. Schließlich wird die Lösung 10 Minuten bei 1 atü dampfsterilisiert.
2. Bestimmung der tumorstatischen Wirkung
Männliche Mäuse des ICR-Stammes mit einem
durchschnittlichen Gewicht von 26 g wurden intraperitoneal mit etwa 4,5 · 106 Ehrlich-Ascites-Tumoren
je Maus injiziert. Die Ascitesfiüssigkeit wurde aus der Bauchhöhle von Mäusen abgezogen, die 6 Tage alte
Ehrlich-Ascites-Tumoren enthielten. Es wurden jeweils 8 Mäuse für eine Versuchsgruppe verwendet und jeweils
0,2 ml Krebszellensuspension injiziert. 24 Stunden später wurde den Versuchstieren 0,2 ml der vorstehend
genannten Proben ebenfalls intraperitoneal injiziert. Die gleiche Dosis wurde an 5 aufeinanderfolgenden
Tagen verabfolgt.-Die Zahl der überlebenden Mäuse wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind
in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.
Probe V
300 ml eines modifizierten Todd-Hewitt-Nährmediums, das auf die nachstehend geschilderte Weise
hergestellt wurde, werden mit einer Vorkultur beimpft,
65
| Ver- | Zahl der überlebenden Mäuse | 10 | nach ' | Tagen | 30 | 50 | |
| dün- | 8 | 7 | 7 | ||||
| Probe | nungs- faktor |
8 | 15 | 20 | 6 | 6 | |
| mit | 5 | 8 | 8 | 8 | 7 | 7 | |
| BBM | 8 | 8 | 8 | 7 | vo- | 6 | |
| τ- | 2 | 8 | 8 | 8 | 7 | 8 | 8 |
| 1 | 4 | 8 | 8 | 8 | 6 | 8 | 8 |
| JT | 2 | 8 | 8 | 8 | 8 | 5 | 5 |
| 11 | 4 | 8 | 8 | 8 | 8 | 3 | 3 |
| 2 | 8 | 6 | 6 | 5 | 1 | 1 | |
| 4 | 8 | 5 | 5 | 3 | 0 | 0 | |
| IV | 2 | 8 | 2 | 1 | |||
| V | 4 | 8 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Kontrollprobe | 2 | 8 | |||||
| [enthält nur Peni | 4 | 0 | 0 | ||||
| cillin G in BBM) | 8 | ||||||
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Zahl der Bakterienzellen und die tumorstatische Aktivität
nicht immer in entsprechender Beziehung stehen und daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Bakterienzellen eine höhere tumorstatische Aktivität je Gewichtseinheit der Bakterienzellen besitzen.
Beispiel 1
Herstellung des Nährmediums aus Fleischbrühe
Herstellung des Nährmediums aus Fleischbrühe
50g Rindfleisch werden nach sorgfältiger Entfernung
von Fett und Sehnen gründlich zerkleinert, danach mit 100 ml destilliertem Wasser versetzt, kräftig geschüttelt
und 15 Stunden im Eisschrank stehengelassen. Hierauf wird das Gemisch etwa 90 Minuten
auf 1000C erhitzt, abkühlen gelassen und filtriert. 100 ml des Filtrates werden mit 1 g Pepton und 0,5 g
Natriumchlorid versetzt und anschließend 30 Minuten auf 1000C erhitzt. Hierauf wird der pH-Wert
auf 7,0 bis 7,2 eingestellt, danach wird die Lösung erneut 30 Minuten auf 1000C erhitzt, nochmals der
pH-Wert eingestellt, filtriert und in 10 ml fassende Reagenzgläser abgefüllt und 10 Minuten bei 1 atü
dampfsterilisiert.
Herstellung eines Nährmediums aus Hefeextrakt
9 g Hefeextrakt werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 10%iger Natronlauge auf pH 7,0 bis 7,2
eingestellt und 60 Minuten auf 1000C erhitzt. Die entstandene
Fällung wird abfiltriert und der pH-Wert des Filtrates mit 10%iger Natronlauge erneut auf
7,0 bis 7,2 eingestellt. Danach wird die Lösung weitere 30 Minuten auf 1000C erhitzt und nochmals filtriert.
