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Verfähren zur Herstellung und Gewinnung eines .Antibiotikums Man hat
schon zahlreiche Antibiotika aus Kulturmedien, in welchen die Mikroorganismen unter
sorgfältiger Überwachung aller Bedingungen wachsen, isoliert. Einige dieser Antibiotika
erweisen sich gegen eine sehr breite Gruppe pathogener Organismen wirksam, andere
hingegen über eine ganz spezifische Aktivität gegen eine verhältnismäßig kleine
Gruppe von Organismen aus.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung
eines neuen Antibiotikums, mit dem das Wachstum von pathogenen Organismen und Bakterien
gehindert werden kann, bei denen alle bisher bekannten Antibiotika versagten.
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Das neue Antibiotikum hat sich gegen eine verhältnismäßig spezifische
Gruppe von Bakterien wirksaan erwiesen. Unter den Bakterien, die in ihrem Wachstum
durch die neuen Antibiotika gehindert oder gehemmt werden, wie ein Test nach der
»Agar-Streak-Methode« von Waksman und Rielly (Ind. Eng. Che. Anal., Ausgabe 17,
556 [x945]) ergab, befinden sich Bacillus cereus ATCC 7o64, Bacillus subtilis ATCC
1o 707, Streptococcus faecalis ATCC 1o 541, Streptococcus pyogenes ATCC 9342,
Staphylococcus aureous ATCC 6538-P, Diplococcus pneumoniae Typ I, Sarcina lutea
ATCC 9341, Mycobacterium species ATCC 607
und Mycobacterium smegmatis ATCC
1o 43- Weitere Daten, die mit serienmäßig -durchgeführten Verdünnungsverfahren in'
flüssigen Medien .erhalten wurden, ergaben, daß die folgenden Bakterien durch die
erfindungsgemäß gewonnenen Antibiotika gehemmt
werden: Staphylococcus
aureus, Kozamik-Stamm (widerstandsfähig gegenüber Carbomycin und Erythromycin),
Staphylococcus aureus, Difco 1251 (widerstandsfähig gegenüber Penicillin, Aüreomycin,
Terramycin und Chloromycetin), -Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Streptococcus
pyogenes C 2o3 M, Diplococcus pneumoniae Typ I und Streptococcus faecahs ATCC 10
541.
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In vivo an Mäusen durchgeführte Untersuchungen ergaben, daß die erfindungsgemäß
gewonnenen Antibiotika intramuskulär appliziert Mäuse gegen Streptococcus pyogenes,
Staphylococcus aureus und Diplococcus pneumoniae schützen, wenn die Mäuse intraperitoneal
mit dem Test-Organismus infiziert worden sind. Der akute intravenöse Toxizitäts-Test
mit dem neuen Antibiotikum zeigt, daß die LD-5o-Dosis für Mäuse zwischen 2 und 5
g/kg Körpergewicht liegt. Außerdem wird das neue Antibiotikum intramuskulär bei
einem Spiegel von 8oo mg/kg Körpergewicht pro Tag über eine Zeit von 5- Tagen vertragen.
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Der - das Antibiotik@im produzierende Organismus stammt aus einer
Bodenprobe aus »The Garden of Godsa, Colorado Springs, Colorado. Die Isolierung
wurde nach den üblichen Standard-Verdünnungsverfahren unter Benutzung eines festen
Mediums, Baltimore Biological Laboratories Trypticase Soy Agar, in Petrischalen
vorgenommen. Strukturell und funktionell gehört dieser in dem Boden gefundene Organismus
den Gliedern des Nocardia-Stammes nach der Klassifikation von Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology (6. Ausgabe) an. Der spezielle Stamm von Nocardia actinomycete,
der gemäß Erfindung benutzt wird, wird als NOCaIdla-Stamm NRRL 243o bezeichnet.
