DE945648C - Verfahren zur Biosynthese von Cyanocobalamin (Vitamin B-Faktor II) - Google Patents

Description

• Verfahren zur Biosynthese von Cyanocohalamin (Vitamin B"-Faktor II) Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Vitamin B12 durch Biosynthese aus dem Vitamin-B"-Faktor I und 5, 6-Dimethylbenzimidazol mit Hilfe von Mikroorganismen.
• Bei allen bisher bekanntgewordenen Verfahren zur Erzeugung von -Vitaminen der B12 Gruppe geht man in der Weise vor, daß man geeignete Mikroorganismen in einem Nährmedium wachsen läßt, wobei sie Vitamin B12 bilden. Solchen Nährmedien werden erforderlichenfalls außer den üblichen Nährstoffen noch Kobaltionen zugesetzt, da diese für den Aufbau des Vitamin-B1,-Moleküls benötigt werden.
• Es wurde nun gefunden, daß man überraschenderweise eine Biosynthese von Vitamin B12 dadurch bewerkstelligen kann, dag man Mikroorganismen in einem Nährmedium wachsen läßt, das den z. B. aus Faulschlamm gewinnbaren Vitamin-Bi,-Faktor I und 5, 6-Dimethylbenzimidazol in geeigneten Konzentrationen enthält.
• Es sind bereits mehrere Faktoren der Vitamin-B12-Gruppe bekannt, die vor allem im Faulschlamm der städtischen Abwässer enthalten sind. Es interessierte von Anfang an die Frage, in welchem verwandtschaftlichen Verhältnis all diese Vitamin-B12 Komponenten zueinander stehen, d. h. welche dieser Komponenten Vorstufen und welche von ihnen Abbauprodukte der fertigen Vitamin-B12-Faktoren darstellen. Unter »fertigen« Vitamin-1312-Faktoren werden hier solche verstanden, die zumindest die volle Wuchsstoffwirkung sowohl gegenüber der E.-coli-Mutante 1i3-3,. als auch gegenüber L. Leichmannü besitzen.
• Die mikrobiologische Aktivität der verschiedenen Vitamin-B1,-Komponenten gegenüber diesen zwei Mikroorganismen ist nämlich unterschiedlich. So besitzen die Vitamin-Bi.-Faktoren II, III und IV die. gleiche Wuchsstoffwirkung gegenüber E.-coli-Mutante 113-3 und L. Leichmannii; der Faktor V besitzt eine sehr geringe Aktivität gegenüber diesen beiden Mikroorganismen; der Faktor I ist aktiv gegenüber E.-coli-Mutante 113-3, jedoch inaktiv gegenüber L. Leichmannü.
• Diese Beobachtungen können vielleicht dadurch erklärt werden, daß erstens die E.-coli-Mutante 113-3 sowie L. Leichmannü die Vitamin-B"-Faktoren II, III und IV in unveränderter Form voll verwerten können, zweitens wohl die E.-coli-Mutante 113-3, nicht aber L. Leichmannü den Faktor I als Vorstufe zum Aufbau eines »fertigen« Vitamin-B12 Faktors (wie z. B. Faktor II, III und IV) verwerten kann, drittens weder die E.-coli-Mutante 113-3 noch L. Leichmannü in der Lage sind, den Faktor V in nennenswertem Umfang in eine der »fertigen« Formen umzuwandeln.
• Im Lichte dieser Auffassung erschien der Vitamin-B12-Faktor I, der sich als identisch mit dem Faktor B von Porter und Mitarbeitern erwies; besonders interessant. Die Annahme, daß dieser Faktor eine Vorstufe der »fertigen« Vitamin-B12 Faktoren darstellt, wurde durch folgende Beobachtungen gestützt.
• i. Der Faktor I besitzt, verglichen mit anderen Vitamin-B12 Faktoren, eine besonders gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und wandert besonders schnell in Chromatogrammen, was für ein niedrigeres Molekulargewicht spricht.
• 2. Der Faktor I besitzt im Plattentest ungefähr die q- bis 7fache Vitamin-B"-Aktivität, verglichen rriit derjenigen des Röhrchentestes (unter Benutzung von Vitamin B12, d. h. Faktor II, als Standard), was ebenfalls für ein niedrigeres Molekulargewicht spricht.
