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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines neuen Streptomycetenantibiotikums mit bakteriostaiischen und fungistatischen Eigenschaften. Es ist in der Kulturlösung sowie in geringer Menge im Mycel eines neuen Streptomyceten enthalten und wurde wegen seiner Wirksamkeit gegen pflanzenpathogene Pilze Phyllomycin genannt.
Der aus Flussschlamm isolierte Streptomycet, der den Namen Streptomyces umbrosus erhielt und unter dieser Bezeichnung im Centralbureau voor Schimmelkultures Baam, Holland, hinterlegt worden ist, ist mit keinem der bekannten Streptomyceten identisch.
Nach "Actinomycetes and their Antibiotics"von S. A. WAKSMAN und H. A. LECHEVALER 1953, Seite 66, ist er als chromogener Typ mit einem in allen organischen Medien löslichen Pigment dem Streptomyces viridoflavus ähnlich, unterscheidet sich jedoch von ihm in wesentlichen Merkmalen. Nach den diagnostischen Methoden von W. LINDENBEIN (Archiv f. Mikrobiologie 17,361-381 (1952)je ergibt sich für die neue Spezies die in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellte Charakteristik.
Tabelle 1
Kultureigenschaften von Streptomyces umbrosus.
EMI1.1
<tb>
<tb>
Medium <SEP> Wachstum <SEP> Farbe <SEP> der <SEP> Kultur-Farbe <SEP> der <SEP> Pigment- <SEP> Bemerkun- <SEP>
<tb> oberfläche <SEP> bzw. <SEP> Untersei- <SEP> bildung <SEP> gen
<tb> des <SEP> Luftmycels <SEP> te <SEP> der <SEP> u.-Farbe
<tb> Kultur
<tb> Synthetischer <SEP> Agar <SEP> fein <SEP> krustig <SEP> schmutzig <SEP> bräun-braungelb <SEP> braungelb
<tb> lich <SEP> gelb, <SEP> kein
<tb> Luftmycel
<tb> Synthetische <SEP> Lösung <SEP> schwach, <SEP> nur <SEP> weiss-ohne <SEP>
<tb> am <SEP> Grund
<tb> Glucose <SEP> Brühe <SEP> ganz <SEP> gering,
<tb> nur <SEP> am <SEP> Grund <SEP> nicht <SEP> feststellbar <SEP> ohne <SEP>
<tb> Glucose <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> Luftmycel <SEP> grau-schmutzig <SEP> gelb
<tb> schwarz <SEP> bräunlich
<tb> Glucose <SEP> Asparagin <SEP> Agar <SEP> gut,
<SEP> dünn <SEP> Luftmycel <SEP> grau <SEP> bräunlich <SEP> braungelb
<tb> Ca-Malat <SEP> Agar <SEP> dünn,
<tb> schleimartig <SEP> schmutzig <SEP> bräun- <SEP> schmutzig <SEP> ohne
<tb> lich <SEP> kein <SEP> Luft- <SEP> bräunlich <SEP>
<tb> mycel
<tb>
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EMI2.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Farbe <SEP> der <SEP> Kultur-Farbe <SEP> der <SEP> Pigment-Bemerkungen
<tb> oberfläche <SEP> bzw.