Das Filtrat wird mit Wasser auf 300 ml aufgefüllt, dann in sterilisierte Kolben abgefüllt und 10 Minuten
bei 1 atü dampfsterilisiert. r '
Eine Stammkultur von Streptococcus hemolyticus ATCC Nr. 21060, die in Fleischbrühe vorkultiviert
wurde, wird in 10 ml Fleischbrühe überimpft und 24 Stunden bei 37° C stationär kultiviert. Diese Vorkultur
wird in 300 ml des vorgenannten Nährmediums überimpft und 20 Stunden bei 37° C stationär gezüchtet.
Danach wird die Kulturbrühe mit Eis abgekühlt, die Bakterienzellen werden abzentrifugiert und zweimal
mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Man erhält Zellen von Streptococcus hemolyticus
mit hoher tumorstatischer Wirkung.
Eine Stammkultur von Streptococcus hemolyticus ATCC Nr. 21060, die in Fleischbrühe vorkultiviert
wurde, wird auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 in 10 ml eines Hefeextraktmediums überimpft und
24 Stunden bei 37° C stationär kultiviert. Diese Vorkultur wird in 300 ml des gleichen Hefeextraktmediums
überimpft und 14 Stunden bei 37°C stationär kultiviert.
Danach wird die Kulturbrühe mit Eis abgekühlt, die Bakterienzellen werden abgeschleudert und
zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Es werden Bakterienzellen mit hoher tumorstatischer
Aktivität erhalten.
Unter Verwendung von 15 g eines Hefeextraktes werden 300 ml eines Nährmediums hergestellt, und
10 ml eines Vorkulturmediums werden unter Verwendung von 0,5 g des gleichen Extraktes gemäß Beispiel
1 hergestellt. Nach dem Verfahren von Beispie! 2 werden unter Verwendung einer Stammkultur von
Streptococcus hemolyticus ATCC Nr. 21060, die in einer Fleischbrühe kultiviert waren, Bakterienzellen
hoher tumorstatischer Wirkung erhalten.
Beispiel 4
(Vergleichsversuche)
(Vergleichsversuche)
a) Die Herstellung des Nährmediums aus Hefeextrakt erfolgt gemäß Beispiel 1.
b) Die Herstellung des Nährmediums aus Fleischbrühe mit Pepton erfolgt gemäß Beispiel 1.
c) Herstellung von 0,8%iger RNA-Fleischbrühe
(pH 7,5)
5 g Ribonucleinsäure werden in 25 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird 20 Minuten bei 1000C
sterilisiert und danach auf pH 7,2 eingestellt.
15 ml der erhaltenen RNA-Lösung werden mit 300 ml der gemäß b) hergestellten Fleischbrühe mit
Pepton versetzt und 20 Minuten auf 100° C erhitzt.
d) Herstellung von 0,8%iger
RNasekern-Fleischbrühe
RNasekern-Fleischbrühe
5 g Ribonucleasekern (hergestellt nach A. W. B e r η heimer
und M. Rodbart J. Exptl. Medicine 88 [1948], S. 149) werden in 25 ml destilliertem Wasser
gelöst.
Die Lösung wird 20 Minuten bei 1000C sterilisiert
und der pH-Wert auf 7,2 eingestellt.
15 ml der erhaltenen RNasekern-Lösung werden mit 300 ml der gemäß b) hergestellten Pepton-Fleischbrühe
versetzt und 20 Minuten auf 1000C erhitzt.
Züchtung
15 ml einer Stammkultur von Streptococcus hemolyticus ATCC Nr. 21060, die 20 Stunden in Fleischbrühe
vorkultiviert wurde, werden in jeweils 300 ml der genannten Kulturmedien überimpft und 20 Stunden
bei 37°C stationär kultiviert. Danach wird die Kulturbrühe mit Eis abgekühlt, und die Bakterienzellen
werden abzentrifugiert. Die Zellen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen
und in 15 ml Bernheimer-Betzer-Medium (BBM) suspendiert.
