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Verfahren zur Biosynthese von Vitaminen der B12-Gruppe In dem Patent
945 648 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 beschrieben, das darin
besteht, daß man lebende Mikroorganismen, wie z. B. Bacterium coli, auf den inkompletten
Vitamin-Bi,-Faktor I (Ätiocobalamin) und 5, 6-Dimetliyl-benzimidazol einwirken läßt,
wodurch eine Biosynthese von Vitamin B12 zustande kommt.
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Es wurde nun gefunden, daß nicht nur gemäß dem Verfahren des Hauptpatents
945 648 Vitamin B12 auf dem genannten biosynthetischen Weg gewonnen werden kann,
sondern daß überraschenderweise eine Biosynthese von bisher unbekannten Vitaminen
der B12 Gruppe dadurch bewerkstelligt werden kann, daß man grundsätzlich ebenso
wie im Hauptpatent vorgeht, aber an Stelle von 5, 6-Dimethyl-benzimidazol unsubstituiertes
Benzimidazol oder andere Substitutionsprodukte desselben oder aber Vorstufen dieser
Benzimidazole,'wie z. B. o-Phenylendiamin bzw. dessen Derivate, verwendet. Es entstehen
so aus dem »inkompletten« Ätiocobalamin neue »komplette« Vitamin-B"-Arten, die sich
vom Ätiocobalamin dadurch unterscheiden, daß sie eine Nucleotidgruppe besitzen,
und- die sich
voneinander und ebenso vom Vitamin B12 selbst dadurch
unterscheiden, daß sie in ihrem Nucleotidanteil verschiedenartige Basen enthalten.
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Zum Verständnis der nachfolgenden Beschreibung mögen folgende Ausführungen
dienen: Man kennt bereits verschiedene.: Vitamin-Bi,7 Arten, die als »Vitamine der
Bit Grippe« oder Cobalamine zusammengefaßt werden können. Innerhalb dieser Gruppe
kann man »komplette« und- »inkomplette« Vitamin-B1,-Arten (Cobalamine) unterscheiden,
je nachdem, ob sie ein Nucleotid besitzen oder nicht. Die inkompletten Formen bestehen
im wesentlichen nur aus dem cobalthaltigen Grundkomplex, dessen Konstitution bis
jetzt noch unbekannt ist und der als »Ätiocobalamin« bezeichnet werden kann (abgeleitet
vom griechischen Wort aizia = Grund). Dadurch soll zum Ausdruck gebracht werden,
daß es sich dabei um den Grundkörper der Cobalamine handelt, in Analogie zur Bezeichnung
»Ätioporphyrin«, also dem Grundkörper der Porphyrine. Das Ätiocobalamin ist nach
den bisher vorliegenden Befunden in allen bis heute bekanntgewordenen Vitamin-B."-Arten
enthalten. Die kompletten Cobalamine enthalten außer dem Ätiocobalamin noch ein
Nucleotid; wodurch sie im Sinne der Nomenklatur komplett werden. Dies bedingt aber
auch deutliche Unterschiede im physikalischen, chemischen und biologischen Verhalten,
wie folgende Merkmale zeigen:
| Inkomplette Komplette |
| Cobalamine Cobalamine |
| Farbe bei pH 6 ................................ Violett
Rot |
| (Dicyano-Foim) (Monocyano- |
| Form) |
| Absorptionsmaximum bei p$ 6 .................. 367 m,£
361 m,cc |
| (Dicyano-Form) (Monocyano- |
| Biologische Aktivität gegenüber Form) |
| Coli-Mutante 1x3-3 ........................... aktiv aktiv |
| L. Leichmannii 313 ...................... :
.... inaktiv aktiv |
| Ochromonas malhamensis ..................... inaktiv
vgl. unten |
| perniciöse Anämie ............................ inaktiv
vgl. unten |
Unter den kompletten Cobalaminen kann, man nach den vorliegenden Forschungsergebnissen
zwei Typen unterscheiden, nämlich Benzimidazol-cobalamine und Purin-cobalamine,
je nachdem, ob die Base des Nucleotidanteils der Benzimidazolreihe oder der Purinreihe
angehört. Diese beiden Typen der kompletten Cobalamine sind biologisch , deutlich
unterscheidbar, und zwar - soweit bisher' bekannt -dadurch, daß die Benzimidazolcobalamine.gegenüber
Ochromonas malhamensis und gegen perniziöse Anämie in der Regel wirksam sind, die
Purin-cobalamine aber nicht. Da die letzteren keine antiperniziöse Wirkung haben,
wurden sie zunächst als Pseudo-Blz-Vitamine oder Pseudo-B",-Faktoren bezeichnet.
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Das nachfolgend beschriebene Grundverfahren, dessen Prinzip bereits
oben genannt wurde, läßt sich in Form einiger Modifikationen durchführen, die aber
alle nur Abwandlungen des für das Verfahren charakteristischen Prinzips sind, nämlich
1. Man läßt Mikroorganismen in Gegenwart von Ätiocobalamin und einem »precursor«
der Benzimidazolreihe wachsen.
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2. Man gewinnt eine Mikroorganismenmasse (ruhende Zellen) und läßt
sie auf eine Lösung von Ätiocobalamin und einem »precursor« der Benzimidazolreihe
einwirken.
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3. Man läßt Mikroorganismen, die selbst Ätiocobalamin zu bilden vermögen,
in Gegenwart eines »precursorsc@derBenzimidazolreihe wachsen odergären.
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Bei allen drei Modifikationen muß das biosynthetische Medium Phosphat
enthalten, und zwar entweder dadurch, daß man Phosphat dem Medium zusetzt, oder
dadurch, daß Phosphat in den Zellen enthalten ist. Außerdem kann man zu dem Medium
noch d-Ribose zusetzen. Bei den Modifikationen i und 2 des Verfahrens wird Ätiocobalamin
im isolierten Zustand oder in Form einer rohen Lösung zugesetzt. Im Fall 3 kann
man auf einen Zusatz von Ätiocobalamin verzichten. In den Fällen 1 und 3 muß ein
Nährmedium angewendet werden, das eine gute Entwicklung oder Gärung des betreffenden
Mikroorganismus ermöglicht, während im Fall 2 das Medium, in dem die Biosynthese
stattfindet, lediglich Ätiocobalamin -f- - »precursor« + Phosphat und evtl. noch
etwas d-Ribose enthält.
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Die Durchführung des Verfahrens nach der ersten Modifikation gestaltet
sich im Prinzip folgendermaßen: Man läßt einen geeigneten Mikroorganismus, ,vie
z. B. E. coli, in üblicher Weise in einem Medium wachsen, das eine Kohlenstoffquelle,
wie z. B. Glucose, und die erforderlichen Nährsalze enthält. Außerdem versetzt man
die Nährlösung mit Ätiocobalamin in biologischen Konzentrationen, also in . einer
:Menge von etwa o,1 bis 0,3 Gamma je ccm, entsprechend 1o bis 3o Gammaprozent
und mit einem »precursor« der Benzimidazolreihe oder einer Vorstufe desselben in
etwa zehnfachem molarem Ü'berschuß unter Berücksichtigung eines Molekulargewichtes
von etwa goo für das Ätiocobalamin. Nach dem Sterilisieren der Nährlösung und Beimpfen
läßt man nun bei einem geeigneten p11-Wert, z. B. 6 bis 7, und optimaler Temperatur,
also z. B. 37°, unter submersaeroben
Bedingungen, also . unter
Schütteln oder Rühren und gleichzeitiger Durchlüftung, wachsen.
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Das Ätiocobalamin kann aber auch z. B. in alkoholischer Lösung zugesetzt
werden. In diesem Fall ist dessen Sterilisierung durch Hitze überflüssig. Ebenso
können die erwähnten Benzimidazol-Derivate oder deren Vorstufen in alkoholischer
Lösung zugefügt werden. Bei Verwendung von nicht sauerstoffbedürftigen Mikroorganismen
kann aber auch unter anaeroben bzw. fakultativanaeroben Bedingungen gearbeitet werden,
da diese Organismen auch unter diesen Bedingungen zu wachsen vermögen. Sinngemäß
sind stets solche Bedingungen zu wählen, die dem Wachstum bzw. der Gärung der betreffenden
Mikroorganismen angemessen sind. Nach 8 bis 7,4 Stunden -je nach der Zuckerkonzentration,
den Züchtungsbedingungen und nach der Art der verwendeten Mikroorganismen - ist
der Prozeß beendet. Nun wird die Fermentationsbrühe in der weiter unten geschilderten
Weise aufgearbeitet, wobei man die jeweiligen biosynthetisch gebildeten Benzimidazolcobalamine
erhält.