<SEP> Untersei-bildung
<tb> des <SEP> Luftmycels <SEP> te <SEP> der <SEP> Kul-u.-Farbe
<tb> tur
<tb> Gelatine <SEP> gut, <SEP> samtig <SEP> Luftrnycel, <SEP> weiss-nicht <SEP> fest-tiefbraun <SEP> keine <SEP> Ver- <SEP>
<tb> kissenförmig <SEP> gelb <SEP> stellbar <SEP> flüssigung <SEP>
<tb> Stärke-Agar <SEP> nicht <SEP> gut, <SEP> ohne <SEP> Luftmycel, <SEP> nicht <SEP> fest- <SEP> schwarz- <SEP>
<tb> dünn <SEP> bräunlich <SEP> stellbar <SEP> braun
<tb> Nähragar <SEP> nicht <SEP> gut, <SEP> ohne <SEP> Luftmycel, <SEP> graubraun <SEP> braun
<tb> dünn <SEP> graubraun
<tb> Kartoffel <SEP> nicht <SEP> gut <SEP> ohne <SEP> Luftmycel, <SEP> Kartoffel <SEP>
<tb> grau <SEP> tief <SEP> dunkel
<tb> gefärbt
<tb> Karotte <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb> Cellulosemedium <SEP> schwach,
<SEP> weiss-ohne <SEP> kein <SEP> Wachsam <SEP> Grund <SEP> turn <SEP> am <SEP> Cellulosestreifen
<tb> Lakmusmilch <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> kein <SEP> Luftmycel, <SEP> - <SEP> ohne <SEP> Lakmus
<tb> schmutzig <SEP> braun-entfärbt
<tb> lich
<tb>
Streptomyces umbrosus oder seine Varianten oder Mutanten können erfindungsgemäss unter Bildung des Wirkstoffes auf üblichen Nährmedien mit z.
B. Glycerin oder Malzextrakt als Kohlenstoffquelle, Pep- ton, Maisquellwasser, Brauereihefe oder Caseinhydrolysat als Stickstoffquelle, unter Zusatz anorganischer
Salze wie z. B. Natriumchlorid, Dikallumhydrogenphosphat, Eisen-II-stilfat und Magnesiumsulfat, vor- zugsweise submers bei einem PH-Wert von 6,5 bis 7,5 und einer Temperatur von 26 bis 320 C, gezüch- tet werden, wobei das Kulturmedium ausserdem die wesentlichen Spurenelemente enthalten soll, die ge- wöhnlich im Leitungswasser sowie in den natürlichen Nährbodenzusätzen, z. B. Brauereihefe, enthalten sind, worauf dann das gebildete Antibiotikum (Phyllomycin) durch Extraktion oder Adsorption aus dem Mycel oder dem Filtrat der Gärflüssigkeit gewonnen und allenfalls, z.
B. durchchromatographische Ver- fahren, weiter gereinigt wird. Es wurde beobachtet, dass bei fast allen Kulturversuchen zu Beginn das Me- dium langsam sauer wird. Die Bildung des Antibiotikums setzt im Vergleich zu andern Wirkstoffen sehr früh ein und erreicht bereits nach 3 Tagen Kulturdauer ihr Maximum. Geringe Mengen Phyllomycin las- sen sich im Schüttelkolben oder in der Oberflächenkultur erzeugen. Zur Herstellung grösserer Mengen des Antibiotikums wird die gerührte, submerse, aerobe Kultur bevorzugt.
Zur Erreichung eines möglichst schnellen Anwachsens und einer dadurch verkürzten Fermentationsdauer wird stets reichlich mit einer frisch hergestellten Sporenaufschwemmung oder einer entsprechenden submersen Vorkultur beimpft,
Streptomyces umbrosus lässt sich, wie oben angeführt, bei Temperaturen zwischen 260 und 320 C, bevor- zugt bei 290 C, kultivieren. Die Herstellung der Wirkstoffe ist jedoch nicht auf die Verwendung des Strep- tomyces umbrosus beschränkt, sondern umfasst auch Mutanten dieses Stammes, die durch Einwirkung von
Mutationsmitteln, z. B. von Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen und chemischen Substanzen, erhalten werden.
Die Konzentration des Antibiotikums in Kulturfiltraten und Kulturextrakten wird mit Rhodotorula flava CBS 331 als Testorganismus bestimmt. Ein typisches Kulturfiltrat hemmt im Plattenlochtest auf einem für Hefen geeigneten Nährboden das Wachstum noch in einer Verdünnung von 1 : 50.
Zur Extraktion des Antibiotikums eignen sich insbesondere Essigester und Butylacetat, jedoch sind auch chlorierte Kohlenwasserstoffe, Äther, Ketone und Alkohole anwendbar. Der Extrakt der Kulturflüs-
EMI2.2
EMI2.3
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ren ein braunes Öl (unverseifbarer Anteil des Öls = 20% ; Jodzahl 290) erhalten, das noch in einer Verdünnung von 1 : 1000000 im Plattenlochtest gegen Rhodotorula flava wirksam ist. Mit diesem öligen Phyllomycin-Konzentrat wurden die untenstehenden biologischen Versuche durchgeführt.