• 3. Der Faktor I scheint keine Nucleotid-Kompo= nente zu besitzen.
• Zur Lösung der Frage, ob und unter welchen Bedingungen gewisse Mikroorganismen den Vitamin-B12-Faktor I in Faktor II (Cyanocobalamin) umwandeln können, wurde die E.-coli-Mutante 113-3 und ein gewöhnlicher E.-coli-Stamm verwendet. Man geht dabei in der Weise vor, daß man z. B. E.-coli in üblicher Weise in einem Medium züchtet, das eine Köhlenstoffquelle, wie z. B. Glukose, und die erforderlichen Nährsalze enthält. Außerdem versetzt man die Nährlösung mit Vitamin-B"-Faktor I. in biologischen Konzentrationen, , also in einer Menge von etwa o, i bis 0,5 Gamma je ccm (gemäß dem E.-coli-Test, unter Zugrundelegung des. Cyanocobalamin-Standards), d.h. io bis 5o Gammaprozent und mit 5, 6-Dimethylbenzimidazol in 3- bis iofachem molarem Überschuß unter Berücksichtigung eines Molekulargewichts von etwa 8oo für den Vitamin-B"-Faktor I. Nach dem Sterilisieren der Nährlösung und Beimpfen läßt man nun bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 7 und optimaler Temperatur, also z. B. 37°, unter submers-aeroben Bedingungen, also unter Schütteln oder Rühren und gleichzeitiger Durchlüftung wachsen. Nach 8 bis 24 Stunden, je nach der Zuckerkonzentration, Ist das Wachstum beendet. Nun wird die Fermentationsbrühe in der üblichen Weise aufgearbeitet und die Vitamin-B,2-Faktoren chromatographisch getrennt. Dabei wird zunächst unveränderter Vitamin-B12 Faktor I eluiert, sodann erscheint eine scharf abgegrenzte Zone, die getrennt aufgefangen wird. Durch Ermittlung des R-Wertes, Verteilungskoeffizienten und Absorptionsspektrums läßt sich beweisen, daß es sich dabei um Cyanocobalamin handelt.
• Über den quantitativen Verlauf der Bildung von Cyanocobalamin aus dem Vitamin-B"-Faktor I und 5, 6-Dimethylbenzimidazöl geben nachfolgende Versuche Aufschluß.
• Es wurden sowohl die E.-coli-Mutante 113-3 als auch ein gewöhnlicher E.-coli-Stamm verwendet. Die Mikroorganismen wurden in einer Modifikation des Davis-Medium in derSchüttelkultur bei 37° 18 Stunden lang gezüchtet. Die Menge an j eweils vorhandenem Vitamin-B" Faktor I und 5, 6-Dimethylbenzimidazol sowie die Versuchsergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle I ersichtlich.
• Der durch die beiden Coli-Stämme synthetisierte Vitamin-B"-Faktor hat das gleiche Absorptionsspektrum wie der Faktor II (Cyanocobalamin). Da auch der R-Wert bei der Zellulose-Chromatographie sowie der Verteilungskoeffizient im Phasensystem n-Butanol/Wasser +Ammonsulfat wie auch die mikrobiologische Aktivität gegen L. Leichmannü identisch sind, ist erwiesen, daß die gebildete Substanz Blz-Faktor II ist.
• Zur näheren Erläuterung der Tabelle I, vor allem des Versuches C, dienen die Abb. i bis 5. Die Abb. i bis q. zeigen den Verlauf der chromatographischen Trennung der in der Kulturlösung enthaltenen Vitamin-B"-Faktoren. Zur Trennung wurden Zellulosesäulen verwendet. Als Entwickler diente wassergesättigter und CN-Ionen enthaltender n-Butylalkohol. Aus den Abb. i bis q. sowie aus der Tabelle I ist zu ersehen, daß aus Versuchen ohne 5, 6-Dimethylbenzimidazol überhaupt kein Cyanocobalamin chromatographisch erfaßt werden kann. In Gegenwart steigender Mengen an 5, 6-Dimethylbenzimidazol werden zunächst steigende Mengen an Faktor II gebildet; bei etwa 12 Gammaprozent an 5, 6-Dimethylbenzimidazol scheint jedoch in diesem Falle das Maximum an Faktor II gebildet zu sein, wie aus der Abb. 5 deutlich ersichtlich ist.