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Bei der Durchführung des Verfahrens nach der zweiten Modifikation
geht man grundsätzlich in der Weise vor, daß die Mikroorganismen zunächst in einem
üblichen Nährmedium, das der Art der betreffenden Mikroorganismen angemessen ist,
also ein gutes Wachstum ermöglicht, ohne weitere Zusätze vorgezüchtet und z. B.
durch Zentrifugieren gewonnen werden. Sodann läßt man in einem zweiten Prozeß die
gewonnene Mikroorganismenmasse auf eine Lösung des Ätiocobalamins und des betreffenden
Benzimidazols in Phophatpuffer bei z. B. 37° etwafobis 2oStunden z. B. unter Schütteln
oder Rühren unter gleichzeitiger Belüftung einwirken. Bei dieser Arbeitsweise können
die umzusetzenden Stoffe in einer beträchtlich höheren Konzentration eingesetzt
werden, da auch die Bakterienmasse in viel höherer Konzentration angewendet werden
kann als bei der ersten Modifikation. In diesem Fall brauchen daher bei der Isolierung
der biosynthetisch entstandenen Vitamin-B"-Faktoren nicht so große Flüssigkeitsmengen
verarbeitet werden wie bei der ersten Modifikation. Ferner hat es sich als vorteilhaft
erwiesen, bei einer derartigen Arbeitsweise dem Medium d-Ribose zuzusetzen, die
als Vorstufe bei der Biosynthese des Nucleotid-Anteiles 'der biosynthetischen Vitamin-B.2-Faktoren
wirkt, wodurch die Ausbeute an diesen noch gesteigert werden kann. Man verwendet
also in diesem Fall, z. B. für iooo ccm Phosphatpuffer 2o g feuchte Bakterienmasse
(mit etwa 30 °/a Trockensubstanzgehalt), 30 optische Einheiten an Ätiocobalamin
(Erklärung vgl. unten), i bis io mg des Benzimidazolderivates und 2 bis fo mg d-Ribose.
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Bei der dritten Modifikation des Verfahrens geht man so vor, daß man
zu einer Fermentation von Mikroorganismen, die selbst Ätiocobalamin zu bilden vermögen,
lediglich einen geeigneten nprecursor«« der Benzimidazolreihe in einer Konzentration
von z. B. i bis fo mg/1 zusetzt und im übrigen die Gärung in der üblichen Weise
durchführt.
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Das Verfahren nach den Modifikationen i und 3 kann auch in der Weise
durchgeführt werden, daß das Wachstum bzw. die Fermentation der Mikroorganismen
kontinuierlich gestaltet wird, indem man zur 'Züc$tung der die Biosynthese vollziehenden
Mikroorganismen ein Fermentationsgerät verwendet, das mit kontinuierlichem Zu- und
Ablauf versehen ist. So kann man z. B. die kontinuierliche Züchtung von E. coli
mit einem Durchsatz von etwa q. bis 5 Stunden bewerkstelligen, d. h., der Fermenterinhält
erneuert sich immer wieder innerhalb dieser Zeitspanne. Die kontinuierlich anfallende
Gärbrühe kann dann fortlaufend verarbeitet werden. Ferner kann man bei der Schlammausfaulung
durch Methangärung, einem kontinuierlich verlaufenden Prozeß, fortlaufend einen
»precursora der Benzimidazol-Reihe zum Frischschlamm zusetzen und so das dabei entstehende
Ätiocobalamin in ein Benzimidazolcobalamin umwandeln. Ferner ist es auch möglich,
durch solche Zusätze die Art der entstehenden Cobalamine wunschgemäß zu beeinflussen,
also die Biosynthese der kompletten Cobalamine so zu lenken, daß dabei die gewünschten
Produkte entstehen. ' Ferner kann man auch so vorgehen, daß män bei den Modifikationen
i und 2 das Ätiocobalamin nicht in reiner Form, sondern als Rohprodukt, also in
unreinem Zustand oder in Mischung mit anderen Cobalaminen neben sonstigen Verunreinigungen
anwendet.
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Die Gewinnung der nach dem geschilderten biosynthetischen Verfahren
entstandenen Benzimidazolcobalamine erfolgt prizipiell nach einer der nachfolgend
beschriebenen Methoden: A. Die in der geschilderten Weise gewonnene Fermentationsbrühe,
die die biosynthetisch gebildeten Vitamin-B1rFaktoren enthält, wird mit o,i °/o
Natriumcyanid oder o,i °/o Natriumbisulfit versetzt, auf p$ 6 eingestellt und während
30 Minuten auf 8o° erhitzt. Anschließend wird zentrifugiert. Nach dem Abkühlen
auf 2o° wird das Filtrat mit 0,5 bis 10/, Aktivkohle geschüttelt. Sodann
werden aus dem mit Hilfe einer Zentrifuge gewonnenen Kohleadsorbat die Vitamin-B12-Faktoren
z. B. mit 7o°/oigem heißem Äthanol eluiert. Die Eluate werden im Vakuum eingeengt
und .daraus die Vitamine der B12 Gruppe mit Hilfe einer Lösung von 2o °/o p-Chlorphenol
in o-Dichlorbenzol extrahiert. Nach dem Waschen der p-Chlorphenol-Extrakte mit Phosphatpuffer
vom p$ 7 und mit Wasser werden sie mit 5 bis 8 °/o n-Butanol versetzt und mit Wasser
extrahiert, wobei die Vitamine der B12 Gruppe in die wäßrige Phase übergehen. Die
roten wäßrigen Extrakte werden im Vakuum von Resten an organischen Lösungsmitteln
befreit und anschließend mit 10/, Kieselgur versetzt, auf PR 3 angesäuert
und mit 2,2 °/o p-Chlorphenol geschüttelt, wobei die gesamten Vitamine der B"7 Gruppe
als p-Chlorphenol-B12Komplexe an Kieselgur niedergeschlagen werden. Nach dem Absaugen
wird der rote Filterkuchen mit Aceton versetzt, wodurch der p-Chlorphenol-B1,Komplex
zerlegt wird und die Vitamine der B12 Gruppe an Kieselgur gefällt werden. Nach dem
Absaugen wird das die Vitamine der B12 Gruppe enthaltende Kieselgurprodukt im Vakuum
getrocknet und in einer Blausäureatmosphäre stehengelassen. Sodann wird dieses Produkt
in eine Chromatographiersäule
gebracht. Der Verlauf der Chromatographie
ist jeweils verschieden, und zwar abhängig von der Art der im biosynthetischen Prozeß
verwendeten Benzimidazole.
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B. Eine gleichartige Fermentationsbrühe wie unter A wird mit o,i
% Natriumcyanid oder o,i °/o Natriumbisulfit versetzt, auf einen pH-Wert
von 6,3 eingestellt und 30 Minuten auf 8o° erhitzt. Anschließend wird zentrifugiert.
Das Zentrifugat wird mit io°/oiger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt
und über Kieselgur abgesaugt. Nach dem Erkalten auf etwa 5° C wird das Filtrat mit
10/, Bentonit (bezogen auf das Volumen) in kleinen Portionen unter Rühren
während einer halben Stunde versetzt und anschließend noch eine weitere halbe Stunde
gerührt. Danach wird über Kieselgur abgesaugt. Das vollkommen farblose Filtrat,
das gemäß dem mikrobiologischen Test nur noch eine minimale B"-Aktivität besitzt,
wird verworfen. Das Adsorbat wird anschließend mit einer Lösung von 2 °/o Natriumbicarbonat
und o,i °/o Natriumcyanid in Wasser eluiert. Der Elutionsprozeß vollzieht sich im
allgemeinen in drei Stufen, wobei man in der ersten Stufe z. B. für 15 g Bentonit
(gerechnet als Trockensubstanz) Zoo ccm, in der zweiten Stufe 16o ccm und in der
dritten Stufe ioo ccm der Elutionslösung anwendet. Zur Elution wird stets
30 Minuten bei 5o bis 55° gerührt. Anschließend wird jeweils zentrifugiert.
Die leichtrötlich gefärbten Eluate werden vereinigt und mit Schwefelsäure auf einen
pH-Wert von 6,5 eingestellt. Anschließend extrahiert man die B"-Vitamine durch Ausschütteln
mit einem Gemisch von qo Teilen Phenol und 6o Teilen o-Dichlorbenzol. Die weitere
Reinigung erfolgt in der gleichen Weise, wie unter A beschrieben.
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In vielen Fällen empfiehlt es sich, vor der chromatographischen Trennung
der B"-Vitamine folgenden Arbeitsgang einzuschalten: Die gemäß Methode A oder B
erhaltenen roten wäßrigen Extrakte, die im Vakuum von Resten an organischen Lösungsmitteln
befreit worden waren, werden mit 2 °/o Zinkchlorid (bezogen auf das Volumen) versetzt.