Zur weiteren Reinigung des Fungistatikums wird das Phyllomycin-Konzentrat der Wirksamkeit 1 : 1000000 im Gegenstrom mit dem System : 13 Vol.-Teile Ligroin, 6 Vol, -Teile Butylacetat, 2 Vol. -Teile Di-n-butyläther, 14 Vol.- Teile N-Dimethylformamid und 7 Vol.-Teile Wasser über zehn Stufen verteilt, die Fraktion fünf im Vakuum zur Trockne eingedampft und aus dem zuruckbleibenden festen Rückstand nach Kristallisation aus Methyl-propylketon das Phyllomycin in rosettenförmig angeordneten Nadeln vom F. 177-178, 50 C
EMI3.1
322 imm mit a = 9, 70 und # max 225 m mit α=60(α = spezifischer Extinktionskoeffizient= Extinktion für c = 1 g/l und d = 1 cm) erhalten.
Phyllomycin besitzt charakteristische Absorptionsbanden im U. R. bei folgenden Wellenlängen : (KBrPressling ; die Werte in Klammern geben die prozentualen Durchlässigkeiten an)
EMI3.2
<tb>
<tb> 2,97 <SEP> (50, <SEP> 7%), <SEP> 3,37 <SEP> (54, <SEP> 8%), <SEP> 5,72 <SEP> ( <SEP> 7,1%), <SEP> 5,97 <SEP> (27, <SEP> 7%),
<tb> 6, <SEP> 10 <SEP> (34, <SEP> 6%), <SEP> 6, <SEP> 21 <SEP> (37, <SEP> 0%), <SEP> 6, <SEP> 29 <SEP> (47, <SEP> 30/0), <SEP> 6, <SEP> 55 <SEP> (17, <SEP> 1%), <SEP>
<tb> 6,87 <SEP> (47,8%), <SEP> 6,98 <SEP> (48,4%), <SEP> 7,36 <SEP> (30,0%), <SEP> 7,52 <SEP> (43,2%),
<tb> 7,64 <SEP> (48,8%), <SEP> 7,84 <SEP> (36,3%), <SEP> 7,98 <SEP> (24,2%), <SEP> 8,49 <SEP> (17.0%),
<tb> 8,66 <SEP> (17,2%), <SEP> 9,28 <SEP> (36,9%), <SEP> 9,30 <SEP> (37,1%), <SEP> 9,49 <SEP> (49,0%)
<tb>
und 9, 85 fi (44, 6%).
Der genaue Verlauf der Absorptionskurven im ultravioletten und ultraroten Bereich des Spektrums ist den Fig. 1 und 2 zu entnehmen.
Phyllomycin ist innerhalb bestimmter Grenzen temperaturbeständig ; bei 200 C bleibt die gegen Rhodotorula flava getestete Wirksamkeit über 7 Stunden erhalten, bei 500 C beträgt die Wirksamkeit unter vergleichbaren Versuchsbedingungen nach 3Stunden 100%, nach 7 Stunden 95%, bei 1000 C nach 1/2 Stun -
EMI3.3
Phyllomycin ist alkaliempfindlich.
Im Ringverteilungschromatogramm werden für Phyllomycin mit den nachstehend angegebenen Verteilungssystemen folgende RF-werte gefunden: 0,13 mit: 1 Vol.-Teil Wasser, 1 Vol.-TeilÄthylenglykoL 4 Vol.-Teile N-Dimethylformamid, 3 Vol. -Teile Di-n-butyläther, 3 Vol.-Teile Ligroin ; 0, 31 mit : 1 Vol. -Teil Äthylenglykol, 2 Vol.-Teile N-Dimethylformamid, 1 Vol. -Teil Di-n-butyläther, 2 Vol. - teile Ligroin ; 0,68 mit : 1 Vol. -Teil Wasser, 2 Vol.-Teile Methanol, 2 Vol.-Teile N-Dimethylform-
EMI3.4
Äthylenglykol, 2 Vol.-Teile N-Dimethylformamid, 3 Vol.-Teile Butylacetat, 2 Vol.-Teile Ligroin.
Zur Durchführung des Chromatogrammes werden rund geschnittene Filterpapiere (Schleicher & Schüll 2043b) mit der hydrophilen Phase des jeweiligen, vorher durch anhaltendes Schütteln ins Gleichgewicht gesetzten Verteilungssystems besprüht und mit der hydrophoben Phase entwickelt. Nach dem Trocknen des Chromatogrammes wird radial ein 0,5 mm breiter Streifen ausgeschnitten und auf eine mit Rhodotorula flava beimpfte Agarplatte gelegt. An der Stelle, an der sich der Wirkstoff befindet, entsteht bei der Bebrütung ein klarer Hemmhof, aus dem der RF-Wert als Quotient der Laufstrecke des Antibiotikums zu der Laufstrecke der hydrophoben Phase (= Lösungsmittelfront) berechnet wird.
Das kristallisierte Phyllomycin hemmt im Plattenlochtest Rhodotorula flava CBS 331 noch in einer Verdünnung 1 : 50000000 bis 1 : 100000000.
Anderseits lässt sich das Phyllomycin aus dem Kulturmedium gewinnen, indem man die zentrifugierte oder filtrierte Kulturlösung mit einem Adsorptionsmittel, insbesondere mit Aktivkohle zusammenbringt, das Adsorbat abtrennt und den Wirkstoff mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere mit chlorierten Kohlenwasserstoffen und Alkoholen desorbiert.
Ausser Phyllomycin enthalten die Kulturfiltrate noch ein weiteres Antibiotikum, welches ebenfalls gegen Pilze, z. B. gegen Rhodotorula flava und Cladosporium cucumerinum wirksam ist. Bei der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie Butylacetat oder Essigester, verbleibt es in der wässerigen Pha-
EMI3.5
Phyllomycin besitzt eine ausgesprochene Wirksamkeit gegen pflanzenpathogene Organismen in vivo und in vitro. Zur Prüfung wurde ein Phyllomycin-Konzentrat (Aktivität gegen Rhodotorula flava 1 : 1000000) verwendet, dessen Wirksamkeit in vitro im Röhrchenverdünnungstest sowie im Plattenlochtest gegen Pilze und Bakterien in der Tabelle 2 und dessen Wirksamkeit in Vivo an der Pflanze in der Tabelle 3 angegeben ist. Die Wirksamkeit des Antibiotikums ist jedoch nicht auf die in den Tabellen 2 und 4 aufgeführten
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Organismen beschränkt. Phyllomycin kann als systemische Pflanzenschutzmittel Verwendung finden.
Der Befallsquotient von Omphalia flavida auf Coleus-Pflanzen nach dem Tränken der Erde mit einer Ilnigen Phyllomycin-Lösung beträgt 52, nach dem Tränken mit einer 0, 1%gen Lösung 68 (Kontrolle 100 (siehe Tabelle 3)).
Das Phyllomycin-Konzentrat 1 : 1000000 besitzt nur eine geringfügige Phytotoxizität (siehe Tabelle 4). Ohne Ausnahme wurde mit einer 0, tilgen Losung keine Schädigung beobachtet. Auch die mit einer 1o/oigen Lösung erhaltenen Befunde sind geringfügig.
Als fungistatisch wirksame Streptomyceten-Antibiotika sind eine Gruppe von Verbindungen, wie z. B.
Fungicidin (= Nystatin) (J. D. Putcher, G. Boyack, S. Fox, Antibiotics Annual 1953-1954, Seite 191), Euro-
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mycin besitzt, wie aus dem beigefügten Spektrum ersichtlich ist, kein derartig typisches Absorptionsspektrum und dürfte von den genannten Verbindungen eindeutig verschieden sein. Zwischen Actidion (A. D. Whiffen, R. L. Emmerson, N. Bohonos, USP 2574519 ; Upjohn Company) und Phyllomycin besteht ebenfalls ein eindeutiger Unterschied, da Actidion im Röhrchenverdünnungstest gegen Cladosporium cucumerinum nur in einer Verdünnung 1 : 50000 das Wachstum hemmt, während Phyllomycin noch mit 1 : 10000000 wirksam ist.