  Tabelle I

  Biosynthese von Vitamin-BR (Faktor II) aus dem Vitamin-B"-Faktor I und 5, 6-Dimethylbenzimidazol

  mit Hilfe von E. coli. Nährmedium und Versuchsbedingungen siehe Text.

  Gehalt Mikrobiologische, Vitamin-B"-Faktoren, mittels präparativer

  Ansatz der Mediums an Aktivität nach der Methoden gefunden

  Vers. Mikro- Vol. Vergärung

  Nr. Organismus in Fak- gegenüber Gebildeter Faktor II

  Verteilun s-

  Liter tor I Precursor* E. co li- L. Leich- Faktor I '

  Y°#o 7°/° ) Mutante mannü R-Wert** in I R Wert g

  #*) koeffizient

  Y°#o Y°#o ) m y I 790

  A E. coli . . . . 5,0 20 0 13 10 o,46 Spur 0,24

  5,0 20 20 18 16 0,46 231 4,6 0,23 24 .

  B E.-coli-

  Mutante-

  113-3 ... 5,0 40 0 36 =o 0,49 höchstens Spuren

  5,0 40 20 28 15 0,53 276 1 5,5 0,23 24

  C E. cOli .... 2,5 10 O 13 x 0,49 nicht feststellbar

  2,2 10 5 13 7 o,46 67 2,7 0,24 24

  2,5 10 10 13 9 0,42 131 5,2 ( 0,25 24

  2,5 10 20 12 10 0,42 147 5,9 I o,26 24

  D E.-coli-

  Mutante

  113--3 --- 2,5 0 0 0 0 0 0

  2,5 0 20 0 O 0 O

  E E. coli .... 2,5 0 0 0 0 1 0

  2,5 O 20 0 0 v 0

  *) 5, 6-Dimethylbenzimidazol.

  '°*) R-Wert auf der Zellulosesäule, Entwickler: wassergesättigtes n-Butanol mit CN-Ionen.

  Verteilungskoeffizient im System n-Butanol/Wasser + Ammonsulfat. Die Zahlen bedeuten Prozente an Ammon-

  sulfat, bei denen der Verteilungskoeffizient x ist. Der Wert 24 ist für das Cyanocobalamin charakteristisch.

