DE2833846C2

DE2833846C2 -

Info

Publication number: DE2833846C2
Application number: DE2833846A
Authority: DE
Inventors: Gordon Lee Dallas Tex. Us Dorn; Geoffrey Allison Denton Tex. Us Land
Original assignee: Jk And Susie L Wadley Research Institute And Blood Bank Dallas Tex Us
Current assignee: WADLEY TECHNOLOGIES, INC., DALLAS, TEX., US
Priority date: 1977-08-25
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1987-07-30
Also published as: US4144133A; FR2401222A1; AU3438378A; DE2833846A1; FR2401222B1; IT1102481B; GB1555449A; IT7848722A0; CH633314A5; CA1096758A; MX5811E; JPS5437816A; JPS624118B2; AU524139B2

Description

Die Erfindung betrifft das Kulturmedium gemäß Anspruch 1. Die Ansprüche 2 bis 6 nennen Ausgestaltungen dieses Kulturmediums. Im Anspruch 7 ist dann eine bestimmte Verwendung dieses Kulturmediums angegeben.

Unter normalen Bedingungen treten verschiedene Hefearten, d. h. einzellige Fungi, wie Saprophyten im Körper auf, die die normalen Körperfunktionen nicht beeinträchtigen, da das Pilzwachstum durch Bakterien kontrolliert wird, die normalerweise ebenfalls vorhanden sind. Wenn jedoch ein Patient aufgrund bakterieller Infektionen behandelt wird, z. B. durch die Verabfolgung antibaktieriell wirksamer Antibiotika, wird das normale Bakterien-Fungi-Gleichgewicht gestört und es kann tatsächlich zu einer Pilzinfektion kommen. An Krebs leidende Patienten sind für solche Pilzinfektionen besonders empfänglich, da ihnen eine Vielzahl antibakteriell wirksamer Arzneimittel verabfolgt wird und ihr Immunsystem nicht mehr intakt ist. Eine Pilzinfektion kann den Zustand eines Patienten äußerst rasch verschlechtern, vor allem, wenn er z. B. aufgrund bakterieller Infektionen ohnehin geschwächt ist. Solche Pilzinfektionen können sich in ernsthaften Erkrankungen, z. B. in Meningitis, niedergeschlagen.

Zwei der medizinisch wichtigsten Arten von Fungi sind Candiba albicans und Cryptococcus neoformans. Candida albicans ist ein Saprophyt, der sich im gastrointestinalen Trakt des Menschen befindet. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Hefe jedoch übergreifen und zu schwerwiegenden und gewöhnlich tödlichen Erkrankungen des geschwächten Patienten führen. Cryptococcus neoformans ist besonders wichtig, weil er das zentrale Nervensystem angreift, was zu schweren Erkrankungen eines biologisch abwehrschwachen Patienten führen kann.

Die vermutliche Identifizierung von Candida albicans hängt allein von morphologischen Veränderungen ab, die auftreten, wenn man diesen Fungus auf einem geeigneten Medium ausstreicht und ihn wachsen läßt. Die erste morphologische Veränderung, die die Gegenwart von Candida albicans anzeigt, besteht in der Bildung von Keimschläuchen, die als winzige Vorsprünge aus den ausgestrichenen, einzelligen Proben herausragen. Diese Keimschläuche wachsen unter Umständen zu verlängerten Fäden, die sich aus dem Körer von Candida albicans nach außen erstrecken. Die Bildung von Keimschläuchen innerhalb von zwei bis drei Stunden nach dem Ausstreichen des Fungus stellt ein vermutliches Anzeichen dafür dar, daß Candida albicans vorliegt. In einer zweiten Wachstumsstufe erscheinen im allgemeinen runde Körper an den Enden der Fäden. Diese runden Körper sind als Chlamydosporen bekannt. Nur zwei Arten von Candida-Gattungen bilden Chlamydosporen. Es handelt sich bei diesen um Candida albicans und Candida stellatoidea. Die Bildung von Chlamydosporen zeigt damit die Gegenwart von entweder Candida albicans oder Candida stellatoidea an.