Auch zwischen Phyllomycin und den bekannten Streptomyceten-Antibiotika : Streptomycin, Tetracyclin, Viomycin, Erythromycin, Chloramphenicol und Novobiocin sind deutliche Unterschiede in der biologischen Wirkung zu verzeichnen. So ergibt das Phyllomycin-Konzentrat im Plattenlochtest gegen Candida utilis CBS 840 noch in einer Verdünnung von'1 : 200000 einen Hemmhof von 19 mm, während Streptomycin mit der Verdünnung 1 : 400, Tetracyclin mit 1 : 400, Viomycin mit 1 : 400, Erythromycin mit 1 : 4000, Chloramphenicol mit 1 : 4000 und Novobiocin mit 1 : 6000 unwirksam sind. Unterschiede bestehen auch zwischen Phyllomycin und dem von C. Leben und G. W. Keitt (Phytopathology 37,14 (1947) u. 38,899 (1948)) aufgefundenen Antibiotikum Antimycin A.
Schon der"Antimycin producing"Strepto- myces NRRL 2288 zeigt gegenüber dem Phyllomycin-Bildner Streptomyces umbrosus, wie der Tabelle 5 zu entnehmen ist, deutliche Kulturunterschiede. Ein direkter Vergleich zwischen einem authentischen Antimycin-A-Präparat und Phyllomycin ergab Unterschiede im Schmelzpunkt (unkorr.) : Antimycin A 136-1370 C, Phyllomycin 177-178, 50 C, Misch-Schmelzpunkt 129-1300 C und, wie aus der Fig. 3 zu ersehen ist, Unterschiede in den RF-Werten im Ringveneilungschromatogramm bei Verwendung eines Verteilungssystems aus 6 Vol.-Teilen Ligroin, l Vol.-Teil Di-n-butyl-äther, 3 Vol.-Teilen Butylacetat, 7 Vol.-Teile N-Dimethylformamid, 3 Vol.-Teile Wasser und bei Anwendung der oben beschriebenen Technik (vgl. Fig. 3).
Das Chromatogramm wurde mit diazotierter Sulfanilsäure entwickelt. Da auch in der biologischen Wirkung beider Fungistatika qualitative und quantitative Unterschiede bestehen (vgl.
Tabelle 6), dürfte Phyllomycin zweifelsohne als neues Antibiotikum anzusprechen sein.
Tabelle 2 Wirksamkeit in vitro des Phyllomycin-Konzentrates (Aktivität gegen Rhodotorula flava 1 : 1000000).
EMI4.2
<tb>
<tb>
Art <SEP> des <SEP> Testes <SEP> wirksame <SEP> Grenzverdünnung <SEP> ; <SEP> Hemmhof- <SEP> Testorganismus
<tb> durchmesser <SEP> beim <SEP> Plattenlochtest <SEP> (- <SEP> )
<tb> R <SEP> 1 <SEP> 10000000 <SEP> Cladosporium <SEP> cucumeriaum <SEP>
<tb> R <SEP> 1 <SEP> 500000 <SEP> Cladosporiumsp. <SEP> (Hopfen) <SEP>
<tb> R <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 500000 <SEP> Botrytis <SEP> cinerea
<tb> R <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 750000 <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum <SEP> Stamm <SEP> RI
<tb> R <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 750000 <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum <SEP> Stamm <SEP> RII
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 2000---20 <SEP> mm-Cerospoj-a <SEP> musae <SEP>
<tb> 1 <SEP> 4000 <SEP> 3 <SEP> 14mm <SEP>
<tb>
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EMI5.1
<tb>
<tb> Art <SEP> des <SEP> Testes <SEP> wirksame <SEP> Grenzverdünnung <SEP> :
<SEP> Hemmhof- <SEP> Testorganismus
<tb> durchmesser <SEP> beim <SEP> Plattenlochtest <SEP> (- <SEP> )
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> # <SEP> 14mm <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum <SEP> Stamm <SEP> RI
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 1000 <SEP> 8, <SEP> 5mm <SEP>
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> # <SEP> 11,5 <SEP> mm <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum <SEP> Stamm <SEP> RU
<tb> 1 <SEP> :1000 <SEP> # <SEP> 8,0 <SEP> mm
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> # <SEP> 22, <SEP> 5 <SEP> mm <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum <SEP> Stamm <SEP> 1002
<tb> 1 <SEP> :
1000 <SEP> # <SEP> 15,0 <SEP> mm
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 10000 <SEP> # <SEP> 38 <SEP> mm <SEP> Sarcina <SEP> lutea
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 500000 <SEP> 17 <SEP> mm <SEP> Rhodotorula <SEP> flava <SEP> CBS <SEP> 331
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 200000--=. <SEP> 19 <SEP> mm <SEP> Candida <SEP> utilis <SEP> CBS <SEP> 840
<tb> Pl <SEP> unwirksam <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb>
R = Rohrchenverdünnungstest
Pl = Plattenlochtest
Tabelle 3 Wirksamkeit in vivo des Phyllomycin-Konzentrates (Aktivität gegen Rhodotorula flava 1 :
1000000).