Der erfindungsgemäße Fermentationsprozeß ist jedoch nicht nur auf die Verwendung
von Nocardia-Stamm NRRL 243o beschränkt, er umfaßt auch die anderen Stämme der Nocardia-Gattung,
welche die neuen Antibiotika produzieren. Beider Verwendung dieser Stämme, unter
denen sich auch die Modifikationen des Stammes NRRL 243o befinden, welche sich schnell
gewinnen und in üblicher Weise isolieren lassen, sind die Methoden zur Durchführung
von Modifikationen, die Auswahl der Kulturorganismen sowie die Anwendung von modifizierend
wirkenden Mitteln, wie Röntgenstrahlen, Ultraviolettbestrahlung und Chemikalien
auf Organismen inbegriffen.
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Der Nocardia-Stamm NRRL 243o unterscheidet sich klar von den anderen
bekannten Arten und zeichnet sich durch zahlreiche physikalische, kulturbedingte
und physiologische Teste aus, die weiter unten beschrieben sind.
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Wenn. man ihn auf einer Nährlösung folgender Zusammensetzung
| Trypton ..................... . ...... 0,5% |
| Dextrin . . . . . . . . . . . . . . 1,o o% |
| Agar ............................... 2,00/0 |
| Leitungswasser ad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1oo,o
0/0 |
wachsen läßt, beobachtet man ein mittleres Wachstum der Nocaxdia-Kolonien, die nach
4 Tagen einen Durchmesser von 1 mm, nach ,7 Tagen einen von 2 mm und nach 11 Tagen
einen Durchmesser von 3 mm haben. Die gebildeten Kolonien sind kreisförmig, werden
leicht unregelmäßig, sind glänzend, von glasiger Erscheinungsform, werden stark
gekräuselt und honiggelb oder lichtgold gefärbt (2ic), bambus- oder chamoisfarben
(2gc), Substratmyzel, an den Kanten bildet sich ein cremeweißes Myzel an derLuft,
spärliches cremiges luftiges Myzel in den stärker wachsenden Bereichen. Die benutzten
Farbenangaben entsprechen dem nColor Harmony Man zalu 3. Ausgabe; Jacobsen, Robert;
Granville, Water C.; Foss, Carl E., 1948, Container Corporation of America.
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Bei mikroskopischer Betrachtung zeigt es sich, daß das Myzel des Stammes
NRRL 243o mittelmäßig dicht wächst und eine Struktur vom Typ monopodialer Verzweigung
hat. In frühem Wachstumsstadium zeigt es keine Unterteilungen, jedoch beginnt mit
etwa 48 Stunden die Segmentation des-Myzels, und innerhalb von 72 bis 96 Stunden
hat eine vollständige Fragmentation stattgefunden. Die Fragmente oder Oidio-Sporensindstäbchenförmigmitgut
ausgebildeten quadratischen Enden. Sie sind etwa o,8 bis 1,5 ,u lang. Das Myzel
ist etwa 0,5 ,u breit. , Wenn die Kultur altert, stellt man einzelne und
doppelte Schleifen in dem Myzel fest, wobei das Wachstum unter mikroskopischer Beobachtung
durchgeführt wird. Conidien wurden nicht beobachtet.
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Der erfindungsgemäß zur Gewinnung des neuen Antibiotikums verwendete
Organismus zeigt folgende charakteristischen Eigenschaften, wenn man ihn auf folgenden
Standard-Medien wachsen läßt: A. Trypton, Rindfleischextrakt, Hefeextrakt, Dextrose-Agar,
mittleres Wachstum, zunächst stark gekräuselt, bei weiterer Bebrütung scheint die
gekräuselte Erscheinungsform zu verschwinden, leicht ßenfgelblohfarben (Zie) gefärbt,
Substratmyzel, spärliches, weißes, luftiges Myzel, keine Sporen, kein wasserlösliches
Pigment; B. Pepton, Rindfleischextrakt, Dextrose, Na Cl-Agar, mittleres Wachstum,
stark gekräuselt während der Bebrütungszeit, senfgelbbraun (2 Pi) gefärbtes Substratmyzel,
das golden oder tabakbraun (3Pi), spärliches, weißes, luftiges Myzel an den Kanten
des Wachstumsstreifens, keine Sporen, leicht graubraunes wasserlösliches Pigment;
C. Carvajal-Hafermehl-Agar, mittleres Wachstum, schmutziggelb (1 bis 1/2gc) gefärbtes
Substratmyzel, das honiggelb oder lichtgold (2ic) wird, dünnes, weißes luftiges
Myzel, keine Sporen, kein wasserlösliches Pigment; D. Dextrose-Asparagin Agar, mittleres
Wachstum, leicht senfgelblohfarben (2ie) gefärbtes Substratmyzel, kein luftiges
Myzel, keine Sporen, kein wasserlösliches Pigment; E. Czapeks-Dox (Dextrose)-Agar,
mittleres Wachstum, stark gekräuselt, zimmt- oder ahorngelb (31e) gefärbtes Substratmyzel,
das ziegel- oder lichtbraun (31g) wird, spärliches, weißes, luftiges Myzel, keine
Sporen, kein wasserlösliches Pigment; F: Agar mit apfelsaurem Kalk, mittleres Wachstum,
hellbraunes oder sandfarbiges (2ec) Substratmyzel, dünnes, perlenfarbiges (2ec)
luftiges Myzel, keine Sporen, kein wasserlösliches Pigment;
G. Kartoffeloberfläche,
mittleres Wachstum, honiggelb oder lichtgold (2ic) gefärbtes Substratmyzel, dünnes
perlenfarbiges (2ba) luftiges Myzel, keine Sporen, kein wasserlösliches Pigment;
H. Glucose-Kraftbrühe, mittleres Wachstum, innerhalb 7 Tagen bildet sich ein Häutchen,
das eine stark gekräuselte Erscheinungsform hat, bambus- oder chamoisfarbiges (Zgc)
bis honiggelbes oder lichtgold gefärbtes (2 ic) Substrat in Form eines Häutchens,
kein luftiges Myzel, keine Sporen, kein wasserlösliches Pigment; I. Lackmusmilch,
keine Klümpchenbildung. Die Hydrolyse (Klarwerden) beginnt etwa am io. Tage einer
Bebrütung bei 28° C und ist am oder vor dem 2i. Tage beendet. Nach 7 Tagen wurde
eine Alkalifarbreaktion beobachtet. Die elektrometische p$-Bestimmung nach 21 Tagen
ergab einen pH-Wert von B.
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J. Stärke-Agar, mittleres Wachstum, Substratmyzel, das an den Kanten
des Wachstumsstreifens altgold (i bis 1/2PE) und an den inneren Wachstumsteilchen
leicht olivgrün (i bis 1/ZgE) gefärbt ist und bei weiterer Bebrütung an den Kanten
beige- oder kamelhaarfarbig (3 gE) und an den inneren Teilen beige oder dunkelbraun
(3 ig) wird, spärliches, perlenfarbiges (2ba) luftiges Myzel, keine Sporen, kein
wasserlösliches Pigment, keine Hydrolyse der Stärke.
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K. Tryptose-Blut-Agar-Bäsis, mittleres Wachstum, dunkel- oder kaffeebraun
(3PN) gefärbtes Substratmyzel, kein luftiges Myzel, keine Sporen, ii-mm-Zone Haemolyse;
L. Gewöhnliche Gelatine, mittleres Wachstum, direkt unter der Oberfläche baumwollartige
Erscheinungsform, die bei weiterer Bebrütung schuppig wird, spärliches, weißes,
luftiges Myzel, das bei Verflüssigung der Gelatine nicht wahrnehmbar ist, die Kultur
fällt zu einer festen Oberfläche zusammen, zwei Drittel des Rohres wird in 21 Tagen
verflüssigt, kein wasserlösliches Pigment; M. Nitrat-Agar, Teste auf Nitrit sind
übereinstimmend negativ.
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Der nachfolgenden Tabelle ist zu entnehmen, wie sich die handelsüblichen
Substanzen als Kohlenstofflieferanten für das erfindungsgemäße Gewinnungsverfahren
für das Antibiotikum eignen.
| Tabelle I |
| Verwendungsfähigkeit von Kohlenstoffverbindungen |
| Kohlenstofilieferant Brauchbar- Wachstums- |
| keit geschwindigkeit |
| 1 |
| Pentosen: Xylose ................................... + mittelmäßig |
| Arabinose ....................... ........ + mittelmäßig |
| Rhamnose ................................ - |
| Hexosen: Dextrose . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . mittelmäßig |
| Galactose ................................. mittelmäßig |
| Mannose ................................. mittelmäßig |
| Ketosen: Fructose ................................. mittelmäßig |
| Sorbose .................................. - |
| Di-saccharide: Sucrose .................................. - |
| Lactose .................................. - |
| Maltose .................................. - |
| Cellibiose ...... .......................... schnell |
| Tri-saccharide: Raffinose ........................... ... - |
| Poly-saccharide: lösliche Stärke ............................
- |
| Cellulose ................................. - |
| Glucoside: Salicin ................................... langsam |
| Alkohole: Glycerin . . .. . . . . . . .. . . . .. . . . . ...
. . . . . . ". .. mittelmäßig |
| Mannit ................................... + schnell |
| Dulcit .................................... - |
| Inosit .................................... - |
| Sorbit .................................... - |
| Säuren: Natriumcitrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . + langsam |
| Natriumlactat............................. + langsam |
| Natriumsuccinat .......................... + langsam |
| Natriumacetat ............................ + mittelmäßig |
| Natrium-Kalium-Tartrat .......... . ........ - |
| Kontrolle ................................. - |
Es -muß festgestellt werden, daß die oben beschriebenen Teste für
die Verwendungsfähigkeit von Energiequellen unter speziellen Wachstumsbedingungen
durchgeführt sind und daß aus dem Unvermögen der Actinomyceten gewisse Energiequellen
unter den Testbedingungen (Pridham, T. G.. und Gottlieb, D.: Die Verwendungsfähigkeit
von Kohlenstoffverbindungen für einige Actinomycetale zur Artbestimmung, J.- Bacteriology
56, 1o7 bis 114,119481) aufzunehmen, nicht auf ihre Verwendungsfähigkeit unter anderen
Bedingungen geschlossen werden kann.
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Die Anwesenheit und die Konzentration des erfindungsgemäß gewonnenen
Antibiotikums in den Feimentationsflüssigkeiten und anderen Lösungen kann nach einer
der folgenden vier Methoden bestimmt werden: i. der Agar-Verdünnungsmethode mit
Bacillus subtilis als bevorzugter Test-Organismus, 2. dem serienmäßig durchgeführten
Nährflüssigkeitsverdünnungsversuch, vorzugsweise mit Streptococcus pyogenes oder
Bacillus subtilis als Test-Organismus; 3. der nephelometrischen Versuchsmethode,
4. dem Papierscheibenversuch.
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Nährflüssigkeitsverdünnungsmethode Zunächst wird die zum Animpfen
bestimmte Probe des Test-Organismus hergestellt, indem man den gewünschten Versuchs-Organismus
aus der Gruppe der Bacillus subtilisATCC 10707, Streptococcus faecelas ATCC
10 541 und Streptococcus pyogenes ATCC 9342 wachsen läßt. Die Organismen
Bacillus subtilis und Streptococcus faecalis läßt man in einem T.B:-Grundnährmedium,*)
das 5 Volumprozent Glycerin enthält, und den Organismus Streptococcus pyogenes läßt
man in einem Tryptose-Phosphat-Nährmedium wachsen.