Die Identifizierung von Cryptococcus neoformans ist im allgemeinen schwieriger als die Identifizierung von Candida albicans, da Cryptococcus neoformans keine morphologischen Veränderungen eingeht, die sich feststellen lassen, sondern während des Wachstums einzellig bleibt. Bis vor kurzem wurden ein oder mehrere von drei Grundtests oder eine Kombination dieser angewandt, um das Vorhandensein der Gattung Cryptococcus zu ermitteln. Eine dieser Identifizierungsmethoden umfaßt die mikroskopische Untersuchung einer Probe, um festzustellen, ob rund um die Zellen des Fungi eine kapselähnliche Anordnung entstanden ist. Um die Feststellung einer solchen kapselähnlichen Anordnung zu erleichtern, wird eine Probe mit chinesischer Tusche umgeben, die das Erscheinen der Kapsel insofern unterstützt, als ein klares und durchscheinendes Bild gegen den schwarzen Hintergrund entsteht, was die Identifizierung der Kapsel bei der mikroskopischen Untersuchung erleichtert. Eine zweite Methode zur Identifizierung der Gattung Cryptococcus besteht darin, daß man eine Probe auf einem Medium ausstreicht, das Harnstoff und einen Farbindikator enthält. Da Cryptococcus neoformans ein Enzym erzeugt, das als Urease bekannt ist, hat es die Fähigkeit, den Harnstoff abzubauen und den Stickstoff des Harnstoffs zu verwenden, wodurch der pH-Wert ansteigt und eine Farbänderung des Indikators eintritt. Damit zeigt das Wachstum auf einem harnstoffhaltigen Medium die Gegenwart von Cryptococcus neoformans an. Eine dritte Methode zur Identifizierung der Gattung Cryptococcus beruht auf der Fähigkeit dieser Gattung, eine stärkeähnliche Verbindung zu erzeugen. Wenn die stärkeähnliche Verbindung vorhanden ist, führt die Zugabe von Jod zu einem purpurfarbenen Ring, der rund um die Kolonie erscheint. Keine dieser Testmethoden ist jedoch spezifisch für Cryptococcus neoformans, weder allein noch in Kombination, da andere Arten der Gattung Cryptococcus und andere Hefegattungen ebenfalls eine positive Reaktion ergeben können.

Um daher die Art Cryptococcus neoformans identifizieren zu können, waren in der Vergangenheit zusätzliche Tests erforderlich. Diese umfassen die Bildung eines Wachstumsprofils einer Probe, wenn diese auf einer Reihe von Kohlehydrat enthaltenden Medien ausgestrichen wird. Zum Beispiel können bis zu 14 verschiedene Kohlehydratarten in Wachstumsmedien eingearbeitet werden. Nach 7 bis 21 Tagen entwickelt eine darauf ausgetrichene Probe ein Wachstumsprofil, das anzeigt, ob Cryptococcus neoformans in der Probe vorhanden war oder nicht. Eine andere Methode zur Identifizierung der Art besteht im Ausstreichen einer Probe auf einem Agarmedium, das Kreatinin enthält. Wenn innerhalb von 5 bis 8 Tagen wesentliches Wachstum beobachtet wird, zeigt dieses Wachstum die Gegenwart von Cryptococcus neoformans an, weil dieser Fungi Kreatinin zu assimilieren vermag. Jedoch haben auch andere Hefegattungen die Fähigkeit, auf Kreatinin zu wachsen, so daß dieser Test für Cryptococcus neoformans nicht spezifisch ist.

Wahrscheinlich die einzige erfolgreiche und spezifische herkömmliche Methode zum Nachweis von Cryptococcus neoformans besteht in der Verwendung von Vogelfutteragar. Man hat festgestellt, daß, wenn Cryptococcus neoformans in einer auf Vogelfutteragar ausgestrichenen Probe enthalten war, eine spezifische, verräterische braune Farbe erschien, wenn die Probe 5 Tage lang bis zwei Wochen auf dem Agar wuchs. Diese Methode wurde durch Verwendung eines Extraktes aus Vogelfutter verbessert, wodurch sich die Identifizierungszeit auf drei bis fünf Tage verringerte. Noch später hat man festgestellt, daß die braune Pigmentverfärbung auf der Umsetzung zwischen dem Enzym Phenoloxydase und einem spezifischen Substrat beruhte, das in Vogelfutteragar enthalten ist. Dementsprechend verkürzte die Verwendung substituierter Phenole, wie Kaffeesäure, im Kulturmedium die für die Identifizierung notwendige Zeit weiter auf etwa 48 Stunden. Eine weitere Verfeinerung der Verwendung von Kaffeesäure bei der Identifizierung von Cryptococcus neoformans ist in dem Aufsatz von Hopfer und Grosche, "Six Hour Pigmentation Tests for the Identification of Cryptococcus neoformans", Journal of Clinical Microbiology, August 1975, Band II, Nr. 2, Seite 96-98, beschrieben. Diese Verbesserung besteht in der Kombination der Kaffeesäure mit Ferricitrat und der Einarbeitung dieser Verbindungen in Papierscheiben, die als Substrate für die Phenoloxydase von Cryptococcus neoformans dienen. Die Verwendung dieser mit Kaffeesäure und Ferricitrat imprägnierten Papierscheiben verringerte die Identifizierungszeit nochmals, und zwar auf 3 bis 6 Stunden. Die für die Imprägnierung der Papierscheiben verwendete Lösung von Kaffeesäure und Ferricitrat ist jedoch ziemlich unbeständig, wenn sie Licht ausgesetzt wird und ist daher mit Lagerungsproblemen verbunden. Außerdem sind die Konzentrationen von Kaffeesäure und Ferricitrat kristisch, d. h. eine nicht-ausgeglichene Kombination erfordert längere Inkubationszeiten für die Erzeugung eines dunklen Pigments oder, in einigen Fällen, einer nicht-spezifischen Pigmentierung von Cryptococcusarten und verschiedenen Candida-Arten. Während ferner zwar die Identifizierungszeit auf 3 bis 6 Stunden verringert wurde, beginnend vom Zeitpunkt des Ausstreichens der Probe auf den Papierscheiben, mußte auf einem "Primärmedium" vorkultiviert werden, bevor auf den mit Ferricitrat und Kaffeesäure imprägnierten Scheiben ausgestrichen werden konnte.

Obwohl Candida albicans und Cryptococcus neoformans beide medizinisch wichtige Hefen darstellen, eignet sich kein herkömmliches Testverfahren oder Medium für die gleichzeitige Identifizierung beider Fungi. Vielmehr war es bisher notwendig, zwei Tests durchzuführen, einen auf die Gegenwart von Candida albicans und einen zweiten, z. B. einen der oben beschriebenen, zur Identifizierung von Cryptococcus neoformans.

Vor kurzem wurde nun ein neues Kulturmedium für die Identifizierung von Cryptococcus neoformans, Candida albicans und Candida stellatoidea entdeckt, das Kaffeesäure, Ochsengalle und ein Emulgiermittel enthält (Tweed 80). Dieses Medium ist von Fleming, Hopkins und Land in "New Culture Medium for the Presumptive Identification of Candida albicans and Cryptococcus neoformans", Journal of Clinical Microbiology, Februar 1977, Band V, Nr. 2, Seiten 236-243 beschrieben. Es eignet sich für die spezifische Identifizierung von sowohl Candida albicans als auch von Cryptococcus neoformans. Obzwar die Identifizierung von Cryptococcus neoformans langsamer vor sich geht als auf den mit Kaffeesäure und Ferricitrat imprägnierten Papierscheiben, hat die Verwendung des Tween 80 - Ochsengalle - Kaffeesäure- Mediums, das nachfolgend auch als TOC bezeichnet ist, bestimmte Vorteile, da es nicht lichtempfindlich ist und die Konzentrationen der Komponenten nicht in so kritischer Weise formuliert werden müssen, wie bei den Ferricitratscheiben. Der einzige Nachteil des TOC-Mediums ist, daß Candida krusei, eine fadenbildende Hefe, keine Pseudohyphen bildet. Während somit Candida albicans oder Candida stellatoidea durch die Bildung von Keimschläuchen innerhalb von drei Stunden nach dem Ausstreichen ermittelt werden können, kann die Gegenwart von Candida krusei unentdeckt bleiben, da selbst nach 24 Stunden auf dem TOC-Medium keine Fadenbildung eintritt. Obgleich die Lagerzeit des hergestellten TOC-Mediums gut ist, sie beträgt etwa 3 Wochen, ist eine längere Lagerbeständigkeit natürlich erwünscht. Da Tween 80 eine flüssige Zusammensetzung darstellt, eignet sich das TOC-Medium nicht zur Formulierung in einer vollständig dehydratisierten trockenen Pulverform, die bis zum Gebrauch in dieser Form gelagert werden kann. Dieses Medium kann jedoch in einem einzigen Test zur Identifizierung von Candida albicans, Candida stellatoidea und Cryptococcus neoformans verwendet werden.

Während somit eine Vielzahl von Methoden und Medien verwendet wurden, um verschiedene pathogene Fungi zu identifizieren und zu differenzieren, einschließlich der wichtigen Arten Candida albicans und Cryptococcus neoformans, besteht nach wie vor Bedarf an Kulturmedien für Fungi, die eine rasche Identifizierung und Differenzierung dieser Arten und anderer Fungi ermöglichen, verhältnismäßig leicht herzustellen und zu gebrauchen sind und eine verhältnismäßig lange Lagerbeständigkeit besitzen.

Die Erfindung stellt ein Kulturmedium für Fungi zur Verfügung, das die rasche und zuverlässige Identifizierung von Fungi ermöglicht, die unter bestimmten Bedingungen pathogen sein können, z. B. für Patienten, die Immunreaktionen unterdrückende Arzneimittel erhalten. Im Prinzip enthält das Kulturmedium gemäß der Erfindung Ochsengalle, gereinigtes Saponin, ein Phenoloxydasesubstrat und ein Trägermaterial. Das Phenoloxydasesubstrat, vorzugsweise Kaffeesäure, ermöglicht die spezifische Identifizierung von Cryptococcus neoformans durch die charakteristische braune Pigmentierung, die aus der spezifischen Enzymwirkung von Cryptococcus neoformans auf das Phenoloxydasesubstrat resultiert. Es wurde auch gefunden, daß die Ochsengalle, außer ihrer bekannten Wirkung, nichtpathogene Oganismen zu unterdrücken, die Farbbildung und die Chlamydosporenerzeugung der medizinisch wichtigen Fungi Candida albicans und Candida stellatoidea fördert. Das in den Kulturmedien verwendete gereinigte Saponin verstärkt wesentlich die braune Pigmentierng von Cryptococcus neoformans und fördert die Bildung der Keimschläuche und die Chlamydosporenerzeugung von Candida albicans und Candida stellatoidea, so daß eine extrem rasche Identifizierung dieser besonders gefährlichen pathogenen Fungi möglich wird. Das Trägermaterial für die beschriebenen Wirkstoffe bilden z. B. gewöhnlicher Agar oder Silicagele.

Das erfindungsgemäße Medium stellt ein ausgezeichnetes Differenziurungsmedium für die Identifizierung von zwei der medizinisch wichtigsten Arten potentieller pathogener Fungi dar. Dieses Medium ist spezifisch für die Identifizierung von Cryptococcus neoformans und zeigt rasch die Gegenwart der Arten albicans oder stellatoidea der Gattung Candida an. Die Differenzierung zwischen diesen beiden Candidaarten kann dadurch bewirkt werden, daß man einen weiteren herkömmlichen Differenzierungstest anschließt, z. B. einen Assimilierungstest für den Zucker Saccharose, in dem Candida albicans Saccharose assimiliert, Candida stellatoidea jedoch nicht. Außerdem ist das Kulturmedium gemäß der Erfindung für die Identifizierung anderer Gattungen von fadenbildenden Hefen brauchbar, wobei die charakteristische Morphologie und die Pigmentierung der Hefen erhalten bleibt. Zum Beispiel bleiben Candida krusei und Candida tropicalis auf den erfindungsgemäßen Medien weiße fadenbildende Hefen.

Der Hauptvorteil der erfindungsgemäßen Differenzierungsmedien besteht darin, daß sie die rasche und spezifische Identifizierung von Cryptococcus neoformans und Candida albicans ermöglichen. Cryptococcus neoformans läßt sich in 3 bis 6 Stunden, nachdem die Probe auf das Medium aufgebracht wurde, identifizieren, und zwar durch die braune Pigmentierung, die innerhalb dieser Zeit mit dem bloßen Auge wahrgenommen werden kann. Candida albicans oder Candida stellatoidea können innerhalb von etwa 3 bis etwa 18 Stunden nach dem Ausstreichen aufgrund der Keimschläuche und Chlamydosporen mikroskopisch sichtbar gemacht werden. Da nur die Arten albicans und stellatoidea der Gattung Candida Keimschläuche und Chlamydosporen bilden, genügt ein einziger herkömmlicher Differenzierungstest, um festzustellen, welche der beiden Arten vorliegt.

Es wurde gefunden, daß eine Kombination von drei Wirkstoffen angewandt werden kann, zusammen mit einem Trägermaterial, wie z. B. Agar, um die oben beschriebenen erwünschten Ergebnisse zu erzielen. Ochsengalle, ein Derivat einer Substanz, die in der Gallenblase von Ochsen gefunden wird, wird angewandt, um das Wachstum der Fäden und Chlamydosporen von Candida albicans und stellatoidea zu fördern. Ein zweiter Wirkstoff, wie Kaffeesäure oder ein anderes Substrat für Phenoloxydase, wird als Identifizierungsmittel für Cryptococcus neoformans eingesetzt, da die Umsetzung zwischen der Phenoloxydase des Fungus und dem Substrat eine bräunliche Pigmentierung erzeugt, die für Cryptococcus neoformans spezifisch ist. Der dritte Wirkstoff im erfindungsgemäßen Kulturmedium ist gereinigtes Saponin. Im allgemeinen stellen Saponine Glycoside dar, die in Pflanzen weitverbreitet sind, Öl-in-Wasser-Emulsionen zu bilden vermögen und als Schutzkolloide wirken. Jedes Saponinmolekül besteht aus einem Sapogenin, das den Agluconanteil des Moleküls bildet, und Zucker. Es ist wichtig, daß nur gereinigte Saponine verwendet werden können, wenn die gewünschten Ergebnisse erzielt werden sollen. Gereinigtes Saponin ist im Gegensatz zu ungereingigtem Saponin gegenüber pathogenen Mikroorganismen, wie Hefen, die in den erfindungsgemäßen Medien identifiziert werden, nicht toxisch. Die Saponine können im allgemeinen nach den in der US-Patentschrift 38 83 425 beschriebenen Verfahren "Entgiftung von Saponinen" gereinigt werden. Die so gereinigten Saponine können dann in den erfindungsgemäßen Medien verwendet werden, Die genaue Funktion der in diesen Kulturmedien enthaltenen Saponine ist nicht bekannt, man nimmt jedoch an, daß das Saponin eine Emulgierwirkung ausübt, die zu einer Trennung der Zelltrauben in der Probe der Körperflüssigkeit in Einzelzellen der Fungi führt. Diese Trennung unterstützt wahrscheinlich die Umsetzung zwischen dem Phenoloxydasesubstrat und dem Phenoloxydaseenzym des Cryptococcus neoformans, so daß es rascher zu den charakteristischen braunen Pigmentierungen kommt.

Als Phenoloxydasesubstrat kann jedes Substrat verwendet werden, von dem man weiß, daß es in Gegenwart von Cryptococcus neoformans eine braune Pigmentierung hervorruft. Geeignete Phenoloxydasesubstrate sind 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure), DOPA, 3,4-Dihydroxyzimtsäure (Kaffeesäure), der Methylester und das Diacetat der Kaffeesäure, 3-Hydroxytriptamin, 3,4-Dihydroxyphenylethanolamin (Norepinephrin) und 4-Hydroxy-3,5-Dimethoxyzimtsäure. Man nimmt an, daß die Farbbildung von den Hydroxylgruppen in 3- und 4-Stellung des Phenylringes abhängt. Von den oben genannten Phenoloxydasesubstraten wird die Kaffeesäure bevorzugt.

Das erfindungsgemäße Medium kann wie folgt hergestellt werden.

Die Ochsengalle, das gereinigte Saponin und das Phenoloxydasesubstrat können mit einer geeigneten Menge eines pulvrigen Trägermittels, wie z. B. Agar, zu destilliertem Wasser gegeben werden. Die gebildete Mischung wird dann gerührt und zum Sieden erhitzt, damit alle Komponenten in Lösung gehen. Die Lösung wird bei etwa 121°C etwa 15 Min. bei einem Druck von etwa 1,05 kg/cm² sterilisiert. Nach dem Sterilisieren und dem leichten Kühlen des Mediums kann in herkömmliche Petrischalen gegossen werden und nach der Verfestigung kann man die gegossenen Platten umkehren und sie über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen. Die erhaltenen Petrischalen können dann zur Lagerung in einen Kühlschrank gestellt werden. Sie sind bis zu etwa 6 Wochen beständig.

Die erfindungsgemäßen Medien enthalten 0,25 bis 30 Gew.-% Ochsengalle, 1 bis 5 Gew.-% Trägermaterial, 0,1 bis 5,0 Gew.-% gereinigtes Saponin und 0,001 bis 1,0 Gew.-% eines Phenoloxydasesubstrats, bezogen auf die Menge des Wassers, die zu diesen Komponenten gegeben wird.