Danach wird mit Natronlauge auf einen p11-Wert von 8,5 eingestellt und vom ausgefallenen
Zinkhydroxyd über Kieselgur abgesaugt. Der Filterkuchen wird mehrmals mit Wasser
vom pH 8,5 gewaschen, um alle anhaftenden Reste von B,2 Vitaminen zu entfernen.
Das völlig klare Filtrat bringt man auf einen pH-Wert von 6,5 und führt nochmals
die unter A beschriebene Prozedur durch, beginnend mit der Extraktion mit Phenol
bzw. p-Chlorphenol und o-Dichlorbenzol bis zur Herstellung des Kieselgurproduktes.
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Die Trennung der B12 Vitamine durch Chromatographie an Zellulose erfolgt
in folgender Weise: Zellulosepulver wird mit dem Entwickler (wasserhaltiges n-Butanol
mit Blausäure) geschüttelt und dann in die Chromatographiersäule eingefüllt. Anschließend
erfolgt die Chromatographie unter Benutzung des gleichen Entwicklers, mit dem der
Zellulosebrei angerührt worden war. Sodann fängt man die einzelnen Fraktionen entsprechend
der Zonenbildung auf. Durch Bestimmung der mikrobiologischen Aktivität der einzelnen
Fraktionen im L.Leichmannii-Test stellt man fest, wo sich das biosynthetische Vitamin-B"-Analoge
befindet. Aus der den biosynthetischen Vitamin-B1,-Faktor enthaltenden Fraktion'
gelingt es nicht immer, sogleich dessen Kristallisation zu erreichen, besonders
dann nicht, wenn derselbe einen ähnlichen R-Wert hat wie das Ätiocobalamin, wenn
es also von diesem nicht völlig getrennt ist. In solchen Fällen empfiehlt sich eine
nochmalige Chromatographie der betreffenden Fraktion, nun aber unter Benutzung von
Aluminiumoxyd. Man geht hierbei in folgender Weise vor: Die betreffende Fraktion,
bestehend aus wasserhaltigem Butanol, wie sie aus der Zellulosesäule erhalten wird,
extrahiert man mit Wasser. Die wäßrige'Phase wird im Vakuum eingeengt, um alle Reste
von Alkohol zu entfernen. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 3 wird, wie unter A
beschrieben, das Kieselgurprodukt des betreffenden Vitamin-B12 Faktors hergestellt.
In einem weiteren Arbeitsgang wird eine Säule mit einer Suspension von Aluminiumoxyd
in trockenem Aceton gefüllt. Nachdem sich das Aluminiumoxyd abgesetzt hat, gibt
man in das darüberstehende Aceton das Kieselgurprodukt und läßt das Aceton durch
die Säule ablaufen. Die Elution des B12 Faktors erfolgt mit Aceton, dem man allmählich
steigende Mengen von Wasser zufügt. Je nach der Art des betreffenden B12 Faktors
beginnt dessen Elution bei einem Wassergehalt von 15 bis 40 °/o im Entwickler. Das
so erhaltene Eluat wird im Vakuum auf ein möglichst kleines Volumen eingeengt und
durch Zusatz von Aceton bei etwa 2° C zur Kristallisation gebracht.
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Der Prozeß zur Gewinnung der B12 Vitamine kann auch in der Weise durchgeführt
werden, daß nicht die gesamte Fermentationsbrühe aufgearbeitet wird, sondern daß
nach Beendigung der Biosynthese die Mikroorganismenzellen abgetrennt und für sich
allein - also ohne Nährmedium - zur Isolierung der Bl2 Vitamine dienen. Die Erfahrung
zeigt, daß sich die Bl2 Vitamine fast vollständig in den Zellen befinden, so daß
das Filtrat (Medium) vernachläßigt werden kann.
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Zum Nachweis, daß aus dem Ätiocöbalamin ein biosynthetischer kompletter
Bl2 Faktor entstanden ist, dient zunächst die Tatsache, da.ß alle biosynthetischen
B12 Arten komplett sind, indem sie bei pg etwa 7,6 einen Monocyanokomplex bilden,
also rot sind, und ein Absorptionsmaximum von 361 my besitzen, während das als Ausgangsmaterial
dienende Ätiocobalamin bei p$ 7 einen Dicyanokomplex bildet, also violett ist, und
ein Absorptionsmaximum von 367 my hat. Die Monocyanokomplexe der neuen Vitamin-B"-Arten
erwiesen sich im allgemeinen elektrophoretisch als neutral. Ferner sind alle diese
neuen Vitamin-B" Arten im mikrobiologischen Test nicht nur gegenüber der Coli-Mutante
113-3, sondern auch gegenüber L. Leichmannii 313 aktiv, während der Vitamin-B12
Faktor I (das Ätiocobalamin) nur gegenüber der Coli-Mutante wirksam ist, nicht aber
gegenüber L. Leichmannii.
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Zur näheren Kennzeichnung der verschiedenen biosynthetischen Vitamin-B"-Falztoren
können grundsätzlich die R-Werte, RF-Werte und Verteilungskoeffizienten in bestimmten
Lösungsmittelsystemen
herangezogen werden. Allerdings sind die R-Werte
und Rf-Werte nicht immer ausreichend. Wohl aber sind die Verteilungskoeffizienten
der betreffenden B12 Faktoren im System Wasser - p-Chlorphenol Trichloräthylen und
vor allem im System n-Butanol -Ammonsulfat + Wasser zumeist so stark verschieden,
daß sie sich zur Unterscheidung und Charakterisierung der biosynthetischen Vitamin-B",-Arten
eignen.
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Die Umwandlungsrate von Ätiocobalamin in biosynthetische komplette
B12 Faktoren kann nicht ohne weiteres im Gewichtsmaß ausgedrückt werden, da das
Ätiocobalamin nicht in kristallisiertem Zustand erhältlich ist. Eine gewichtsmäßige
Dosierung ist daher schwierig. Zur Ermittlung der Umwandlungsrate bzw. der Ausbeute
kann man zwei Wege beschreiten.
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Man kann z. B. in der Weise vorgehen, daß man die mikrobiologische
Aktivität gegenüber der E. Coli-Mutante 1i3-3 zugrunde legt. Da aber Ätiocobalamin
nur etwa ein Drittel der Aktivität von Vitamin B12 besitzt (wenn man beide bei der
gleichen optischen Dichte vergleicht, wie unten näher ausgeführt wird) und da die
relative Aktivität von neuen Vitamin-B"-Arten im Vergleich mit Vitamin B12 zunächst
unbekannt ist, bleibt dieser Weg zur Ermittlung der Umwandlungsrate des Ätiocobalamins
und zur Berechnung der Ausbeute unsicher. Es empfiehlt sich daher, einen anderen
Weg zu wählen, nämlich die Menge an Vitamin-B1,-Faktoren in »optischen Einheiten«
auszudrücken, die in folgender Weise definiert werden: i. ccm Lösung eines Vitamin-B1,-Faktors
entspricht dann einer optischen Einheit (nachfolgend als »opt. E. « abgekürzt),
wenn diese Lösung im UV-Spectrophotometer bei einer Schi^htdicke von i cm eine Extinktion
von i bei 361 mu (bei kompletten Vitamin-B"-Faktoren) bzw. 367 m/t (bei inkompletten
Vitamin-B"-Faktoren) besitzt. Zur Erläuterung möge folgendes Beispiel dienen: 8
ccm einer Lösung von der Extinktion (= optischen Dichte) o,2 bei 361 m,u (bzw. 367
mu) haben o,2 mal 8 = 1,6 opt. E. Allgemein ausgedrückt : Die zu ermittelnden optischen
Einheiten sind das Produkt aus der Extinktion und dem Volumen (in ccm) der gemessenen
Probe. Bezogen auf die Aktivität im Coli-Test entspricht eine Lösung von Vitamin
B12 mit einem Gehalt von,einer opt. E. einer Menge von 48 Gamma kristallisiertem
Vitamin B12 je ccm. Bezogen auf die Aktivität im gleichen Test besitzt eine Lösung
von Ätiocobalamin mit einem Gehalt von einer opt. E. je ccm dieselbe Aktivität wie
eine Lösung von 16 bis 17 Gamma Vitamin B12 j e ccm.
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In der vorliegenden Beschreibung und' in den. Beispielen wird der
zweite Weg beschritten, da er einen zuverlässigen Maßstab zur Ermittlung der Ausbeute
gibt.