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In verschiedenen Untersuchungsröhrchen werden 5 cm3 des TB.-Grundnährmediums
mit 5 Volumprozent Glycerin eingebracht. Das Versuchsmedium und die Röhrchen werden
im Autoklav 15 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm3 sterilisiert und jedem der
Serien von Röhrchen, die 5 cm3 des Versuchsmediums enthalten, Lösungen mit verschiedener
Konzentration der erfindungsgemäß gewonnenen antibiotischen Substanz in sterilem
destilliertem' Wasser, das etwa 15 % Methylalkohol enthält, zugefügt: 5 cm3 einer
geeigneten Verdünnung der antibiotischen Lösung werden dem ersten Teströhrchen mit
dem Untersuchungsmedium zugefügt, alles gut miteinander vermischt und 5 cm3 dieser
Lösung in das nächste Röhrchen dieser Serie gegeben und wiederum alles gut miteinander
vermischt. Dieser Vorgang wird mit einer gewünschten Anzahl von zweifachen Verdünnungen
wiederholt.
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Um in allen Röhrchen die gleiche Flüssigkeitsmenge zu haben, werden
aus dem letzten Röhrchen der-Versuchsserie, das nach dem Vermischen io cm3 Lösung
enthält, 5 cm3 Flüssigkeit verworfen. Jedes Röhrchen wird dann mit o,i cms einer
i : ioo-Verdünnung der zweiten 24-Std.=Nährmedienkultur der Probe, die -in *) Das
Grundnährmedium hat in dehydratisiertem Zustand folgende Zusammensetzung: Bacto-Fiefeextrakt
2 g, Proteose-Pepton Nr. 3 2 g, Bacto-Casitone 2 g, Dinatriumphosphat 2,5 g, Monokaliumphosphat
i g, Natriumcitrat 1,5 g, Magnesiumsulfat o,6 g,- Tween 8o. o,5 g.. der oben beschriebenen
Weise für die Beimpfung vorbereitet wurde, beimpft. Die Röhrchen werden unter Schütteln
48 Stunden bei 37° C bebrütet und nach 24 und 48 Stunden das Wachstum des Test-Organismus
geprüft. Dabei ermittelt man die minimale Konzentration des Antibiotikums,
mit welchem das Wachstum des Test-Organismus vollkommen gehemmt wird.
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' Agar-Verdünnungs-Methode Serienweise Verdünnungen von Proben, die
das Antibiotikum enthalten, werden mit einem Nährmedium vermischt
| Glucose (handelsüblich) . . . . . . . . . o,i % |
| K H2 P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1% |
| Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,10/(, |
| KZHPO4 ....... . . . . . . . . . . . . . . . 0,3% |
| Trypton . .-. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3% |
| Rindfleischextrakt .......:...... 0,3.% |
| Agar............................ 2,00/0 |
| Leitungswasser ad . . . . . . . . . . . . e. ioo,o 0/0 |
Das Nähragar wird in Petri-Schalen gegossen und, dort zur Verfestigung stehengelassen.
Anschließend beimpft man die Agar-Platte mit einer Kultur des Test-Organismus, welche
wirksam wird, wenn man das gehärtete Agar einer Jeden Platte mit einer mit einer
sterilen Mullspitze versehenen- Vorrichtung anritzt, die in eine Suspension, welche
i ooo ooo Sporen per cm3 von Bacillus subtilis ATCC io7o7 (Illinois) enthält, eingetaucht
ist. Jede Platte wird dann bei 37° C 24 Stunden lang bebrütet und. anschließend
das Ausmaß des Wachstums des Organismus bestimmt. Die größte Verdünnung des Kulturmediums,
welche eine vollkommene Wachstumshemmung des Test-Organismus verursacht, wird in
willkürlichen Agar-Verdünnungseinheiten pro cm3 angegeben, indem man die größte
Verdünnung des Antibiotikums; bei welchem kein Wachstum des Test-Organismus stattfindet,
beobachtet.