Bevorzugte Medien können dadurch hergestellt werden, daß man 0,5 bis 5 Gew.-% Ochsengalle, 1 bis 5 Gew.-% Agar, 0,1 bis 1,0 Gew.-% gereinigtes Saponin und 0,005 bis 0,5 Gew.-% Kaffeesäure, bezogen auf die zu den trockenen Komponenten gegebene Menge Wasser, verwendet. Am vorteilhaftesten ist ein Medium, das 1,0 Gew.-% Ochsengalle, 2,0 Gew.-% Agar, 0,5 Gew.-% gereinigtes Saponin und 0,03 Gew.-% Kaffeesäure enthält. Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen Medien ist, daß alle Komponenten, das Wasser ausgenommen, Pulverform haben, so daß vorbestimmte Mengen jeder Komponente zu einem Präparat vereinigt werden können, das unbegrenzt lang in trockenem Zustand gelagert und erst unmittelbar vor Gebrauch durch Zugabe von Wasser in das eigentliche Medium übergeführt werden kann.

Die erfindungsgemäßen Medien können entweder als primäre oder als sekundäre Medien für die rasche differenzierte Identifizierung von Cryptococcus neoformans und Candida stellatoidea verwendet werden. Bei Verwendung als primäres Medium wird eine Probe Körperflüssigkeit, z. B. Blut, Sputum oder Urin, direkt auf das SOC-Medium gemäß der Erfindung aufgebracht und in eine geeignete Umgebung für das Pilzwachstum gestellt. Bei Verwendung als sekundäres Medium wird zunächst eine Probe der Körperflüssigkeit auf einem primären Medium, z. B. Sabouraud- Agar ausgestrichen, auf dem vorhandenen Fungi sofort ziemlich rasch wachsen, und nach diesem anfänglichen Wachstum werden die Fungi auf das SOC-Medium gemäß der Erfindung aufgebracht, das eine rasche Differenzierung der verschiedenen Arten von Fungi ermöglicht.

Die folgenden Beispiele zeigen die Vorteile der erfindugnsgemäßen Kulturmedien gegenüber solchen, die bisher für die Identifizierung verschiedener Fungi, einschließlich Candida albicans, Candida stellatoidea und Cryptococcus neoformans verwendet wurden.

Beispiel I

Dieses Beispiel soll die Unterschiede in der Zeit zeigen, die erforderlich ist, bis die charakteristischen morphologischen Veränderungen bei Fungi auftreten, die auf einem Maismehlagar (MMA), einem Kaffeesäure, Ochsengalle und Tween 80 (TOC) bzw. einem erfindungsgemäßen Medium kultiviert wurden, das eine Mischung aus gereinigtem Saponin, Ochsengalle und Kaffeesäure (SOC) enthielt.

Das MMA-Medium wurde nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt und mit 0,1% Tween 80 veretzt. Das TOC-Medium bestand aus Tween 80, Ochsengalle, Kaffeesäure und Davis-Agar, und wurde wie folgt hergestellt:

Zu einem Liter destilliertem Wasser wurden 10 g Ochsengalle, 20 g Agar, 10 ml einer 10%igen Lösung von Tween 80 und 0,3 g Kaffeesäure gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, zum Sieden erhitzt, damit die Komponenten in Lösung gingen, und etwa 15 Min. bei etwa 120°C und einem Druck von etwa 1,05 kg/cm² sterilisiert. Nach dem Sterilisieren und leichtem Kühlen wurde das Medium in Petrischalen gegossen. Das Testmedium gemäß der Erfindung, SOC, wurde wie folgt hergestellt: 10 g Ochsengalle, 20 g Agar, 5 g gereinigtes Saponin und 0,3 g Kaffeesäure wurden zu einem Liter destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, zum Sieden erhitzt, damit die Komponenten in Lösung gingen und 15 Min. bei 120°C und einem Druck von 1,05 kg/cm² sterilisiert. Nach dem Sterilisieren und leichten Kühlen wurde das Medium zur Verfestigung in Petrischalen gegossen.

