DE2708356C3 - Medium zur Bestimmung von E.Coli - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Medium zur selektiven Identifizierung von Escherichia coli.

Das erfindungsgemäße Medium ist ein zur Verwendung mit den optischen Analysensystemen bestimmtes Medium. Solche Systeme benutzen vorzugsweise Mechanismen und Apparaturen, die zum Analysieren von Proben für spezielle Mikroorganismen unter Verwendungeiner Plastikschale oder -karte geeignet sind, welche eine Reihe von getrockneten, in gesonderten, jedoch untereinander verbundenen Vertiefungen befindlichen Kulturmedien enthalten, wobei jedes Medium für einen einzelnen Organismus spezifisch ist. Wenn die Probe in die Karte gesetzt, mit dem Medium in den Vertiefungen gemischt und in der Vorrichtung inkubiert wird, tritt der Organismus (oder die Organismen), der in den Proben vorliegt, mit dem Kulturmedium, das für jenen Organismus spezifisch ist, in Wechselwirkung und ruft eine Änderung im Medium hervor, die von der Apparatur abgelesen wird, um das Vorliegen jenes Organismus anzuzeigen. Die Änderung im Medium schließt eine Änderung der Lichtdurchlässigkeitseigenschaften des Mediums ein, d. h. eine Farbänderung oder eine Änderung in der Trübe. Die Änderung kann verursacht sein durch eine mctabolische Aktivität des Organismus, welche /. H. eine Erzeugung von Säure und eine Änderung im pH bedingen kann, die eine Farbänderung bei einem pH-empfindlichen Indikator im Medium hervorrufen können. Die Änderung in den Lichtdiirchlässigkcilseigenscbaften des Mediums könnte auch verursacht sein durch eine Niederschlagbildung im Medium infolge metabolischer Aktivität des Organismus, oder sie könnte durch Wachstum des Organismus hervor gerufen werden.

Die spezifischen Medien, die zur Verwendung in den vorgenannten Karten bestimmt sind, dienen alle der Begünstigung des Wachstums eines Mikroorganismus und der Inhibierung des Wachstums der ande- ren Organismen, können gefriergetrocknet werden und in der geringen O₂-Umgebung der Vertiefungen der Karte funktionieren.

Das Medium dieser Erfindung ist dazu vorgesehen, das Wachstum des gramnegativen Bacteriums Esche richia coli zu fördern. Es enthält Zuckerquellen, die * selektiv durch E. coli unter Erzeugung von Säuren fermentiert werden, und des weiteren enthält es einen pH-empfindlichen Indikator, reduziertes Anilin-Blau, welcher von einer Idaren zu einer blauen Farbe unter

-0 Ansprechen auf die durch diese Säureproduktion hervorgerufene Änderung im pH umschlägt. Das Medium enthält auch eine Kombination von Inhibitoren anderer gramnegativer Organismen, hauptsächlich Klebsieila. Die Inhibitorkombination umfaßt Cumar säure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und Saponin. Diese Kombination inhibiert Kiebsiella und erlaubt das Wachstum von E. coli. Das Medium enthält auch grenzflächenaktive Stoffe als Inhibitoren für grampositive Organismen.

Das erfindungsgemäße Medium ist im Patentanspruch angegeben. Eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mediums nennt der Patentanspruch 2.

Zum technischen Portschritt wird ausgeführt: Das

Medium der Erfindung bringt gegenüber den bekannten Nährmedien Lackmus-Lactose-Agar nach Drigalski-Conradi, Methylrot-Voges-Proskauer-Bouillon und Gentianaviolett-Galle-Lactose-Bouillon nach Kessler-Swenarton eine wesentliche Bereicherung der Biotechnik. Die genannten Medien sind Differenzierungsmedien. Lackmus-Lactose-Agar gestattet, Lactose-Fermenter rosa und Nichtlactose-Fermenter farblos zu züchten, ähnlich dem MacConkeys-Agar. MRVP-Bouillon und Gentianaviolett-Galle-Lactose-Bouillon werden zur Identifizierung und/oder Selektierung einer großen Gruppe von Bakterien verwendet. Die Ergebnisse eines dieser beiden Medien allein entsprechen jedoch nicht einer positiven Identifizierung von H. eoli, da tatsachlich keines der Medien

ίο selektiv ist für das Wachstum von E. coli allein, sondern, wenn das Medium mit gemischten Speziesformen inokuliert wird, wachsen viele Spezies gramncgativer Stämme. Die Medien eignen sich daher nicht als positive Idcntifi/iciungsmcdicn tür gemischte Roh-

V) spezies. Insbesondere gestattet Lackmus-l.actose-Agar zwar die Identifizierung l.uctose-positiver Organismen, aber der Mikrobiologe könnte /. I). damit nicht E. coli neben Hnterobactcr identifizieren Auch Lactose-negative E. coli könnten nicht identifiziert