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Nephelometrische Versuchsmethode Die nephelometrische Methode, die
bei dem erfindungsgemäß gewonnenen Antibiotikum angewendet wurde, entspricht dem
Verfahren, das schon bei anderen Antibiotika zur Anwendung kam, und folgt den Richtlinien,
die von D. A. Joslyn und M. Galbraith in dem Joumal of Bacteriology, 59, 7i1-6 (1950)
beschrieben sind. Für diese Versuche wurde Staphylococcus aureus, Stamm 314 M, als
Test-Organismus verwendet. Das Untersuchungsedium setzt sich wie folgt zusammen
| Glucose (handelsüblich) . . . . . . . . . . o,i % |
| Pepton.......................... i,00/0 |
| NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,50/" |
| Hefe-Extrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . .
oje/' |
| Rindfleisch-E@trakt.............. 0,30/0 |
| destilliertes Wasser, ad . . . . . . . . . . ioo,o % |
Zur Verdünnung der Standard- und der Versuchsproben wird steriles destilliertes
Wasser verwendet. Die Bebrütung wird 31/2 Stunden bei 37° C durchgeführt und anschließend
die Trübung mit einem
photoelektrischen Nephelometer gemessen. Die
Standardkurve erstreckt sich von 4 bis 32 Bacillus-subtilis-Agar-Verdünnungseinheiten
pro cm3.
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Papierscheiben-Versuchsmethode Die Papierscheiben-Versuchsmethode,
welche bei dem erfindungsgemäßen Antibiotikum angewendet wurde, entspricht derjenigen,
die die von T. H. Loo, P. S. Skell, H. H. Thornberry, J. Ehrlich, J. M. McGuire,
G. M. Savage und J. C. Sylvester in J. Bacteriology, 50, 70, (i945) beschrieben
worden ist. Zur Untersuchung der Fermentationsmedien der Erfindung wird die zentrifugierte
Gärflüssigkeit auf Papierscheiben aufgebracht und in derselben Weise behandelt,
wie das streptomycinhaltige Material in der oben angegebenen Literatur. Es hat sich
jedoch als wünschenswert erwiesen, zur Herstellung eines Versuchsstandards und der
Versuchsproben eine etwas stärker konzentrierte Lösung des Antibiotikums zu verwenden.
So wird der Standard vorzugsweise in =%igem Phosphatpuffer von p$ 8 auf 400 E/cm3,
Zoo E/cm3, ioo E/cm3, 40 E/cm3 verdünnt, wobei als Einheiten Bacillus-subtilis-Agar-Verdünnungseinheiten
(AVE) verwendet werden und die Untersuchungsprobe in i°/oigem Phosphatpuffer von
pg 8 auf nahezu 15o AVE/cm3 verdünnt. Wenn die Versuchsproben in Platten übergeführt
sind, werden diese 2 Stunden später gekühlt und dann über Nacht bei 3o1 C bebrütet.
Anschließend werden die Zonen in mm gemessen und die Standardkurve in der üblichen
Weise durchgeführt.
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Das Antibiotikum der Erfindung wird durch aerobische Kultivierung
eines Stammes der Gattung Nocardia gewonnen, vorzugsweise in Tiefkultur-Fermentierung
in einem Nährmedium; das eine Kohlenstoffquelle, eine geeignete Stickstoffquelle
und wesentliche Spurenmineralien enthält.
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Als Lieferanten für Kohlenstoff können Zucker, wie Dextrose, Fructose
und Cellibiose, oder andere Kohlenwasserstoffe, wie Zuckeralkohole, beispielsweise
Mannit, Glycerin u. dgl., und Öle, wie Pflanzen-und auch Specköl (eine Substanz,
die Olein und geringfügige Anteile von Glyceriden fester Fettsäure enthält), verwendet
werden.
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Als geeignete Stickstoffquelle für den Fermentationsprozeß können
sehr verschiedene Substanzen, unter anderen tierische und pflanzliche Mehle, wie
Sojabohnenmehl, Fleischextrakte und zahlreiche andere stickstoffhaltige Substanzen
pflanzlichen und tierischen Ursprungs genannt werden. Dem Fermentationsmedium kann
auch Maiseinweichwasser, das zahlreiche der wesentlichen Wachstumssubstanzen sowohl
organischer als auch anorganischer Natur enthält, zugefügt werden.