Grundhefestämme wurden auf einem Sabouraud-Dextrose-Agar subkultiviert. Auf diesem Agar ließ man sie 72 Stunden wachsen. Nach dieser Vorkultivierung, einem Mittel zur Simulierung von Wachstum auf einer Primärplatte, wurden Hefen nach der Dalmau-Technik auf den einzelnen Medien, nämlich dem NMA-, dem TOC- bzw. SOC-Medium kultiviert. Diese Technik besteht einfach darin, daß man eine mit den Organismen beimpfte Fläche abdeckt, wodurch die beimpften Flächen der Platte mikroskopisch untersucht werden können. Um reichlich Impfstoff zu erhalten, wurde ein steriles Läppchen zum Ausstreichen der Kolonien auf den Sabouraud-Dextrose-Agarplatten verwendet.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse dieser Versuche aufgeführt. Sie zeigen die Zeit, die erforderlich ist, um Chlamydosporen von Candida albicans auf dem MMA-, TOC- bzw. SOC-Medium zu erzeugen. Es wurden 138 Isolate von Candida albicans ausgestrichen und in den in der Tabelle 1 angegebenen Zeitintervallen beobachtet. Die Anzahl der je 100 Mikroskopfelder erzeugten Chlamydosporen wurde dann für jedes Medium aufgezeichnet. Alle auf jedem Medium kultivierten Isolate wurden im wesentlichen den gleichen Bedingungen unterworfen.

Tabelle 1

Vergleich der Zeit, die erforderlich ist, um Chlamydosporen bei Candida albicans auf dem MMA-, TOC- bzw. SOC-Medium zu erzeugen

Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Chlamydosporenerzeugung auf dem SOC-Medium ihr Maximum nach nur 16 Stunden erreichte. Dagegen trat die maximale Chlamydosporenerzeugung auf dem TOC-Medium noch nicht bei 20 Stunden auf. Die Chlamydosporenerzeugung auf dem MMA-Medium war wesentlich geringer als auf dem TOC- und SOC-Medium.

Tabelle 2

Vergleich der Erzeugung von Keimschläuchen und Chlamydosporen auf Dalmau*)-Objektträgerkulturen unter Verwendung von MMA-, TOC- und SOC-Medium

Das erfindungsgemäße SOC-Medium wurde auch hinsichtlich der Keimschlauchbildung und der Chamydosporenerzeugung über einen Zeitraum von 72 Stunden mit dem MMA- und TOC- Medium verglichen. Für jedes Medium wurden zwei verschiedene Candida-Arten verwendet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.

Sie zeigen, daß das SOC-Medium gegenüber dem TOC-Medium einen deutlichen Vorteil bezüglich der Bildung von Keimschläuchen und der Chlamydosporenerzeugung bei Candida albicans besitzt, während beide Medien wiederum dem MMA-Medium weit überlegen waren. Aus den Daten der Tabelle 2 geht ferner hervor, daß in bezug auf Candida stellatoidea das SOC- und das TOC-Medium zu den gleichen Ergebnissen führten, und beide Medien dem MMA-Medium deutlich überlegen waren.

Schließlich wurde die spezifische Wirkung des SOC-Mediums auf Cryptococcus neoformans untersucht, indem man eine Anzahl von Stämmen von 8 verschiedenen Arten des Fungi ausstrich, um festzustellen, ob die charakteristische braune Pigmentierung für Cryptococcus neoformans spezifisch ist. Wie die Tabelle 3 unten zeigt, trat die braune Pigmentierung im Durchschnitt etwa 5,3 Stunden, nachdem der Cryptococcus neoformans auf dem SOC-Medium ausgestrichen worden war, auf. Keiner der anderen 7 untersuchten Fungi führte nach 72stündigem Wachstum zu irgendeiner merklichen Pigmentierung.

Tabelle 3

Pigmenterzeugung auf dem SOC-Medium

Beispiel II

Um das erfindungsgemäße Medium mit einem Gehalt an gereinigtem Saponin, Ochsengalle und Kaffeesäure mit den oben erläuterten Medien, die Tween 80, Ochsengalle und Kaffeesäure enthalten, zu vergleichen, wurden Proben dieser verschiedenen Arten von Medien hergestellt, wobei man die Anteile der drei Wirkstoffe variierte. Reichlich Impfstoff von Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida krusei, Cryptococcus neoformans und Cryptococcus wurde mittels eines Batistläppchens auf den verschiedenen Testmedien aufgebracht und in Zeitabständen von 3 und 24 Stunden beobachtet. Bei den Candida-Organismen wurden zu beiden Beobachtungszeitpunkten morphologische Veränderungen festgestellt. Für jedes Testmedium wurde der Prozentsatz der Isolate des Organsimus, der morphologische Veränderungen hinsichtlich der Keimschlauchbildung (gt), der Fadenbildung (F) und der Faden- und Chlamydosporenerzeugung (FC) zeigte, notiert. Bezüglich der Cryptococcus-Organismen wurde die Anzahl der Isolate, die eine sichtbare Veränderung in der Pigmentierung aufwiesen, als Prozentsatz der Gesamtzahl der untersuchten Isolate aufgezeichnet, wobei die Inspizierung der Pigmentierung ebenfalls in Zeitabständen von 3 und 24 Stunden erfolgte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

Probe 1 der Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse, wenn weder Tween 80 noch gereinigtes Saponin in einem Ochsengalle-Kaffee säure-Medium enthalten ist. In den Proben 2 bis 11 wurde die Menge der Kaffeesäure konstant gehalten, die Menge an Ochsengalle jedoch nach oben variiert, und zwar in Abständen von 2 Proben, von 0 (in den Proben 2 und 3) bis 5 g/l (in den Proben (10 und 11). Von jedem Probenpaar mit der gleichen Menge Ochsengalle enthielt die eine Probe Tween 80 in Kombination mit der Ochsengalle und der Kaffeesäure (die Proben mit den geraden Nummern), die anderen gereinigten Saponin gemäß der Erfindung (die Proben mit den ungeraden Nummern). In beiden Fällen wurden 10 g/l Tween 80 bzw. gereinigtes Saponin angewandt. Die Untersuchung der Proben 2 bis 11 veranschaulicht die Überlegenheit des SOC-Mediums gemäß der Erfindung im Vergleich zu dem TOC-Medium bezüglich der morphologischen Veränderungen bei der Gattung Candida, oder der Veränderungen in der Pigmentierung bei der Gattung Cryptococcus, oder bei beiden.

Die Proben 12 bis 15 veranschaulichen, daß, wenn der Gehalt an Ochsengalle und Kaffeesäure in den Medien auf einem konstanten Wert gehalten, der Gehalt an gereinigtem Saponin jedoch im Bereich von 5 bis 100 g/l variiert wird, gute Ergebnisse erzielt werden können. Das Studium der Proben 12 bis 15 macht jedoch deutlich, daß die maximale Pigmentierung von Cryptococcus neoformans bei der Beobachtung nach drei Stunden mit nur 5 g gereinigtem Saponin erzielt wird, während die Zugabe von mehr Saponin die Änderung in der Pigmentierung nicht verbessert.

Die Proben 16 bis 20 veranschaulichen, daß unterschiedliche Mengen Kaffeesäure in Kombination mit der Ochsengalle und dem gereinigten Saponin verwendet werden können. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß bei Mengen von unter 0,25 g/l die Kaffeesäure in unzureichenden Mengen vorhanden ist, um die gewünschte Änderung der Pigmentierung nach 3 bzw. 24 Stunden hervorzurufen.

Claims

1. Kulturmedium zur Identifizierung und Differenzierung pathogener Fungi, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) 0,25 bis 30 Gew.-% Ochsengalle,
b) 0,1 bis 5,0 Gew.-% gereinigte Saponin,
c) 0,001 bis 1,0 Gew.-% Substrat für die Phenoloxydase und
d) 1 bis 5 Gew.-% eines Trägermittels

enthält.

2. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß es als Substrat für die Phenoloxydase, 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, DOPA, 3,4-Dihydroxyzimtsäure, den Methylester oder das Diacetat der 3,4-Dihydroxyzimtsäure, 3-Hydroxytryptamin, 3,4-Dihydroxyphenylethanolamin oder 4-Hydroxy-3,5-dimethoxyzimtsäure, insbesondere 3,4-Dihydroxyzimtsäure enthält.

3. Kulturmedium nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Trockenform zum Vermischen mit Wasser vorliegt.

4. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Trägermaterial Agar enthält.

5. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es bezogen auf den Wassergehalt des Mediums mindestens 0,03 Gew.-% gereinigtes Saponin enthält.

6. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es bezogen auf den Wassergehalt des Mediums 2 Gew.-% Agar, 0,5 Gew.-% gereinigtes Saponin, 1 Gew.-% Ochsengalle und 0,03 Gew.-% 3,4-Dihydroxyzimtsäure enthält.

7. Verwendung des Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Identifizierung und Differenzierung pathogener Fungi in auf das Kulturmedium aufgebrachten Proben von Körperflüssigkeiten.