Herstellung der Probe
1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung mit 16000 Einheiten des Kaliumsalzes von Penicillin G
werden zu 5 ml der Zellensuspension in BBM gegeben. Die Zellsuspension wird 20 Minuten bei 37° C inkubiert
und dann 30 Minuten auf 45° C erwärmt. Dieses Präparat wird mit Kaliumsalz von Penicillin G
(27 000 Einheiten pro ml) enthaltendem BBM reihenverdünnt. Die Bakterienzellenkonzentration errechnet
sich wie folgt: Absorption einer·verdünnten Lösung bei 660 nm · Verdünnungsverhältnis. Sie beträgt im
Hefeextrakfmedium 8,4, in der peptonhaltigen Fleischbrühe 6,2, in der 0,8%igen RNA-Fleischbrühe 6,8
und in der 0,8%igen RNasekern-Fleischbrühe 6,6.
Die Bestimmung der tumorstatischen Wirkung erfolgte gemäß Beispiel 1. Es wurden jeweils fünf Mäuse
für eine Versuchsgruppe verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die im Hefeextraktmedium gezüchteten Streptococcen sich durch
eine besonders hohe tumorstatische Wirkung auszeichnen.
| Probe | Verdünnung mit penicillinhaltigem BBM |
10 | Zahl der überlebenden Mäuse nach Tagen |
30 |
| 5/5 | 5/5 | |||
| Hefeextrakt-Medium | 1:2 | 5/5 | 5/5 | |
| 1:4 | 5/5 | 4/5 | ||
| 1:8 | 5/5 | 2/5 | ||
| 1:16 | 5/5 | 1/5 | ||
| 1:32 | 5/5 | 3/5 | ||
| Fleischbrühe mit Pepton | 1:2 | 5/5 | 2/5 | |
| 1:4 | 5/5 | 0/5 | ||
| 1:8 | 5/5 | 0/5 | ||
| 1:16 | 4/5 | • 0/5 | ||
| i:32 | 5/5 | 4/5 | ||
| 0,8% RNA-Fleischbrühe | 1:2 | . 5/5 | 3/5 | |
| mit Pepton | 1 :4 | 5/5 | 1/5 | |
| 1:8 | 5/5 | 0/5 | ||
| 1:16 | 5/5 | 0/5 | ||
| 1:32 | 5/5 | 5/5 | ||
| 0,8% RNasekern-Fleisch- | 1:2 | 5/5 | 4/5 | |
| brühe mit Pepton | 1:4 | 5/5 | 2/5 | |
| 1:8 | 5/5 | 1/5 | ||
| 1:16 | 5/5 | 0/5 | ||
| 1:32 | 3/5 | 0/5 | ||
| EControllprobe | penicillinhaltiges | |||
| BBM | ||||
| 20 | ||||
| 5/5 | ||||
| 5/5 | ||||
| 5/5 | ||||
| 4/5 | ||||
| 3/5 | ||||
| 4/5 | ||||
| 3/5 ■ | ||||
| 1/5 | ||||
| 0/5 | ||||
| 0/5 | ||||
| 5/5 | ||||
| 4/5 | ||||
| 2/5 ■ | ||||
| 0/5 | ||||
| 0/5 | ||||
| 5/5 | ||||
| 5/5 | ||||
| 3/5 | ||||
| 2/5 | ||||
| 1/5 | ||||
| 0/5 | ||||
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung hämolytischer Streptococcen durch Züchten in einem Nährmedium
vom pH-Wert 7,0 bis 7,4 bei 30 bis 400C,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung der hämolytischen Streptococcen in
einem aus 3 bis 6°/o Hefeextrakt oder Hel'eautolysat bestehenden Nährmedium durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man dem Nährmedium als Nährquellen Pepton, Fischmehlextrakt, Rindfleischextrakt
oder Walfleischextrakt oder deren Gemisch sowie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat
oder Natriumbicarbonat oder deren Gemisch einverleibt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Ribonucleinsäure
oder Ribonucleasekerne einverleibt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als hämolytische
Streptococcen den Stamm Streptococcus hemolyticus ATCC 21060 einsetzt.
25
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7134766 | 1966-10-31 | ||
| JP7134766 | 1966-10-31 | ||
| DEC0043703 | 1967-10-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1617416A1 DE1617416A1 (de) | 1972-02-17 |
| DE1617416C true DE1617416C (de) | 1973-04-05 |
Family
ID=
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