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Ein Melasse - Pepton - Medium hat sich sowohl bei der Fermentation,
die in Flaschen unter Schütteln durchgeführt wurde, als auch bei der submersen Fermentation
als geeignet erwiesen.
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Bei der Fermentation wird eine Temperatur von 24 und 281 C bevorzugt,
obgleich sie auch schon bei etwa 22 und noch bei etwa 321 C durchgeführt werden
kann. Maximale Ausbeuten können bei einer etwa 4 Tage währenden Fermentation unter
optimalen Temperatur- und Belüftungsbedingungen, wie sie hier beschrieben sind,
erhalten werden.
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Beispiel I Ein flacher Agar-Kuchen von Hafermehl-Agar wird in der
Weise hergestellt, daß-man 30 g gewalzten Hafer 30 Minuten in 11 Leitungswasser
mit Dampf behandelt, das Material durch grobes Baumwolltuch filtriert und 2 °/o
Agar hinzufügt, . um ein festes Medium zu bilden, welches anschließend mit einer
aus Muttererde stammenden Probe des neuen Antibiotikums der Erfindung, - des Nocardia-Stammes
NRRC 243o, beimpft wird. Der flache Kuchen wird bei 281 C 4 bis '7 Tage lang bebrütet,
dann fügt man steriles, destilliertes Wasser zu dem Kuchen und entfernt das Oberflächenwachstum
mit einer sterilen, mit einer Öse versehenen Vorrichtung für die Beimpfung.
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500-cm3-Erlenmeyer-Kolben, welche 125 cm3 des folgenden Mediums
| gewalzter Hafer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
g |
| Dextrin ............................io g |
| Glucose (handelsüblich) . . . . . . . . . . . . . 5 g |
| NaCl ............. - ................ 59 |
| CaC03 ............................ 59 |
| KHIP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i g |
| NH,N03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59 |
| Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i
1 |
enthalten, werden bei 12i1 C
30 Minuten unter Dampfdruck sterilisiert und
mit dem Oberflächenwachstum des erwähnten sterilen flachen Agar-Kuchens beimpft.
Die Kolben werden auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 240 Umdrehungen pro Minute
und 5,7 cm3 Exzentrizität bei einer Temperatur von 281 C 48 Stunden bebrütet. 4
Volumprozent der Kultur aus dem Erlenmeyerkolben werden dazu verwendet, um zwei
weitere Kolben mit demselben Fermentationsmedium zu beimpfen. Diese neu beimpften
Kolben werden 48 Stunden bei 281 unter denselben Bedingungen bebrütet. Nach 48stündiger
Wachstumsperiode kann die für die Beimpfung vorgesehene Kultur in das Produktionsmedium
übertragen werden.
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Anschließend werden Kolben mit folgendem Wachstumsmenium
| Glucose des Handels . . . . . . . . . . . . . . . . io g |
| Melasse ............................2o g |
| Pepton ............................ 5 g |
| Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i
l |
mit 4 Volumprozent der Kultur aus dem letzten Paar Erlenmeyerkolben beimpft und
in derselben Weise wie die oben erwähnten Erlenmeyerkolben bebrütet. Nach viertägiger
Bebrütung auf der Rotationsschüttelmaschine wird die Kultur entfernt und die vereinigte
Gärflüssigkeit als Ausgangsmaterial für das neue Antibiotikum der Erfindung verwendet.
Versuche mit Bacillus-subtilis-Agar-Verdünnungstechnik ergaben im Durchschnitt 8o
bis 32o Bacillus-subtilis-Agar-Verdünnungseinheiten pro cm-3.