  Aus der Tabelle I ist vor allem folgendes zu ersehen: i. Wenn das Nährmedium weder den Vitamin-B12 Faktor I noch 5, 6-Dimethylbenzimidazol enthält, werden keine Vitamin-B,2-Faktoren synthetisiert.
• 2. Wenn das Nährmedium 5, 6-Dimethylbenzimidazol und keinen Vitamin-B,.,-Faktor I enthält, werden gleichfalls keine Vitamin-B12 Faktoren gebildet.
• 3. Wenn das Nährmedium den Vitamin-B1,-Faktor I und kein 5, 6-Dimethylbenzimidazol enthält, wird höchstens eine Spur an Vitamin-B" Faktor 1I gebildet. Dies äußert sich in der Weise, daß die so gewonnene Kulturlösung eine - oft recht beträchtliche - Wuchsstoffwirkung gegenüber L. Leichmannii aufweist. Diese Wuchsstoffwirkung ist zumeist viel stärker, als dies der wirklich vorhandenen Menge an Vitamin-B1,-Faktor II entspräche. Aus solchen Kulturlösungen lassen sich höchstens Spuren an Vitamin-B.2-Faktor II isolieren (vgl. Versuch A).
• 4. Wenn das Nährmedium gleichzeitig den Vitamin-B12-Faktor I und 5, 6-Dirnethylbenzimidazol enthält, so besitzt die vergorene Kulturlösung eine entsprechend hohe L.-Leichmannii-Aktivität, und es lassen sich aus ihr beträchtliche Mengen an Vitamin-B1,-Faktor II isolieren.
• Die Umwandlungsrate von Faktor I in den FaktorII kann noch nicht in exakten Zahlen ausgedrückt werden, da der Faktor I noch nicht in kristallisiertem Zustand erhältlich ist, so daß eine gewichtsmäßige Dosierung schwierig ist. Der Faktor I wird daher grundsätzlich nach seiner biologischen Aktivität gegenüber der E.-coli-Mutante 113-3, oder durch Ausmessung der Extinktion seiner Lösung dosiert.- Dabei muß betont werden, daß die Beziehung seiner biologischen Aktivität bzw. der Extinktion seiner Lösungen zu seinem Trockensubstanzgewicht noch nicht bekannt ist. Infolgedessen können über die in den Versuchen A bis E eingesetzten Gewichtsmengen an Faktor I keine Angaben gemacht werden, und daher kann die Umwandlungsrate noch nicht exakt ermittelt werden.
• Die im Durchschnitt erhaltene Konzentration an synthetisiertem Faktor II im Nährmedium beträgt unter den angeführten Versuchsbedingungen o,o5 Gamma je ccm (5 Gammaprozent). Die zur Umwandlung verwendete niedrigste Konzentration an Faktor I betrug o,= Gamma pro ccm bzw. =o Gammaprozent (E.-coli-Aktivität, gemessen in Cyanocobalamin-Einheiten). Danach wurde etwa die Hälfte der möglichen Um«,andlungsrate@ erzielt.
• In weiterer Fortentwicklung des Verfahrens kann auch so vorgegangen werden, daß der Prozeß kontinuierlich durchgeführt wird, indem zum Wachsen der die Biosynthese vollziehenden Mikroorganismus ein Fermentationsgerät verwendet wird, das mit kontinuierlichem Zu- und Ablauf versehen ist. In diesem Fall kann der ganze Prozeß weitaus rascher durchgeführt werden. Eine weitere Fortentwicklung des Verfahrens besteht darin, daß statt reinem Vitamin-B12 Faktor I ein Rohextrakt verwendet wird, der neben dem Vitamin-B12 Faktor I noch andere Faktoren der Vitamin-B"-Gruppe und sonstige Verunreinigungen enthält.