EMI5.2
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> Schädling <SEP> Wirt <SEP> Befallsquotient
<tb> 0,2 <SEP> % <SEP> Phytophtora <SEP> infestans <SEP> Tomatenpflanze <SEP> 52
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 59
<tb> unbehandelt"""100
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Alternaria <SEP> solani <SEP> Tomatenpflanze <SEP> 19
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> % <SEP> "..
<SEP> " <SEP> 51 <SEP>
<tb> unbehandelt <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 100
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> % <SEP> Peronospora <SEP> Reben <SEP> 20
<tb> 0,01 <SEP> % <SEP> " <SEP> " <SEP> 37
<tb> 0, <SEP> 005 <SEP> %""40
<tb> unbehandelt""100
<tb> 0, <SEP> 025 <SEP> % <SEP> Pericular <SEP> orycae <SEP> Reispflanze <SEP> 66
<tb> unbehandelt <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 100
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> % <SEP> Omphalia <SEP> flavida <SEP> Kaffeepflanze <SEP> 0
<tb> 0,005 <SEP> % <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 1,2
<tb> 0,0005 <SEP> % <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 78
<tb> unbehandelt <SEP> 100 <SEP>
<tb> 1 <SEP> % <SEP> +) <SEP> " <SEP> " <SEP> Coleus <SEP> 52
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> +)
<SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 68
<tb> unbehandelt <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 100
<tb>
EMI5.3
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Tabelle 4 Phytotoxizität des Phyllomycin-Konzentrates (Aktivität gegen Rhodotorula flava 1 : 1000000)
EMI6.1
<tb>
<tb> Testpflanze <SEP> gespritzte <SEP> Konzentration <SEP> Befund
<tb> Bohne <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Blattrandnekrosen <SEP> ; <SEP> Neuzuwachs <SEP> normal
<tb> " <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> keine <SEP> Schäden <SEP> ; <SEP> Neuzuwachs <SEP> normal
<tb> 11 <SEP> 0, <SEP> 0fP/o <SEP> keine <SEP> Schäden <SEP> ; <SEP> Neuzuwachs <SEP> normal
<tb> " <SEP> 0, <SEP> 01% <SEP> keine <SEP> Schäden <SEP> ;
<SEP> Neuzuwachs <SEP> normal
<tb> Baumwolle <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Blattrandnekrosen
<tb> " <SEP> 0.1% <SEP> keine <SEP> Schäden
<tb> Kaffee <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> keine <SEP> Schäden
<tb> Banane <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Blattflecken <SEP> an <SEP> der <SEP> Basis <SEP> des <SEP> Herzblattes
<tb> "0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> keine <SEP> Schäden
<tb> Reis <SEP> 0,1% <SEP> keine <SEP> Schäden
<tb>
Tabelle 5 Differenzierung des "Antimycin producing" Streptomyces gegen Streptomyces umbrosus
EMI6.2
<tb>