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Bei der Ausbeuteberechnung muß noch weiterhin berücksichtigt werden,
daß sie eine recht schwierige präparative Aufarbeitung unter Isolierung der biosynthetisch
gebildeten Vitamin-B" Faktoren zur Voraussetzung hat. Erfahrungsgemäß können bei
dieser präparativen Aufarbeitung kaum mehr als 50"/, der Gesamtmenge an Vitamin-B"
Faktoren erfaßt werden, da insbesondere bei der Verarbeitung in kleinem Maßstab
Verluste unvermeidlich sind. Unter Berücksichtigung dieser Ausführungen sind daher
präparative Ausbeuten von 3o bis 4o0/, an biosynthetisch entstandenen Vitamin-B"-Faktoren,
wie sie in günstigen Fällen erreicht werden, durchaus zufriedenstellend, da diese
Zahlen einer Umwandlungsrate des Ätiocobalamins von 6o bis 8o0/, entsprechen.
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Die Umwandlungsrate des Ätiocobalamins hängt von der Art des verwendeten
Mikroorganismus, der Art der Versuchsdurchführung und von der angebotenen Benzimidazolart
ab und ist daher recht unterschiedlich, wie die Tabelle zeigt. In dieser Tabelle
sind auch die Unterscheidungsmerkmale der neuen Vitamin-B"-Faktoren enthalten.
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Die biologische Aktivität der neuen Vitamin-B,-Arten ist sehr beträchtlich
und kann gleichfalls zur Charakterisierung derselben dienen. Während das als Ausgangsmaterial
dienende Ätiocobalamin nur gegenüber der Coli-Mutante aktiv ist, sind die biosynthetisch
gewonnenen kompletten Cobalamine auch gegenüber L. Leichmannii und Ochromonas malhamensis
wirksam, d. h. sie ermöglichen das Wachstum dieser Testorganismen. Als Beispiel
wird in Fig. i die Wirksamkeit von Benzimidazol-cobalamin und 5-Methylbenzimidazol-cobalamin
gegenüber Ochromonas- malhamensis im Vergleich zu Vitamin B12 gezeigt. Die hohe
antiperniziöse Wirkung z. B. von 5-Methylbenzimidazol-cobalamin wird in Fig. 2 veranschaulicht.
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Das beschriebene Verfahren bietet unter anderem die Möglichkeit, das
bei der Gewinnung von kompletten Vitamin-B"-Arten aus Faulschlamm (besonders des
Vitamins B12 selbst und des Vitamin-B" Faktors III) als Nebenprodukt anfallende
Ätiocobalamin nutzbringend zu verwerten, indem man es auf dem geschilderten Weg
in neuartige, antiperniziös hochaktive Cobalamine überführen kann.
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Ferner kann das geschilderte Verfahren dazu dienen, das während der
Faulschlammgärung oder anderen Fermentationsprozessen entstehende Ätiocobalamin
durch Zusatz von Benzimidazolen unmittelbar zu verwerten, ohne es erst zu isolieren,
und es auf diese Weise in komplette Benzimidazoicobalamine umzuwandeln.
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Die Durchführung des neuen Verfahrens wird durch folgende Beispiele
näher erläutert. Beispiel i 18,6 1 eines modifizierten Davis-Mediums mit einem pH-Wert
von 6,9 [1,05% K,HP04, o,450/, KH2P04, 0,075°/o Natriumzitrat, 0,015°/o MgS04. 7H20,
o,i5% (NH4)2S04, 0,3°/o Glukose], enthaltend 2o Gammaprozent Benzimidazol, werden
2o Minuten lang bei iöo° sterilisiert und anschließend mit 83 opt. E. an Vitamin-B1,-Faktor
I (in 7o%iger alkoholischer Lösung) versetzt. Nach dem Beimpfen mit 5 % einer Kultur
des E. coli-Stammes I in Pepton-Fleischextrakt-NaCl (15 Stunden lang bei 37° bebrütet)
wird in einem kleinen Fermenter unter gleichzeitigem Rühren mit Hilfe eines Vibrationsmischers
und Belüften die Züchtung während 12 Stunden bei 3.7° vorgenommen. Die Fermentationsbrühe
wird sodann in üblicher Weise auf ein Vitamin-B" haltiges Kieselgurpräparat
verarbeitet.
Dieses wird anschließend auf einer Cellulose-n-Butanol-Säule chromatographiert.
Nach dem Entwickeln des Chromatogramms erscheint zunächst der nicht umgesetzte Faktor
I (R-Wert o,59), dann nach einer farblosen Zwischenzone der neue Vitamin-B1,-Faktor
(Ben7,imidazolcobalamin) mit dem R-Wert 0,17. Die den neuen Faktor enthaltenden
Fraktionen werden vereinigt und mit Wasser ausgeschüttelt. Dabei geht der neue Faktor
ins Wasser über. Nach Beseitigung des Butanols im Vakuum liegt der neue Vitamin-B1,-Faktor
in reinem Zustand in wäßriger Lösung in einer Menge von 23 opt. E. .vor (Ausbeute
27,8 °/o). Der Verlauf der chromatographischen Trennung ist aus Fig.3 ersichtlich.
(Eigenschaften vgl. Tabelle.) Beispiel 2 2o 1 des gleichen Nährmediums wie im Beispiel
1, enthalteird 2o Gammaprozent 5-Methylbenzimidazol werden wie üblich sterilisiert
-und mit 89,2 opt. E. an Vitamin-B"-Faktor I (in 7o°/oiger alkoholischer Lösung)
versetzt. Die Impfkultur, die Art der Beimpfung, der Gärverlauf und die Art der
Verarbeitung der fermentierten Kulturlösung werden wie im Beispiel i beschrieben
angesetzt und durchgeführt. Die Analyse ergibt 25 opt. E. an 5-Methylbenzimidazolcobalamin
(Ausbeute 28°/0). Der Verlauf der chromatographischen Trennung ist aus Fig. 4 ersichtlich.
(Eigenschaften vgl. Tabelle.) Beispiel 3 Eine Kultur des E. coli-Stammes I, dessen
Stammkultur durch vierwöchige Überimpfung in Fleischextraktagar geführt wird, überträgt
man zur schrittweisen Vermehrung in ein Röhrchen mit 5 ccm Peptonwasser (bestehend
aus i °/o Pepton, i °/a Fleischextrakt und 0,3 °/o Natriumchlorid vom p"
6;8). Nach i2stündigem Wachstum bei g7° wird diese Kultur zu ioo ccm des gleichen
Mediums zugeimpft und darin der Coli wie zuvor zur Entwicklung gebracht. In gleicher
Weise wird die Kultivierung sodann in 1 1 und schließlich in 5 1 des gleichen Mediums
vorgenommen. Im letzten Stadium wird die Vermehrung in einem kleinen dorfermenter
unter Belüftung durchgeführt. Mit dieser Coli-Kultur von 5 1 werden sodann
150 1 eines Mediums beimpft, das o,5 °/o technische Glukose und die gleichen
Salze wie im Beispiel. i enthält (p$ 6,g), gelöst in enthärtetem Wasser. Dazu fügt
man insgesamt 94o opt. E. Ätiocobalamin (in 7o°/oiger alkoholischer Lösung) und
2o Gammaprozent 5-Methylbenzimidazol. In diesem Medium läßt man die Coli-Kultur
unter Belüften (18 1 Luft pro Minute) und Rühren i2 Stunden lang bei 37° C wachsen.
Während die Ausgangsbrühe eine B12 Aktivität von 0,4 Gamma je ccm im Coli-Test zeigt
und keine Aktivität gegenüber L. Leichmannii, besitzt die fermentierte Brühe eine
Aktivität von o,o9 Gamma je ccm im Test mit L. Leichmannii.
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Die Fermentationsbrühe wird nun in der gleichen Weise wie im Beispiel
i aufgearbeitet und das Vitamin-B12-haltige Kieselgurpräparat ebenso wie dort beschrieben
chromatographiert. Nach dem Entwickeln des Chromatogramms erscheint zunächst das
nicht umgesetzte Ätiocobalamin, dann eine farblose Zone und schließlich der neue
biosynthetische Vitamin-B12 Faktoi. Die diesen Faktor enthaltenden Fraktionen werden
vereinigt und mit Wasser ausgeschüttelt. Dabei geht der neue Faktor ins Wasser über.
Nach Beseitigung des Butanols im Vakuum liegt er in der wäßrigen Lösung in einer
Menge von 230 opt. E. vor. Er zeigt die in der Tabelle angeführten Merkmale,
durch die er sich von anderen Vitamin-B12 Arten unterscheidet. Die wäßrige Lösung
wird im Vakuum auf ein kleines Volumen gebracht und fraktioniert mit Aceton versetzt.