• Zur Abgrenzung des geschilderten Verfahrens sei noch darauf hingewiesen, daß bisher lediglich bekanntgeworden ist, daß beim Wachstum von E.-coli in einem Vitamin-B12 freien Grundmedium nach Zusatz der »Vitamin-B" Fraktion Ba die geernteten Zellen die @)Vitamin-B" Frä.ktion C« enthielten, zuweilen zusammen mit »Cyano-co-cobalamina (»Vitamin-Blä Fraktion Aa), wie von Ford et a1. (Biochem. J. 52, Proc. VIII, 1952) festgestellt wurde. Um welche Umwandlungsprodukte es sich dabei handeln mag, ist unklar, da die Zusammensetzung der betreffenden Produkte noch nicht bekannt ist. Die Bildung von Vitamin--B"-Faktor II (Cyanocobalamin) wie in dem hier geschilderten Verfahren ist nicht beobachtet worden. Ferner wurde bei den zitierten Versuchen nicht in Gegenwart von $, 6-Dimethylbenzimidazol gearbeitet.
• Das hier beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit, den im Faulschlamm - häufig sehr reichlich -vorkommenden Vitamin-B"-Faktor I durch-Umwandlung in den Antiperniziosa-Wirkstoff nutzbringend zu verwerten. Außerdem fällt das Vitamin-B12 bei diesen Verfahren in sehr reiner Form an, so daß dessen Gewinnung besondere technische Vorteile bietet.
• Die Durchführung des neuen Verfahrens wird durch folgende Beispiele näher erläutert. Beispiel 1 5 1 eines madifizierten Davis-Medium (1,o5 °/o K,HP04, o,q.5°/o KH,P04, 0,0750[o Natriumcitrat, 0,015 °/o Magnesiumsulfat, 0,15 °% Ammonsulfat, 0,3 °% Glukose.), enthaltend 2o Gammaprozent 5, 6-Dimethylbenzimidazol wurden 2o Minuten lang bei 10o° sterilisiert und anschließend mit q.o Gammaprozent Vitamin-B"-Faktor I (in 7o°/oiger alkoholischer Lösung) versetzt. Nach dem Beimpfen mit 5 °/o einer Kultur der E: coli-Mutante 113-3 in Pepton-Fleischextrakt-NaCl (15 Stunden lang bei 37° bebrütet) wurde der ganze Ansatz in einer ausreichenden Anzahl von 300 ccm Erlenmeyerkolben während 18 Stunden bei 37° in üblicher Weise in der Schüttelkultur behandelt: Die Fermentationsbrühe wurde anschließend vereinigt, mit 0,1 °/o Natriumcyanid versetzt, auf pH 6 angesäuert und während 30 Minuten auf 8o° erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 2o° wurde die Brühe mit 1°/o Aktivkohle (z. B. eine unter dem geschützten Handelsnamen Brilonit q.n erhältliche Aktivkohle) geschüttelt. Sodann wurden aus dem mit Hilfe einer Zentrifuge gewonnenen Kohleadsorbat die mit 7o°%igem heißen Äthanol eluiert.
• Die Eluate wurden im Vakuum eingeengt und daraus die Vitamin-B12-Faktoren mit Hilfe einer Lösung von 20 °/o p-Chlorphenol in o-Dichlorbenzol extrahiert. Nach Waschen der p-Chlorphenol-Extrakte - mit Phosphatpuffer vom p$ 7 und mit Wasser wurden sie mit n-Butanol'versetzt und mit Wasser extrahiert, wobei die Vitamine der B12 Gruppe in, die wäßrige Phase übergingen. Die roten wäßrigen Extrakte wurden im Vakuum von Resten an organischen Lösungsmitteln befreit und anschließend mit 10/0 Zellulosepulver versetzt, auf p, 3 angesäuert und mit 2,2% p-Chlorphenol geschüttelt, wobei die gesamten Vitamine der B12 Gruppe sich als p-Chlorphenol-Komplexe an der Zellulose niederschlugen. Nach dem Absaugen wurde der rote Niederschlag mit Aceton versetzt, wodurch der p-Chlorphenol-Komplex zerlegt und die Vitamine der Blz Gruppe an der Zellulose niedergeschlagen wurden. Nach dem Absaugen wurde das die Vitamine der B12 Gruppe enthaltende Zellulosepulver in eine Chiomatographiersäule gebracht. Die Vitamine der B12 Gruppe wurden nun mit einer Mischung von 8o °/o Aceton und 2o °/o Wasser aus der Zellulose eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand in einer kleinen Menge Kieselgur aufgenommen und im Vakuum in Blausäureatmosphäre getrocknet. Das violettgefärbte Kieselgurprodukt wurde