M) werden, wogegen E. coli im erfindungsgemaßen Medium identifiziert wird. Die MRVP-Bouillon kann Kiebsiella Enterobactcr-Gruppen von H. coli trennen, jedoch ist hierzu eine reine Kultur erforderlieh, wogegen das erfindungsgemäUe Medium E. eoli auch in

in Mischkulturen identifizieren kann. Gen. Violett-Galle-Lactose-Douillon ist etwas selektiver als E. coli, aber Spezies aus der Klebsiella/Hnterobacler-Ciruppe wurden ebenfalls darin wachsen, so daß wiederum

eine reine Kultur zur positiven Identifizierung des Organismus erforderlich ist. Insofern ist das erfindungsgemäße E. coli-Mediura einzigartig, da es E. coli in Mischkulturen identifizieren kann und die Resultate in 4 bis 12 Stunden nach Inokulierung'verfügbar sind. Das erfindungsgemäße Medium besitzt auch die Fähigkeit, Lactose-negative E. coli-Stämme positiv zu identifizieren, was mit den beiden bekannten Medien, die Lactose als Zuckerquelle enthalten, nicht möglich ist. ίο

Die meisten Stämme von E. coli fermentieren Lactose unter Erzeugung einer Säure. L-Arabinose wird in dem Detektionsmedium verwendet, weil es durch weniger als 10% der Stämme von E. coli fermentiert werden kann, dis Lactose nicht so schnell fermentiere η können. Daher zeigt dieses Medium, wenn die Kombination der Zucker verwendet wird, alle Stämme von E. coli an.

Wachstumsinhibitoren für gramnegative Organismen sind dem Fachmann bekannt.

Eine Kombination von 3,4-Dihydroxybenzoesäure, Saponin und para-Cumarsäure wird verwendet, um das Wachstum von Klebsieila und anderer coliform- -ähnlicher Organismen zu inhibieren. Die ortho- und meta-Form der Cumarsäure inhibieren nicht so wirksam wie die para-Form coliform-ähnliche Organismen.

Das in dem erfindungsgemäßen Medium zu verwendende reduzierte Anilin-Blau ist ein pH-Indikator, der einer Farbänderung bei einem pH von etwa μ 6,8 bis 7,0 unterliegt.

Das pH des Mediums sollte vor Einsatz bei 7,5 gehalten werden.

Herstellung der E. coli-Brühe

100 ml doppelt starkes Medium werden hergestellt durch Mischen von 0,2 g p-Cumarsäure und 0,2 g 3,4-Dihydroxybenzoesäure mit 3 ml In NaOH/100 ml Medium mit V₄ des erforderlichen Volumens an destilliertem Wasser. Dieses Gemisch wird erwärmt, bis alle Feststoffe in Lösung gegangen sind. Die Lösung wird auf 95 ml mit destilliertem Wasser gebracht und mit 1,0 g Stickstoffquelle, 1,0 g Lactose, 1,0 g L-Arabinose, 0,6 g Wachstumsinhibitor für gramnegative Organismen und 0,2 g Hefeextrakt versetzt. Das pH wird auf 6,2 eingestellt und 5 ml reduziertes Anilin-Blau, dem 0,2 g Saponin zugegeben sind, werden hinzugesetzt. Das pH wird bestimmt und durch Zusetzen einer Base auf 7,5 korrigiert, wenn dies erforderlich ist. Die Lösung wird filtersterilisiert, in einen sterilen Behälter gesetzt und etikettiert.

Operation

Das doppeltstarke Medium, das wie oben hergestellt worden ist, wird verwendet. Die Präparation wird in die Vertiefungen der Urinprüfungskarte gefüllt und gefriergertrocknet; die Karte wird zum Schütze des Mediums mit einem Band abgedeckt. Die Menge des doppeltstarken Mediums ist einer Hälfte des Volumens der Vertiefung äquivalent. Wenn daher das restliche Volumen der Vertiefung mit einer Urinprobe gefüllt wird, wird das Medium auf normale Konzentration einfacher Stärke rehydratisiert; bei dieser Konzentration ist es funktionsfähig.

Dieses Medium bestimmt eine Konzentration von E. coli von 1ܳ Zellen/ml in 12 Stunden. Für niedrigere Konzentrationen sind etwas längere Detektionszeiten erforderlich.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Medium zur selektiven Identifizierung von E. coli, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter enthält:

a) 0,05 bis 1,SO Gramm para-Cumarsäure,

b) 0,05 bis 1,50 Gramm 3,4-Dihydroxibenzoesäure,

c) 0,75 bis 1,25 Gramm Saponin,

d) 4,0 bis 6,0 Gramm Lactose,

e) 4,0 bis 6,0 Gramm L-Arabinose,

f) 6,0 Gramm Stickstoff quelle,

g) 0,75 bis 1,25 Gramm Hefeextrakt,

h) 1,5 bis 4,5 Gramm Wachstumsinhibitor für

grampositive Organismen, i) 15 bis 35 ml reduziertes Anilinblau und j) destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter.

2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter enthält:

a) 1 Gramm para-Cumarsäure,

b) 1 Gramm 3,4-Dihydroxibenzoesäure,

c) 1 Gramm Saponin,

d) 5 Gramm Lactose,

e) 5 Gramm L-Arabinose,

f) 5 Gramm Stickstoff quelle,

g) 1 Gramm Hefeextrakt,

h) 3 Gramm Wachstumsinhibitor für grampositive Organismen,

i) 25 ml reduziertes Anilinblau und j) destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter.