DE2708356A1 - Medium zur bestimmung von e.coli und klinischen verwendung mit einem automatisierten mikrobenanalysator - Google Patents

Medium zur bestimmung von e.coli und klinischen verwendung mit einem automatisierten mikrobenanalysator

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DE2708356A1 DE19772708356 DE2708356A DE2708356A1 DE 2708356 A1 DE2708356 A1 DE 2708356A1 DE 19772708356 DE19772708356 DE 19772708356 DE 2708356 A DE2708356 A DE 2708356A DE 2708356 A1 DE2708356 A1 DE 2708356A1
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Description

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SMB* PATENTANWÄLTE
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M 3775
McDonnell Douglas Corporation, Long Beach, California, V.St.A.
Medium zur Bestimmung von E,CoIi und klinischen Verwendung mit einem automatisierten Mikrobenanalysator
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Mikrobenanalyse und insbesondere ein Medium für Bestimmungen und zur Identifizierung von Escherichia coli (E.coli) in Urinproben.
Das erfindungsgemäße Medium ist ein zur Verwendung mit den optischen Analysensystemen bestimmtes verbessertes Medium. Solche Systeme benutzen vorzugsweise Mechanismen und Apparaturen, die zum Analysieren von Proben für spezielle Mikroorganismen unter Verwendung einer Plastikschale oder -karte geeignet sind, welche
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eine Reihe von getrockneten, in gesonderten, jedoch untereinander verbundenen Vertiefungen befindlichen Kulturmedien enthalten, wobei jedes Medium für einen einzelnen Organismus spezifisch ist. Wenn die Probe in die Karte gesetzt, mit dem Medium in den Vertiefungen gemischt und in der Vorrichtung inkubiert wird, tritt der Organismus (oder die Organismen), der in den Proben vorliegt, mit deir Kulturmedium, das für jenen Organismus spezifisch ist, in Wechselwirkung und ruft eine Änderung im Medium hervor, die von der Apparatur abgelesen wird, um das Vorliegen jenes Organismus anzuzeigen. Die Änderung im Medium schließt eine Änderung der Lichtdurchlässigkeitseigenschaften des Mediums ein, d.h. eine ' Farbänderung oder eine Änderung in der Trübe. Die Änderung kann : verursacht sein durch eine metabolische Aktivität des Organismus, : welche z.3. eine Erzeugung von Säure und eine Änderung im pH ; bedingen kann, die eine Farbänderung bei einem pH-empfindlichen
! Indikator im Medium hervorrufen können. Die Änderung in den Licht-• durchlässigkeitseigenschaften des Mediums könnte auch verursacht j sein durch eine Niederschlagbildung im Medium infolge metabolischer Aktivität des Organismus oder sie könnte durch Wachstum des Organismus hervorgerufen werden.
Die spezifischen Medien, die zur Verwendung in den vorgenannten Karten bestimmt sind, dienen alle der Begünstigung des Wachstums eine 3 I-Iikroorganisnus und der Inhibierung de3 Wachstums der anderen Organismen, können rrefriergctrocknet werden und in der ge-
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ORIGINAL INSPECTED
ringen Op-Umgebung der Vertiefungen der Karte funktionieren.
Das Medium dieser Erfindung ist dazu vorgesehen, das Wachstum des granmegativen Bacteriums Escherichia coli (B.coli) zu fördern. Es enthält Zuckerquellen, die selektiv durch E.coli unter Erzeugung τοπ Säuren fermentiert werden, und des weiteren enthält es einen pH-empfindlichen Indikator, reduziertes Anilin-Blau, welcher von einer klaren zu einer blauen Farbe unter Ansprechen auf die durch diese Säursproduktion hervorgerufene Änderung im pH umschlägt. Das Medium enthält auch eine Kombination von Inhibitoren anderer gramnegativer Organismen, hauptsächlich Klebsiella. Die Inhibitorkombination umfaßt Cumarsäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und Saponin. Diese Kombination inhibiert Klebsiella und erlaubt das Wachstum von E.coli. Das Medium enthält auch grenzflächenaktive Stoffe als Inhibitoren für graiapositive Organismen.