anschließend auf eine Zellulosepulver-n-Butanol-Wasser=Säule aufgetragen und das Chromatogranun mit wassergesättigtem und cyanidionenhaltigem n-Butanol entwickelt. Im Eluat erschien zunächst der nicht umgesetzte- Faktor I (R-Wert = o,53), dann nach einer farblosen Zwischenzone der Faktor II (R-Wert = o,23). Die den Faktor II enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit Wasser extrahiert; wobei der Faktor II in die wäßrige Phase überging. Nach dem Beseitigen des n-Butanols im Vakuum war der Vitamin-B12 Faktor II in der wäßrigen Lösung in reiner Form enthalten. Sein Absorptionsspektrum sowie seine mikrobiologische Aktivität gegen L. Leichmannü waren mit denen des handelsüblichen Cyanocobalamins identisch, sein Verteilungskoeffizient im Phasensystem n-Butanol/ Wasser + Ammonsulfat hatte bei 24 °/o an Ammon-Sulfat den Wert 1. Die Ausbeute an. Faktor II betrug 276 Gamma. Beispiel 2 2,5 1 des gleichen Mediums wie im Beispiel 1, das jedoch j e 1o Gammaprozent an Vitamin-B" Faktor I sowie an 5, 6-Dimethylbenzimidazol enthielt, wurden mit 5°/o einer Kultur des E.-coli-Stamms I beimpft. Impfkultur, Bebrütungsart, Bebrütungszeit und Verarbeitungsweise der vergorenen Kulturlösungen waren ebenso wie im Beispiels angegeben. Die Analyse ergab 131 Gamma an synthetisiertem Vitamin-B"-Faktor II (Cyanocobalamin).
• Abb. 1 zeigt die Verteilungschromatographie des aus dem Versuch C, ohne 5, 6-Dimethyibenzimidazol gewonnenen Konzentrates an einer Zellulosepulvern-Butanol-Wasser-Säule, enthaltend Cyanidionen.
• Vitamin-B.2-Faktor I; Extinktion gemessen bei 368 mß.
• Abb. 2 zeigt die Verteilungschromatographie des aus Versuch C mit 5 Gammaprozent 5, 6-Dimethylbenzdazol gewonnenen Konzentrates. Chromatograp ersäule wie in Abb. 1.
• Vitamin-B12-Faktor I; Extinktion gemessen bei 368 mu.
• Vitämin-B,2-Faktor II; Extinktion gemessen bei 361 mu. Abb.3 zeigt die Verteilungschromatographie des aus Versuch C mit io Gammaprozent 5, 6-Dimethylbenzimidazol gewonnenen Konzentrates. Chromatographiersäule wie in Abb. i.
• Vitamin-B,2-Faktor I; Extinktion gemessen bei 368 m,u.
• Vitamin-B12-Faktor II; Extinktion gemessen bei 361 mu.
• Abb: q: zeigt die Verteilungschromatographie des aus Versuch C mit 2o Gammaprozent 5, 6-Dimethylbenzim'idazol gewonnenen Konzentrates. Chromatögraphiersäule wie in Abb. i.
• Vitamin-B12-Faktor I; Extinktion gemessen bei 368 my.
• Vitamin-B.2-Faktor II; Extinktion gemessen bei 361 mu.
• Abb. 5 zeigt die Abhängigkeit der im Versuch C gebildeten Menge an@ Vitamin-B12 Faktor II von der Konzentration an 5, 6-Dimethylbenzimidazol im Nährmedium. ,Zur Abgrenzung des Anmeldegegenstandes zum Stand der Technik wurden zum Zeitpunkt der Anmeldung folgende Literaturstellen berücksichtigt: W. Friedrich und K. Bernhauer, Angewandte Chemie, 65, S. 627, 1953.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Biosynthese von Cyanocobalamin (Vitamin-B1.-Faktor II) aus dem Vitamin-B"-Faktor I, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen in Nährmedien, die Vitarnin-B12 Faktor I und 5, 6-Dimethylbenzimidazol enthalten, wachsen läßt und das sich hierbei bildende Cyanocobalarnin (Vitamin-B12 Faktor II) isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß vorwiegend E.-coli-Stämme verwendet werden. Angezogene Druckschriften: Angewandte Chemie, 1953, S. 627.