Nachdem zunächst unreine Anteile ausflocken, die jeweils entfernt werden, kristallisiert
schließlich der neue Vitamin-B,.,-Faktor bei einem Acetongehalt von etwa go °/o
aus. Bei der Prüfung des kistrallisierten Produktes in einigen schweren Fällen von
perniziöser Anämie zeigte er einen ausgezeichneten therapeutischen Effekt. Beispiel
4 g 1 eines modifizierten Davis-Mediums vom pH-Wert 6,9 (s. Beispiel i) werden
30 Minuten bei ioo° sterilisiert und wie- im Beispiel 1 mit 5 °% einer Kultur
des E. coli-Stammes beimpft. Die Züchtung wird in Steilbrustflaschen während 8 Stunden
bei 37° unter Belüftung vorgenommen. Anschließend wird die Bakterienmasse steril
zentrifugiert. Die Ausbeute beträgt etwa 30 g feuchte Masse mit einem Trockengehalt
von etwa 3o °/o. Die so erhaltene Bakterienfeuchtmasse wird in 1,5 1 sterilem Phosphatpuffer
von p$ 7 (s,05 % K2 H P 0, + 0,45. °/o K Hz P 04) aufgeschlämmt. Unter sterilen
Bedingungen gibt man dann noch zu: 42 opt. E. Vitamin-B1,-Faktor I in 7o °/oiger
äthanolischer Lösung, ferner 3 mg d-Ribose und als Precursor 1,5 mg 4, 6-Dimethyl-benzimidazol.
Der Ansatz wird dann unter Rühren und Belüftung mit Hilfe eines Vibrationsmischers
24 Stunden bei 37° belassen. Sodann wird in -der üblichen Weise auf ein Vitamin-B12
haltiges Kieselgurpräparat aufgearbeitet. Beim Chromatographieren in der Cellulose-n-Butanol-Säule
erhält man eine Zone des nicht umgesetzten Faktors I (R-Wert o,45). Danach erscheint
eine zweite Zone des neuen Faktors mit einem R-Wert von o,ig. Nach Rechromatographieren
(R-Wert o,29) dieser letzten Zone, Ausschütteln mit Wasser und Beseitigung des Butanols
im Vakuum liegt der neue Vitamin-B"-Faktor (4, 6-Dimethylbenzimidazol-cobalamin)
in reinem Zustand in wäßriger Lösung in einer Menge von 9 opt. E. vor. Seine kennzeichnenden
Merkmale sind aus der Tabelle ersichtlich. Beispiel s Die Züchtung der Bakterienmasse
und Überführung in sterilen Phosphatpuffer erfolgt in der gleichen Weise, wie im
Beispiel 4 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Vitamin-B1,-Faktor I, 3 mg d-Ribose
und 1,5 mg 5, 6-Diäthyl-benzimidazol als Precursor wird 24 Stunden bei 37°, wie
zuvor beschrieben, behandelt. Bei der Chromatographie des Kieselgurproduktes an
der Cellulose-n-Butanol-Säule erhält man in der Hauptsache eine Zone mit einem R-Wert
von o,44. Die Substanz wird dann nochmals an Aluminiumoxyd unter Verwendung von
wäßrigem
Aceton als Elutionsmittel chromatographiert. Mit 12 % Wassergehalt
im Aceton wandert der nicht umgesetzte Faktor I als violette Zone ab. Geht man mit
dem Wassergehalt über 2o"/" so erhält man ein rotes Eluat des neuen Faktors (5,-
6-Diäthyl-benzimidazolcobalamin), der nach der Überführung in Wasser in reiner Form
in einer Menge von 8,5 opt. E. vorliegt (Eigenschaften vgl. Tabelle).
-
Beispiel 6 Züchtung der Bakterienmasse und Überführung in sterilen
Phosphatpuffer, wie im Beispiel 4 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Vitamin-B12
Faktor I, 3 mg d-Ribose und 1,5 mg 5-Chlor-6-methylbenziniidazol als Precursor wird
wie zuvor beschrieben 24 Stunden bei 37° behandelt. In der Cellulose-n-Butanol-Säule
erhält man eine Zone mit dem R-Wert o,5 (nicht umgesetzter Faktor I) und eine zweite
Zone mit dem R-Wert 0,33, bestehend aus 5-Chlor-6-methylbenzimidazol-cobalamin.
Nach Rechromatographieren an Cellulose (R-Wert o,46) liegt der Faktor in wäßriger
Lösung in reinem Zustand vor. Die Ausbeute beträgt 3,2 opt. E. (Eigenschäften vgl.
Tabelle). Beispiel 7 Züchtung der Bakterienmasse und Überführung in sterilen Phosphatpuffer,
wie imBeispiel 4 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Vitamin-B..-Faktor I, 3
mg d-Ribose und 1,5 mg Benzimidazol-5-carbonsäureamid als Precursor wird wie zuvor
beschrieben 24 Stunden bei 37° behandelt. Beim Chromatographieren in der Cellulose-n-Butanol-Säule
erhält man zwei Zonen, von denen die eine mit einem R-Wert von 0,5 den nicht
umgesetzten Faktor. I, die zweite Zone mit einem R-Wert von o,o6 den neuen Faktor
darstellt. Nach Ausschütteln mit Wasser und Entfernen des überschüssigen Butanols
im Vakuum liegt der Faktor in reiner Form in wäßriger Lösung mit einer Gesamtmenge
von 9 opt.E. vor (Eigenschaften vgl. Tabelle). Beispiel 8 Eine größere Menge Bakterienmasse
des E. coli-Stammes I wird in folgender Weise erzeugt. In analoger Weise wie im
Beispiel 3 wird eine Kultur des E. Coli-Stammes I schrittweise vermehrt. Als Impfkultur
dient 11 einer Bakteriensuspension, .die in einem Medium, bestehend aus 1% Pepton,
10/0 Fleischextrakt, 0,3 % Natriumchlorid und o,2 % Dinatriumphosphat (p$ 6,8) in
8 Stunden bei 37° C erhalten wurde. Mit dieser Impfkultur werden 51 des gleichen
Mediums beimpft und in einem kleinen Vorfermenter unter Belüftung 8 Stunden bei
37° C bebrütet. Die so erhaltene Kultur dient zur Beimpfung von 150 1 Medium, bestehend
aus 2 % technischer Glukose, 1,50/, NaH,Po" 0,0750/, Natriumcitrat, 0,15
% Ammonsulfat und 0,015 % Magnesiumsulfat (p$ eingestellt auf 6,8). In diesem Medium
wird die Coli-Kultur 8 Stunden lang bei 37° unter Belüftung (181 Luft pro Minute)
zur Entwicklung gebracht. Dann wird die Bakterienmasse steril zentrifugiert. Man
erhält 1300 g Feuchtprodukt mit 30% Trockensubstanzgehalt. 8oo g der so gewonnenen
Bakterienfeuchtmasse werden in einer 2o-1-Flasche zu z51 sterilem Phosphatpuffer
der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 5 hinzugefügt. Außerdem setzt man ioo
Gammaprozent 5, 6-Diäthylbenzimidazol, Zoo Gammaprozent d-Ribose und 42o opt. E.
Ätiocobalamin zu und homogenisiert das Ganze mit Hilfe eines Vibrators. Es wird
nun unter Belüftung (3 1 Luft je Minute) 24 Stunden bei 37° C bebrütet.
-
Die Fermentationsbrühe aus zwei gleichartigen Ansätzen wird vereinigt
(insgesamt etwa 30 1), mit 30 g Natriumcyanid versetzt und nach Einstellen
auf p$ 6,8 30 Minuten auf 8o° C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird zentrifugiert.
Aus dem noch trüben Zentrifugat flocken nach dem Ansäuern auf PH 2,5 noch weitere
Verunreinigungen aus, die ebenfalls abzentrifugiert werden. Man erhält eine völlig
klare, gelbgefärbte Lösung, die auf etwa 5° C abgekühlt wird. Die weitere Aufarbeitung
wird in folgenden Schritten vorgenommen a) Adsorption an Bentonit : In die gut gekühlte
Lösung (30 1) werden 300 g Bentonit in kleinen Anteilen im Verlauf einer
halben Stunde eingerührt. Danach wird noch eine weitere halbe Stunde gerührt. Das
Bentonitadsorbat setzt sich gut ab und wird unter Dekantieren über ein Kieselgurülter
abgesaugt. Das völlig klare und farblose Filtrat wird verworfen. Zur Elution wird
das Adsorbat in 2 1 einer wäßrigen Lösung von 20/, Natriumbicarbonat + o,1 % Natriumcyanid
eingetragen und 1/2 Stunde bei 55° C gerührt. Nach dem Zentrifugieren erhält man
ein klares, rötlichgefärbtes Eluat. Der Prozeß wird dreibis viermal wiederholt,
bis im Eluat nur noch eine geringe B12 Aktivität nachweisbar ist.