Das Medium der vorliegenden Erfindung verwendet Nährstoffquellen, die für die Produktion von E.coli günstig sind, einen biologischen pH-Indikator, der auf Säureproduktion durch E.coli anspricht, und eine Kombination von para-Cumarsäure, Saponin und 3,4-Dihydroxybenzoesäure, um das Wachstum von Klebsiella zu inhibieren und auch andere Inhibitoren, um das Wachstum grampositiver Mikroorganismen zu inhibieren.
Das Detektionsmedium der vorliegenden Erfindung enthält pro
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Liter etwa 15,1 g bis 28,0 g Nährstoffe, etwa 15 ml bis etwa 35 ml eines Indikators, der die Erzeugung von Säure durch den B.coil-Organismus anzeigt, etwa 1,5 g bis etwa 4,5 g ober- bzw. grenzflächenaktive Mittel, um das Wachstum grampositiver Orga nismen zu inhibieren, und etwa 0,05 g bis etwa 1,5 g p-Cumarsäu- re, etwa 0,05 g bis etwa 1,5 g 3,4-Dihydroxybenzoesäure, etwa 0,75 g bis etwa 1,25 g Saponin, welche in Kombination das Wachs tum anderer coliform-ähnlicher Organismen (hauptsächlich Klebsieila) inhibieren, die normalerweise positive Ergebnisse in E.coli-Tests liefern.
Der Nährstoffteil des Mediums enthält vorzugsweise etwa 4,0 bis etwa 6,0 g/l Lactose, etwa 4,0 bis etwa 6,0 g/l L-Arabinose und etwa 4^0 bis etwa 6,0 g/l Gelysat und etwa 0,75 bis etwa 1,25 g Hefeextrakt.
Gelysat wird durch BBL hergestellt und ist ein Gelatinehydrolysat, das durch pankreatische Verdauung gebildet wird und sich durch einen niedrigen Cystin- und Tryptophangehalt auszeichnet. Es ist ein konventionell zugängliches Material des Handels, das gewöhnlich in Medien verwendet wird.
Die meisten Stämme von E.coil fermentieren Lactose unter Erzeugung einer Säure. L-Arabinose wird in dem Detektionsmedium verwendet, weil es durch weniger als 10 % der Stämme von E.coil fermentiert werden kann, die Lactose nicht so schnell fermen-
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tieren können. Daher zeigt dieses Medium, wenn die Kombination der Zucker verwendet wird, alle Stämme von E.coli an.
Geeignete Substitutmaterialien für Gelysat sind Trypticase, Phyton und Polypepton.
Das Bile Salts Mixture, erhältlich von BBL, wird verwendet, um das Wachstum grampositiver Organismen zu inhibieren. Das Bile Salts Mixture enthält Gallenextrakte und ist ein Gemisch von oberflächenaktiven Mitteln, die grampositive Organismen wie Bacillus species inhibieren. Andere geeignete oberflächenaktive Mittel sind z.B. Bile Salts No. 3 Taurocholic Acid usw.. Bile Salts Mixture ist ein im Handel erhältliches Material, das gewöhnlich in Medien zur Inhibierung grampositiver Organismen verwendet wird.
Eine Kombination von 3»4-Dihydroxybenzoesäure, Saponin und para- -Cumarsäure wird verwendet, um das Wachstum von Klebsiella und anderer coliform-ähnlicher Organismen zu inhibieren. Die ortho- und meta-Form der Cumarsäure können ebenfalls verwendet werden. Diese Formen inhibieren jedoch nicht so wirksam wie die para-Form coliform-ähnliche Organismen.
In der schwebenden Anmeldung vom (Ralph A.