<tb> "Antimycin <SEP> producing"Streptomyces <SEP> umbrosus
<tb> Streptomyces <SEP> NRRL <SEP> 2288
<tb> Farbe <SEP> des <SEP> Luftmycels <SEP> auf <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> cremefarben <SEP> grau
<tb> Glukose-Asparagin-Agar,
<tb> Glukuse-Agar <SEP> und <SEP> Nähragar
<tb> Mikroskopisches <SEP> Bild <SEP> des <SEP> keine <SEP> Spiralen <SEP> Spiralen <SEP> mit <SEP> 2-5 <SEP> WinLuftmycels <SEP> dungen
<tb> Farbe <SEP> des <SEP> Substrates <SEP> auf <SEP> ohne <SEP> Farbe <SEP> bis <SEP> schwach <SEP> dunkelbraun
<tb> peptonhaltigen <SEP> Nährböden <SEP> gelblich
<tb> (Nähragar <SEP> und <SEP> Gelatineagar)
<tb>
Tabelle 6 Wirksamkeit des Antimycin A und Phyllomycins im Plattenlochtest gegen drei verschiedene Hefen
EMI6.3
<tb>
<tb> Hefe <SEP> Antimycin <SEP> A <SEP> Phyllomycin
<tb> Verdünnung <SEP> (-# <SEP> mm <SEP> Hemmuof) <SEP> Verdünnung <SEP> (-# <SEP> mm <SEP> Hemmnof)
<tb> Candida <SEP> lipolytica <SEP> 1:
<SEP> 10000 <SEP> # <SEP> 21, <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 640000 <SEP> # <SEP> 27,0
<tb> (Harrison) <SEP> Diddens <SEP> 1 <SEP> 40000 <SEP> 20, <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 2500000--- <SEP> 20, <SEP> 0
<tb> et <SEP> Lodder <SEP> 1 <SEP> 160000 <SEP> # <SEP> 18,0 <SEP> 1:10000000 <SEP> # <SEP> 12,5
<tb> Sporobolomyces <SEP> 1 <SEP> 10000 <SEP> # <SEP> 22,2 <SEP> 1: <SEP> 640000 <SEP> # <SEP> 25,5
<tb> holsaticus <SEP> 1: <SEP> 40000 <SEP> # <SEP> 21,0 <SEP> 1: <SEP> 2500000 <SEP> # <SEP> 19,5
<tb> Windisch <SEP> 1 <SEP> 160000#18, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 10000000#15, <SEP> 0
<tb> Rhodotorula <SEP> glutinia <SEP> 1: <SEP> 10000#21, <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 160000#29, <SEP> 0
<tb> (Fres.) <SEP> Harrison <SEP> 1 <SEP> 40000#20,6 <SEP> 1: <SEP> 640000 <SEP> # <SEP> 20, <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 160000#18, <SEP> 0 <SEP> 1:
<SEP> 2500000 <SEP> # <SEP> 14. <SEP> 0
<tb>
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EMI7.1
EMI7.2
<tb>
<tb> c; <SEP> , <SEP> l;,. <SEP> n <SEP> werden... <SEP> % <SEP> Glycerin <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Pepton
<tb> 0, <SEP> 25% <SEP> Glykokoll
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> NaCl <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> KHPO
<tb> 0, <SEP> 02% <SEP> FeS0. <SEP> 7H <SEP> O
<tb> 0, <SEP> 02% <SEP> MgSO. <SEP> 7H20 <SEP>
<tb>
EMI7.3
Streptomyces umbrosus nov. spez., der auf einem Nährmedium gleicher Zusammensetzung mit 2% Agar gewachsen war, beimpft und auf einer Schüttelmaschine mit 240 Umdr/min bei 290 C fermentiert. Nach 72 Std. Kulturdauer hemmt die Fermentationsbrühe Rhodotorula flava in einer Verdünnung von l : 50.