-
b) Erste Extraktion mit Phenol: Die vereinigten Eluate (71) werden
auf p$ 6,8 eingestellt und mit einer Mischung von 40 Teilen Phenol und 6o Teilen
o-Dichlörbenzol extrahiert (Gesamtextrakt 12oo ccm). Der rotbraungefärbte Extrakt
wird zweimal mit je 200 ccm 1,50/0iger Phosphorsäure, einmal mit Zoo ccm m/15 Phosphatpuffer
vom p$ 7 und zweimal mit je Zoo ccm Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeiten enthalten
keine B12 Aktivität und werden verworfen. Anschließend versetzt man die organische
Phase mit 12o ccm Butanol, wonach sich die B12 Vitamine mit Wasser ausschütteln
lassen. Der wäßrige Extrakt wird zur Entfernung von Phenol und Dichlorbenzol mit
ioo ccm Äther gewaschen und schließlich zur Entfernung von organischen Lösungsmitteln
im Vakuum eingeengt.
-
c) Zinkfällung : Die erhaltene rote Lösung (55o ccm) wird mit io g
Zinkchlorid versetzt. Danach gibt man Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 8,5 hinzu
und saugt das ausgeschiedene Zinkhydroxyd, das einen großen Teil organischer Verunreinigungen
mitreißt, über Kieselgur ab. Der Niederschlag wird so lange mit Wasser vom p$ 8,5
gewaschen, bis er völlig farblos ist.
-
d) Zweite Extraktion mit Phenol: Die Fällung mit p-Chlorphenol gelingt
in der so erhaltenen Lösung (8oo ccm) wegen der hohen Salzkonzentration nicht. Es
wird daher nochmals anit insgesamt 6oo ccm Phenol (4o Teile) in o-Dichlorbenzol
(6o Teile) extrahiert,
die untere Phase mit Wasser gewaschen und
mit Zoo ccm Butanol versetzt. Schließlich werden die Vitamine der Bit Gruppe mit
insgesamt 6oo ccm Wasser extrahiert. Nach Waschen mit Äther und Einengen im Vakuum
liegen 56o.ccm einer rein roten Lösung vor (q.03 opt. E., gemäß dem Coli-Test 17,9
mg, gemäß dem L.Leichmannii-Test. 11,2 mg).
-
e) p-Chlorphenol-Fällung: Die Lösung wird auf p$ 3 eingestellt, mit
5 g Kieselgur und 12,q. g p-Chlorphenol versetzt und kräftig geschüttelt. Die dabei
abgeschiedenen roten Flocken werden über Kieselgur abfiltriert, mit Aceton angerührt
und mit so viel Aceton versetzt, bis die überstehende Flüssigkeit nicht mehr rotgefärbt
ist. Dann wird das abgeschiedene Produkt filtriert, mit Aceton gewaschen und im
Vakuum getrocknet.
-
f) Chromatographie an Zellulose: Das Kieselgurprodukt wird auf eine
Zellulosesäule aufgetragen und festgestampft. Als Entwickler dient wassergesättigtes
n-Butanol mit o,oo5 °/a Blausäure. Man erhält beim Entwickeln neben geringen Mengen
einiger langsamer laufenden Zonen eine violettrote Hauptzone (351 opt.E., etwa 86,5%
der Gesamtausbeute), die die Säule mit einem R-Wert von 0,55 durchwandert.
Diese Zone enthält ein Gemisch von unverändertem Ätiocobalamin und dem neuen biosynthetischen
Faktor. Das Butanoleluat wird mit Wasser extrahiert und im- Vakuum vom Alkohol befreit
(13o ccm). Dann wird in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, mit p-Chlorphenol
gefällt und die Fällung mit Aceton gewaschen.
-
g) Chromatographie an Aluminiumoxyd: Zur Trennung der beiden Komponenten
wird das noch acetonfeuchte Kieselgurprodukt auf eine Säule aus Aluminiumoxyd in
Aceton gebracht. Als Elutionsmittel dient Aceton mit etwa- 0,005 °/o Blausäure,
dem man steigende Mengen Wasser zusetzt. Mit einer Mischung von 15 Teilen Wasser
und 85 Teilen Aceton tritt eine violette Zone aus der Säule aus (22o opt.E., 5q.,50/0
der Gesamtausbeute), die sich als reines Ätiocobalamin erweist. Mit einer Mischung
von 25 Teilen Wasser und 75 Teilen Aceton wandert der neue Vitamin-B"-Faktor als
rote Zone aus der Säule (118 opt. E., 29,50/, der Ausbeute).
-
Das Eluat wird im Vakuum bis auf 1 bis 2 ccm eingeengt und mit ungefähr-6o
ccm Aceton versetzt. Nach- 'dreitägigem Stehen bei 2° C hat sich der neue Faktor
in dünnen, prächtig roten Kristallnadeln abgeschieden. Die überstehende Flüssigkeit
wird vorsichtig dekantiert, die Kristalle in 1 bis 2 ccm Wasser gelöst und erneut
mit Aceton versetzt, bis die Kristallisation vollständig ist. Die Ausbeute an 5,
6-Diäthylbenzimidazol-cobalamin beträgt etwa 5 mg. Beispiel 750 g einer in
gleicher Weise, wie im Beispiel 8 beschrieben, gewonnenen Bakterienmasse des E.
coli-Stämmes I mit einem Trockensubstanzgehalt von 29 % werden in der gleichen
Weise wie im voranstehenden Beispiel in 15 1 Phosphatpuffer suspendiert, der Zoo
Gammaprozent Benzimidazol-5-carbonsäureamid, Zoo Gammaprozent d-Ribose und q2o opt.E.
an Ätiocobalamin enthält. Unter Belüftung und Rühren mittels eines Vibrätionsmischers
wird wie im Beispiel 8 24 Stunden bei 37° C bebrütet.
-
Die weitere Verarbeitung des Ansatzes erfolgt in der gleichen Weise
wie im Beispiel 8 beschrieben. a) Adsorption an Bentonit (s. Beispiel
8). b) Erste Extraktion mit Phenol (s. Beispiel 8).
-
Die Zinkfällung entfällt bei diesem Versuch, es wird vielmehr nach
dem Einengen der Lösung im Vakuum direkt mit p-Chlorphenol gefällt [wie Schritt
e) im Beispiel 8]. Das Kieselgurprodukt wird in Aceton aufgenommen, filtriert und
getrocknet.
-
f) Chromatographie an Zellulose: Das Kieselgurprodukt wird, wie im
Beispiel 8 beschrieben, an einer Zellulosesäule mit wassergesättigtem n-Butanol
0,0050/,) Blausäure chromatographiert. Dabei entstehen zwei Zonen. Die erste, violette
Zone mit dem R-Wert o,44 erweist sich als nicht umgesetztes Ätiocobalamin (138 opt.
E., 8o0/, der Gesamtausbeute). Die zweite, rote Zone wandert in der Säule mit einem
R-Wert von 0,07 (36,2 opt. E., 2o"/, der Gesamtausbeute). Ihr Eluat wird
mit Wasser extrahiert, der Rest des Alkhols im Vakuum entfernt und die Vitamin-B"-Faktoren
bei p$ 3 durch Zusatz von 2,20/, p-Chlorphenol an Kieselgur niedergeschlagen. Das
mit Aceton gewaschene Kieselgurprodukt wird einer erneuten Chromatographie an Zellulose
unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, unterworfen.
-
Bei dieser Chromatographie entstehen nochmals zwei rote Zonen. Die
erste hat einen R-Wert von o,11 (2q. _opt.E., 13°/o der Gesamtausbeute), die zweite
einen R-Wert von o,o6 bis o,o7 (13 opt. E., 711/, der Gesamtausbeute). Beide Substanzen
werden eluiert und getrennt aufgefangen. Nach Überführen in Wasser, Abdestillieren
des Alkohols und Fällen mit p-Chlorphenol werden die Kieselgurprodukte dieser beiden
Substanzen getrennt an Aluminiumoxyd chromatographiert.
-
g) Chromatographie an Aluminiumoxyd: Bei der Aluminiiimoxyd-Chromatographie
ergeben beide Substanzen jeweils nur eine rote Zone, die sich mit einem Gemisch
von 75 Teilen Aceton und 25 Teilen Wasser in Gegenwart von 0,0050/, Blausäure eluieren
läßt. Die beiden erhaltenen Eluate werden im Vakuum auf etwa 1 ccm eingeengt, mit
50 ccm Aceton versetzt und zur Kristallisation im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Substanz, die in der Zellulosesäule einen R-Wert von o,11 hat, kristallisiert
in dünnen, spitzen Nadeln, die Substanz mit dem R-Wert o,o6 in etwas dickeren kurzen
Nadeln. Beispiel 1o Zweimal goo g einer in gleicher Weise, wie im Beispiel-8 beschrieben,
gewonnenen Bakterienmasse des E. coli-Stammes I mit einem Trockensubstanzgehalt
von 28,504 werden, wie gleichfalls dort beschrieben, in zweimal je 151 sterilem
Phosphatpuffer suspendiert, der je Zoo Gammaprozent 1, 2-Diamino-4, 5-dimethylbenzol,
Zoo Gammaprozent d-RiUose und 420 opt. E. an Äticobalamin enthält. Es wird wie iin
Beispiel 8 bebrütet. Die erhaltene rermentationsbrühe (301) wird wie in Beispiel
g beschrieben aufgearbeitet.