Wilkinson) mit der Bezeichnung "E.coli Detection Broth" wird ein Medium zur Detektion von E.coli geoffenbart, welches nur
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: Cumarsäure als Inhibitor enthält. Es wurde festgestellt, daß, wenn ein Geraisch von Organismen zugegen ist, d.h. E.coli und Klebsiella. ein nicht ganz verständliches Phänomen auftritt. Unter diesen Umständen inhibiert die Gumarsäure das Wachstum sowohl von Klebsiella als auch E.coli. Es wird postuliert, daß Klebsiella die Cumarsäure in Verbindungen umwandelt, welche auch E.coli inhibieren. Durch Zusatz des Saponins und der 3,4-Dihydroxybenzoesäure wird dieser Effekt vermieden und nur Klebsiella inhibiert, während E.coli wachsen und metabolisch auf Lactose und L-Arabinose einwirken kann.
Der in diesen Detektionsmedium zu verwendende Indikator ist ein biologischer pH-Indikator, der einer Farbänderung bei einem pH von etwa 6,3 bis 7,0 unterliegt. Reduziertes Anilin-Blau ist der bevorzugte Indikator, da dieser Indikator einer Farbänderung von klar nach blau unterliegt, die leicht feststellbar ist durch die Mechanismen, die in der Anmeldung vom der Bezeichnung "Automated Ilicrobial Analyzer" beschrieben werden. Wenn
Anilin-Blau nach den Verfahren der Anmeldung von Clifton
Aldridge und Michael Meyer mit der Bezeichnung "Sensitive pH Indicator" vom gleichen Datum reduziert wird, erhält man eine stabile oder klare Flüssigkeit, die bei pH 6,8 bis 7 blau wird. Es sind keine weiteren Indikatoren bekannt, die diesen Effekt bei diesem pH-Bereich zeigen.
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Hefeextrakt oder andere geeignete biologische Extrakte können auch als Vitaminquelle zugesetzt werden. Etwa 0,95 bis etwa 1|05 g/l Hefeextrakt können verwendet v/erden. Der Hefeextrakt ist von BBL erhältlich und stellt einen wasserlöslichen Extrakt von autolysierten Hefezellen dar. Solche Produkte sind aus verschiedenen Quellen im Handel erhältlich.
Das pH des Mediums sollte vor Einsatz bei 7,5 gehalten werden.
Herstellung der E.coli-Brühe
100 ml 2 x-Medium werden hergestellt durch Mischen von 0,2 g p-Cumarsäure und 0,2 g 3,4-Dihydroxybensoesäure mit 3 ml 1N NaOH/100 ml Medium mit 1/4 des erforderlichen Volumens an destilliertem Wasser. Dieses Gemisch wird erwärmt, bis alle Peststoffe in Lösung gegangen sind. Die Lösung wird auf 95 ml mit destilliertem Wasser gebracht (Q.S.) und mit 1,0 g Gelysat, 1,0 g Lactose, 1,0 g L-Arabinose, 0,6 g Bile Salts Mixture und 0,2 g Hefeextrakt versetzt. Das pH wird auf 6,2 eingestellt und 5 ml reduziertes Anilin-Blau, dem 0,2 g Saponin zugegeben sind, werden hinzugesetzt. Das pH wird bestimmt und durch Zusetzen einer Base auf 7,5 korrigiert, wenn dies erforderlich ist. Die Lösung wird filtersterilisiert, in einen sterilen Behälter gesetzt und etikettiert.
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Operation
Das doppeltstarke Medium, das wie oben hergestellt worden ist, wird verwendet. Die Präparation wird in die Vertiefungen der
Urinprüfungskarte gefüllt, die in der Anmeldung .· mit der
Bezeichnung "Automated Microbial Analyzer" beschrieben ist, gefriergetrocknet; die Karte wird zum Schütze des Mediums mit einem Band abgedeckt. Die Menge des doppeltstarken Mediums ist einer Hälfte des Volumens der Vertiefung äquivalent. Wenn daher das restliche Volumen der Vertiefung mit einer Urinprobe gefüllt wird, wird das Medium auf normale Konzentration einfacher Stärke rehydratisiert; bei dieser Konzentration ist es funktionsfähig.