Mit 21 dieser im Wachstum befindlichen Vorkultur wird ein 1000 1-Fermenter, der mit 7001 der Nährlösung :
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<tb>
<tb> 2 <SEP> % <SEP> Glycerin
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Trockenbierhefe
<tb> 0, <SEP> 25% <SEP> Glykokoll
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> NaCl <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> KzHPO <SEP> 4 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 02% <SEP> Fes <SEP> 7H2O
<tb> 0, <SEP> 02% <SEP> MgSO <SEP> 4'7Hp <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Siliconöl <SEP> (handelsübliche <SEP> Ware)
<tb>
beschickt ist und an zwei aufeinanderfolgenden Tagen je 20 min bei 1200 C sterilisiert wurde, beimpft und bei einem Luftdurchtritt von 350 l/min 72 Std. kräftig gerührt. Die Wirksamkeit gegen Rhodotorula flava beträgt dann 1 : 50.
Anschliessend wird die Fermentationsflüssigkeit auf der Zentrifuge vom Mycel befreit, das klare Zentrifugat einmal mit 3001 Butylacetat extrahiert, der gelbgrün gefärbte Extrakt im Vakuum bei 500 C auf 4 1 eingeengt, mit 161 Ligroin versetzt, ein grünlichbrauner Niederschlag abgetrennt und die Lösungsmittel im Vakuum bei 50 C abdestilliert. Der zurückbleibende zähe Rückstand, der noch das als Antischaummittel zugesetzte Silikonöl enthält, wird zweimal mit je 3 1 Methanol ausgezogen, die sich abscheidende ölige Phase abgetrennt und das Methanol im Vakuum abdestilliert. Es resultieren zirka 30 g braunes Öl, das in der Verdünnung 1 : 1000000 das Wachstum von Rhodotorula flava hemmt und als Ausgangsmaterial für Pflanzenversuche verwendet wird.
Zur weiteren Reinigung des Antibiotikums werden in acht 101 Scheidetrichtem je 41 der organischen Phase des Verteilungssystems : 13 Vol.-Teile Ligroin, 6 Vol.-Teile Butylacetat, 2 Vol.-Teile Di-n-butylather, 14 Vol.-Teile N-Dimethylformamid und 7 Vol.-Teile Wasser eingefüllt, 400 g vorstehenden Phyllomycinkonzentrates mit der Wirksamkeit 1 : 1000900 in 4 l der wässerigen Phase des genannten Verteilungssystems gelöst und mit 4 1 der organischen Phase des ersten Scheidetrichters längere Zeit durchgeschüttelt. Die wässerige Phase wird abgetrennt, zu der organischen Phase des zweiten Scheidetrichters gegeben und in den ersten 4 1 frische wässerige Phase nachgefüllt. Beide Scheidetrichter werden langere Zeit geschüttelt.
Der Vorgang wird im Sinne einer Gegenstromverteilung über 8 Stufen wiederholt. Alle acht wässerigen Phasen werden abgelassen, zu den organischen Phasen 2 I Essigester gegeben und einmal mit Wasser ausgeschüttelt (Wasser verworfen). Die acht wässerigen Phasen werden zu den entsprechenden organischen Phasen gegeben, alle acht Fraktionen ausgeschüttelt und die wässerigen Phasen abgetrennt. Diese enthalten noch geringe Mengen Phyllomycin. Die resultierenden organischen Phasen werden dreimal mit je 21 Wasser ausgeschüttet (Wasser verworfen) und im Vakuum bei 600 C Badtemperatur zur Trockne destilliert. Die Fraktionen vier, fünf und sechs enthalten den Hauptanteil des Wirkstoffes. Aus der
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[aj hemmen.
Beispiel 2 : 101 Kulturlösung des Streptomyces. umbrosus nov. spez. mit einer Wirksamkeit gegen Rhodotorula flava von 1 : 50 werden zentrifugiert, das klare Zentrifugat mit 50 g Aktivkohle gerührt und die Kohle abgeschleudert. In der vom Adsorptionsmittel befreiten Kulturlösung verbleiben zirka 10%
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der Wirksamkeit. Das Adsorbat wird getrocknet und mit 11 Chloroform 30 min bei 500 C gerührt, wieder geschleudert und die überstehende Chloroformlösung zur Trockne abgedampft. Als Rückstand verbleiben 1,7 g eines Öles, das das Wachstum von Rhodotorula flava noch in einer Verdünnung von 1 : 200 000 hemmt und das gegebenenfalls wie vorstehend weiter gereinigt werden kann.