-
Chromatographie an. Zellulose [wie Schritt f) in Beispiel 8]. Die
Chromatographie ergibt drei Zonen.
Die erste, violette Zone wandert
mit einem R-Wert von o,47 (252 opt. E., 870/, der Gesamtausbeute) und erweist sich
als nicht umgesetztes Ätiocobalamin. Die zweite, rotgefärbte Zone hat im Chromatogramm
einen R-Wert von 0,25 (27,g opt. E., 9,60/0 der Ausbeute). Es handelt sich
dabei um den neu gebildeten B12 Faktor. Die dritte Zone mit einem R-Wert von o,o8
(3,5 °/o der Ausbeute) ist violett. Es handelt sich dabei wahrscheinlich um ein
weiteres Umwandlungsprodukt des Ätiocobalamins, das bei diesen Versuchen zumeist
in geringen Mengen entsteht und wahrscheinlich mit einem der Faktoren C identisch
ist. Das mittlere, mit einem R-Wert von 0,25 aus der Säule austretende Eluat
wird wie üblich mit Wasser extrahiert und im Vakuum eingeengt (7o ccm).
-
Fällung mit Zink [wie Schritt c) im Beispiel 8]. Zur weiteren Reinigung
versetzt man die genannten 70 ccm mit 1,4 g Zinkchlorid und fällt das Zinkhydroxyd
durch Zusatz von Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 8,5, wie im Beispiel 8 beschrieben.
Nach dem -Filtrieren und Auswaschen des Niederschlages wird das Filtrat zur Ausfällung
des B12 Faktors mit kieselgur und p-Chlorphenol geschüttelt.
-
p-Chlorphenol-Fällung [wie Schritt e) im Beispiel 8]. Chromatographie
an Aluminiumoxyd [wie Schritt g) im Beispiel 8]. Das erhaltene Kieselgurprodukt
wird an Aluminiumoxyd chromatographiert. Mit einer Mischung von 8o °/o Aceton und
2o °/a Wasser in Gegenwart von Blausäure erhält man ein rotgefärbtes Eluat, welches
zur Reindarstellung des B12 Faktors im Vakuum auf etwa i ccm eingeengt, mit Aceton
bis zur beginnenden Trübung versetzt und im Kühlschrank zur Kristallisation aufbewahrt
wird. Der biosynthetisch entstandene B12 Faktor fällt dabei in dünnen spitzen Nadeln
an. Beispiel 11 Die Züchtung der Bakterienmasse erfolgt ebenso, wie im Beispie18
beschrieben, lediglich mit dem Unterschied, daß das Züchtungsmedium nicht --11110
technische Glukose, sondern nur o,5 °/o enthält. -Es werden dabei 915 g Feuchtbakterienmasse
gewonnen.
-
Diese Menge an Coli-Feuchtmasse wird in 251 sterilem Phosphatpuffer
der gleichem Zusammensetzung wie in Beispiel 4 aufgeschlämmt. Außerdem setzt man
5oo Gammaprözent (i25 mg) 5, 6-Dichlorbenzimidazol, Zoo Gammaprozent (5o mg) d-Ribose
und 8oo opt.E. Ätiocobalamin zu. Im übrigen wird so, wie im Beispiel 8 beschrieben,
vorgegangen.
-
Die Aufarbeitung der 25-1-Fermentationsbrühe erfolgt sinngemäß ebenso
wie im Beispiel 8, mit dem Unterschied, daß einige Aufarbeitungsschritte vereinfacht
werden, und zwar a) Adsorption an Bentonit (ebenso wie im Beispiel 8), b) Extraktion
mit Phenol (ebenso wie im Beispiel 8).
-
Die Zinkfällung entfällt bei diesem Versuch; es wird vielmehr nach
dem Einengen der Lösung im Vakuum direkt. mit p-Chlorphenol gefällt [wie Schritt
e) im Beispiel 8]. Das Kieselgurprodukt wird mit Aceton, behandelt, fiiltriert und
getrocknet.
-
Die. Chromatographie an Zellulose entfällt bei diesem Versuch; es
wird vielmehr sogleich das Kieselgurprodukt an Aluminiumokyd chromatographiert [wie
Schritt g) im Beispiel 8]. Mit einem Gemisch von 86 Teilen Aceton und-i4 Teilen
Wasser in Gegenwart von 0,005 °/o Blausäure erhält man zunächst ein Eluat,
das das nicht umgesetzte Ätiocobalamin enthält (174 opt. E., 610/, der Gesamtausbeute).
Mit einem Gemisch von 8o Teilen Aceton und 2o Teilen Wasser erhält man ein zweites
Eluat (I12 opt. E., 390/, der Gesamtausbeute), das den neuen biosynthetischen
Vitamin-.B12 Faktor enthält.
-
Dieses Eluat wird im Vakuum fest zur Trockne eingeengt, in Wasser
aufgenommen und mit p-Chlorphenol gefällt, wie im Schritt e) des Beispiels 8 beschrieben.
Nach der üblichen Behandlung des Kieselgurproduktes mit Aceton wird es mit einem
Gemisch von go Teilen Methanol und 1o Teilen Wasser extrahiert. Der Extrakt wird
im Vakuum zur Trockne verdampft, in 2 ccm Wasser aufgenommen und mit 4o ccm Aceton
versetzt. Nach mehrtägigem Stehen bei 3° C kristallisiert das neue B12 Analoge in
bis zu i cm langen Nadeln aus. Die Ausbeute beträgt 4,8 mg an 5, 6-Dichlorbenzimidazol-cobalamin.
Beispiel 12 Die Züchtung der Bakterienmasse und Überführung in sterilen Phosphatpuffer
erfolgt wie im Beispiel 4. Dann werden 42 opt.E. Ätiocobalamin und 3 mg d-Ribose
zugesetzt. Als Benzimidazol-Derivate werden verwendet: Entweder 1,5 mg 2-Oxymethyl-benzimidazol
oder 1,5 mg Benzimidazol-2-carbonsäure oder 1,5 mg Benzimidazol-2-carbonsäureamid:
Danach wird, wie im Beispiel 4 beschrieben, 24 Stunden bei 37° C behandelt. Die
weitere Aufarbeitung und schließliche Chromatographie an Zellulosesäulen erfolgt
im Prinzip in der gleichen Weise wie im Beispiel 4. Nach Abwandern der ersten; violetten
Zone, die sich als nicht umgesetztes Ätiocobalamin erweist, wird in allen drei Fällen
eine zweite,- rote Zone vom R-Wert o,18 bis o,2o erhalten. Nach Überführung in Wasser
liegt der neue B12 Faktor in reiner Form jeweils in einer Menge von 2,6 bis 6 opt.
E. vor, Dessen Eigenschaften sprechen in allen drei Fällen dafür, daß Benzimidazol-cobalamin
vorliegt, es sind demnach in allen drei Fällen die am C2 Atom des angewendeten Benzimidazolderivates
vorhandenen Gruppen abgespalten worden (Eigenschaften vgl. Tabelle). Beispiel 13
Es wird in der gleichen Weise vorgegangen wie im vorangehenden Beispiel, nur mit
dem Unterschied, daß als Benzimidazolderivate 5-Methyl-2-oxymethylbenzimidazol oder
5-Methylbenzimidazol-2-cärbonsäure oder 5-Methylbenzinüdazol-2-carbönsäureamid (je
1,5 mg) verwendet werden. Die Aufarbeitung und Chromatographie erfolgt . gleichfalls
wie zuvor beschrieben. Auch hier wird. zunächst eine Fraktion erhalten, die sich
als nicht umgesetztes Ätiocobalamin erweist.. Darauf folgt in allen drei Fällen
eine rote Zone vom R-Wert 0,23._ Nach Überführung in Wasser liegt in allen drei
Fällen der biosynthetisch entstandene B12 Faktor in reiner Form vor, -und zwar jeweils
in einer Menge.von etwa 2 opt. E. ; nur im Falle der 5-Methylbenzimidazol-2-carbonsäute
beträgt die Ausbeute 17,6 opt.E. Die Eigenschaften dieses B"-
Faktors
sprechen in allen drei Fällen dafür, daß 5-Methylbenzimidazol-cobalamin gebildet
worden ist. Auch in diesen Fällen ist daher die jeweilige am C. -Atom der angewendeten
Benzimidazolderivate vorhandene Gruppe abgespalten worden (Eigenschaften vgl. Tabelle).
-
Beispiel =4 Es wird in der gleichen Weise vorgegangen wie im Beispiel
=2, nur mit dem Unterschied, daß als Benzimidazolderivate je =,5 mg 5, 6-Dimethyl-2-oxymethylbenzimidazol
oder 5, 6-Dimethylbenzimidazol-2-carbonsäure oder 5, 6-Dimethylbenzimidazol-2-carbonsäureamid
verwendet werden.
-
Die Aufarbeitung und Chromatographie erfolgt gleichfalls wie im Beispiel
=2. Nach der Abwanderung des nicht umgesetzten Ätiocobalamins .folgt in allen drei
Fällen eine rote Zone vom R-Wert o,27 bis o,28. Nach Überführung.in Wasser liegt
in allen drei Fällen der gleiche biosynthetisch entstandene B12 Faktor in reiner
Form vor, und zwar in einer Menge von 3 bis 3,7 opt. E. Die Eigenschaften dieses
B12-Faktors zeigen in allen drei Fällen, daß 5, 6-DimethylbenziTnidazolcobalamin
vorliegt. Auch in diesen Fällen ist daher die jeweilige am CZ Atom der angewendeten
Benzimidazolderivate vorhandene Gruppe abgespalten worden (Eigenschaften vgl. Tabelle).
Beispiel =5 Es wird ebenso vorgegangen wie im Beispiel =2, nur mit dem Unterschied,
daß als Benzimidazolderivat =,5 mg 5-Methylbenzimidazol-2, 6-dicarbonsäurearnid
verwendet wird. Die Aufarbeitung und Chromatographie erfolgt ebenso wie im Beispiel
=2. Nach der Abwanderung des nicht umgesetzten Ätiocobalamins erhält man eine ganz
schwache rote Zone vom R-Wert o,26; sodann eine stärkere rote Zone vom R-Wert 0,4
und schließlich eine violette Zone vom R-Wert 0,o6. Die Zone mit dem R-Wert 0,i4
stellt den neuen B12 Faktor vor. Nach Überführung in Wasser liegt dieser in einer
Ausbeute von 2, x opt. E. in reiner Form vor (Eigenschaften vgl. Tabelle).
-
Beispiel 16 Es wird ebenso vorgegangen wie im Beispiel =2, nur mit
dem Unterschied, daß =,5 mg i, 2-Diamino-3, 4-dimethylbenzol verwendet wird. Die
Aufarbeitung und Chromatographie erfolgt ebenso wie im Beispiel =2. Nach der Abwanderung
des nicht umgesetzten Ätiocobalarnins erhält man eine zweite, violettrotgefärbte
Zone vom R-Wert
0,27. Diese enthält den biosynthetisch entstandenen Vitamin-B12-Faktor,
der nach Überführung in Wasser in einer Menge von 2,35 opt.E. vorliegt (Eigenschaften
vgl. Tabelle).
| Tabelle |
| Biosynthese von Vitamin-B" Faktoren durch Einwirkung von E.
coli-Stamm I auf Äticcobalamin und einen |
| »precursora der Benzimidazol-Reihe bzw. o-Phenylendiamin-Reihe
in Gegenwart von d-Ribose und Phosphat |
| Ausbeute in opt. Einheiten) Biosynthetische Vitamin Bl$-Faktoren |
| Verteilungskoeff. x |
| Precursor Aüocobal- biosynth, sonstige= im System |
| amin komplette . Bn- R-Wert mit Wert A . B |
| unverbraucht B12-Fakt. Faktoren a/o p-Chlor- % Ammon- |
| a I b c Phenol sulfat |
| 5, 6-Dimethylbenzimidazol... 3,86 19,4 0,25 0,27
o,28 7,8 24,0 |
| 5-Methylbenzimidazol....... 0,25 0,27 8,6 28,0 |
| Benzimidazol.............. 0,i7 0,27 9#4 340 |
| 4, 6-Dimethylbenzimidazol... 28,9 1o,8 0,29 0,28 8,o
25,0 |
| 5, 6-Diäthylbenzimidazol .... 220,0 i18,0 0,44 0,34
6,9 16,o |
| 5-Chlor-6-methylbenzimidazol ig,o 3,64 0,46 0,31 7,9 22,5 |
| 5, 6-Dichlorbenzünidazol .... 3,9 18,9 0,53, 0,34 19,5 |
| Benzimidazol-5-carbonsäure- |
| amid ................... 138,0 24,0 0,11 0,21
39,0 |
| 138,o 12,0 0,o6 0,20 12,7 43,0 |
| 2-Oxymethylbenzimidazol ... 21,8 = bis 2 2,5 0,20 (30) |
| Benzimidazol-2-carbonsäure . =5,45 6,3 o,ig o,18
0,27 31,o |
| Benzimidazol-2-carbonsäure- |
| amid ................... 15,30 1 bis 2 2,6 o,ig o,ig (30) |
| 5-Methyl-2-oxymethylbenz- |
| imidazol ................ =3,75 1 bis 2 9,7 +1,85 0,23
(27) |
| 5-Methylbenzimidazol-2-car- |
| Bonsäure ........ . . . . . . . =0,5 17,6 1,15 0,20
0,23 0,27 28,0 |
| 5-Methylbenzimidazoi-2-car- |
| bonsäureamid ............ 12,7 = bis 2 5,95+2,0
0,20_ 0,23 (27) |
| 5, 6-Dimethyl-2-oxymethyl- |
| benzimidazol ............ 16,5 1 bis 2 --,75+3,1 o,27 |
Ausbeute in opt. Einheiten) Biosynthetische Vitamin BR-Faktoren
-Verteilungskoeff. i Precursor Atiocobal- biosynth. sonstige Rf im System amin komplette
B12- R-Wert mit -Wert A B unverbraucht BR-Fakt. Faktoren % Ammon-'
a i
b c 10/0p-Chlor- phenol sulfat 5, 6-Dimethylbenzimidazol-2-carbonsäure-............
17,2 3,0 3,4 +2,4
0,23 o,28 o,28 24,5 5, 6-Dimethylbenzimidazol-2-carbonsäureamid
....... 13,6 3,73 6,5 -i--2,0
0,25 0,27 0,27 24,0 5-Methylbenzimidazol-2,
6-dicarbonsäureamid....
20,5 2,1 6,8 0,14 0,17 42,0 1, 2-Diamino-4, 5-dimethylbenzol..................
11,2 11,0
0,25 0,27 0,28 7,8 24,0 1, 2-Diamino-3, 4-dimethylbenzol..................
26,4 2,35 1,5 o,27 0,31:
23,0
Anmerkungen: a = n-Butanol, gesättigt mit Wasser
+ o,oo5 °/a H CN, b =sec. Butanol mit 23 °/o Wasser + o,oi % H CN, c = sec. Butanol,
gesättigt mit Wasser -f- o,oi °/oHCN, A = p-Chlorphenol in Trichloräthylen - Wasser,
B - n-Butanol -Wasser -;- Ammonsulfat.
-
* Nach der chromatographischen Trennung, ausgedrückt in optischen
Einheiten, _gemessen bei 361 mß (komplette Bi,-Faktoren) bzw. 367 mß (inkomplette
BR-Faktoren). Fig. 1: Ochromonas-Test mit Benzimidazol-cobalaminen.
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Fig. 2: Antiperniziöse Wirksamkeit des 5-Methylbenzimidazol-cobalamins
(bei intramuskulärer Injektion von 6o Gamma).
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Fig. 3 : Verteilungschromatographie des im Beispiel 1 (biosynthetischer
Versuch mit Benzimidazol) gewonnenen Konzentrates an einer Zellulose-Pulver-n-Butanol-Wasser-Säule,
enthaltend Cyanid-Ionen:
| ----- Vitanün-B12 Faktor I, Extinktion ge- |
| messen bei 368 m,u, |
| Benzimidazol-cobalamin, Extinktion |
| gemessen bei 361 mu. |
| Fig. 4: Verteilungschromatographie des im Beispiel e |
| (biosynthetischer Versuch mit 5-Methylbenzimidazöl) |
| gewonnenen Konzentrates. Chromatographiersäule |
| wie in Fig. 3: |
| ----- Vitamin-Bi,-Faktor I, Extinktion ge- |
| messen bei 368 mu, |
| 5-Methyl-benzimidazol-cobalamin, Ex- |
| tinktion gemessen bei 361 my. |