Dieses Medium bestimmt Konzentration von E.coli von 10 Zellen/ /ml in 12 Stunden. PUr niedrigere Konzentrationen sind etwas längere Detektionszeiten erforderlich.
/■
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Claims (1)

  1. IBERLIN 33 I MÖNCHEN ··
    Pat-Aiw.Or. Ing. Rmchk· ur· KUOV^rIISC & ΓΛΚΙΙΝΕΚ
    SwAAf1*·· PATENTANWÄLTE
    T«i«fofi:am/ SSSn ReBtn» · M OwCh 6tt
    TELEX: IS27I7
    Quadratur BwOn
    TELEX: 1U7N
    M 3775
    IicDonnell Douglas Corporation, Long Beach, California, V.St.A. ί
    Kodiuii ;jvir Bostinanung von E.CoIi und klinischen Verwendung rät einem automatisierten Mükrobenanalysator
    Patentansprüche
    1. Mittel sur selektiven Identifizierung von S.coli aus einer ITährstoffquelle, einem Indikator zur Anzeige der Gegenv/art von LJ.coli-Organisraen und Mitteln zur Inhibierung des Wachstums anderer coliform-ähnlicher Organismen, welche normalerweise positive Ji'rgabnisse bei Tests auf E.coil liefern.
    2. Kittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
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    das Inhibierungsrüittel eine Kombination aus Cunarsäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und Saponin ist.
    : 5. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, uafi : das Inhibierungsmittel para-Cumarsäure aufweist.
    ι 4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge-
    kennzeichnet, daß das Inhibierungsaittel etwa 0,05 bis etwa 1,50 g/l para-Cumarsäure, etv/a 0,05 bis etwa 1,50 g/l 3,4-Dihydroxybenzoesäure und etwa 0,75 bis etwa 1,25 g/i Saponin enthält.
    5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet« daß der Indikator reduziertes Anilin-Blau ist.
    6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daS sich der Indikator von farblos nach blau ändert, wenn das pH von etwa 7,5 auf etwa 6,8 bis 7 fällt.
    7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Kombination aus Lactose und L-Arabinose als Nährstoffquelle enthält, die durch E.coli fermentiert werden.
    8. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter enthält:
    (a) etwa 0,05 bis etwa 1,50 g para-Cumarsäure
    (b) etwa 0,05 bis etwa 1,50 g 3,4-Dihydroxybensoesäure
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    (c) etv/a 0,75 "bis etwa 1,25 ε Saponin
    (d) etv/a 4,0 bis etv/a 6,0 g Lactose
    (e) etv/a 4,0 bis etv/a 6,0 g L-Arabinose
    (f) etwa 6,0 s Stickstoffquelle
    (g) etwa 0,75 bis etwa 1,25 g Hefeextrakt
    (h) etwa 1,5 bis etv/a 4,5 g grarrnositiven Inhibitor
    (i) etwa 15 bis etwa 35 nil biologischen pH-Indikator und
    (3) destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter.
    9. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter enthält:
    (a) etwa 1 g para-Cumarsäure
    (b) etwa 1 g 3,4-Dihydroxybenzoesäure
    (c) etwa 1 g Saponin
    (d) etv/a 5 g Lactose
    (e) etwa 5 g L-Arabinose
    (f) etwa 5 £ Stickstoffquelle
    j (g) etwa 1 g Hefeextrakt (h) etwa 3 S grampositiven Inhibitor (i) etwa 25 ml biologischen pH-Indikator und (j) destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 100 %.
    K 3775
    Ic/Di
    709845/0678
    ORIGINAL INSPECTED
DE2708356A 1976-05-03 1977-02-24 Medium zur Bestimmung von E.Coli Expired DE2708356C3 (de)

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