Beispiel
II Ein 3o l Fermenter, der ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung enthält.:
'
| Glucose des Handels . . . . . . . . . . . . . . . . io g |
| Melasse ............................2o g |
| Pepton .......................... 59 |
| Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 |
und bei im:' C i Stunde lang mit Dampf sterilisiert worden ist, wurde mit
300 cm3 (25 Volumprozent) einer Kultur des Nocardia-Stammes NRRL 243o, die
in Schüttelkolben, wie sie in dem Beispiel i beschrieben worden sind, gewachsen
war, beimpft. Die Fermentation wird bei 26° bei einer Belüftung von o,81 Luft pro
Liter Medium pro Minute durchgeführt. Zum Rühren wird ein vierflügeliger Rührer
von
20,3 cm Durchmesser, der 48o Umdrehungen pro Minute macht, verwendet.
Als Antischaummittel setzt man Specköl, das 2,5 °/o Octadecanol enthält, zu. Nach
4 Tagen wird die Kultur entfernt. Die Gärflüssigkeit zeigt nach der Papierscheiben-Versuchsmethode
Ausbeuten zwischen etwa
250 und 500 Bacillus-subtihs-Agar-Verdünnüngseinheiten
pro cm3.
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Zur Aufarbeitung wird das Antibiotikum an Aktivkohle absorbiert, hiervon
mit warmem, angesäuertem wäßrigem Aceton eluiert, durch Verdampfen das Lösungsmittel
entfernt und die Festteilchen konzentriert, mit Methanol die Verunreinigungen ausgefällt,
zur Trockne eingedampft, die Festteilchen noch einmal mit heißem Methanol extrahiert,
anschließend mit 5o '°/o Glycerin in Methanol extrahiert und das antibakterielle
Produkt mit Methanol gefällt.
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Beispiel III Das neue Antibiotikum wird aus der fermentierten Gärflüssigkeit,
die nach dem Verfahren von Beispiel II erhalten wurde, in der Weise gewonnen, daß
man die Gärflüssigkeit, aus welcher die Festteilchen abfiiltriert worden sind, mit
i0%iger Aktivkohle, welche über 95 °% der aktiven Substanz in der Gärflüssigkeit
absorbiert, behandelt. Die Aktivkohle wird mit einem Filterhilfsstoff abfiltriert,
der Filterkuchen mit Wasser gewaschen und mit warmem, 5o°%igem wäßrigem Aceton,
das auf etwa p$ 3 angesäuert ist, eluiert. Mit einem Lösungsmittelvolumen, das etwa
ein Sechstel des Volumens der filtrierten Gärflüssigkeit ausmacht, werden etwa 30
°/o der aktiven Substanzen eluiert. Nach dreifacher Wiederholung gewinnt man weitere
30 0/a. Die Eluat-Fraktionen vereinigt man, neutralisiert sie und destilliert bei
vermindertem Druck das Aceton ab. Diese Destillation wird so lange fortgesetzt,
bis ein Endvolumen erreicht wird, das etwa 5 °/a des Volumens der Gärflüssigkeit
ausmacht. Dann fügt man das gleiche Volumen an Methanol hinzu und filtriert einen
inaktiven Niederschlag ab. Das Filtrat wird zur Trockne verdampft, der Rückstand
wiederholt mit heißem absolutem Methanol extrahiert, bis der Extrakt nur noch leicht
gefärbt ist. Der braune pulvrige Rückstand wird anschließend mit 50 °/o Glycerin
in Methanol extrahiert und der Extrakt zur Entfernung der inaktiven Festteilchen
zentrifugiert. Die aktive Substanz fällt man durch Zusatz der 5fachen Methanohnenge
aus. Der Niederschlag :wird durch Zentrifugieren gekühlt, mit Methanol gewaschen
und gibt nach dem Trocknen ein graulohfarbiges Pulver. Das unreine Produkt zeigt
einen Gehalt von etwa 25o Bacillus-subtilis-Agar-Verdünnungseinheiten pro mg.
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Beispiel IV Ein 3o-1-Fermenter mit einem Fermentations-Medium folgender
Zusammensetzung:
| Sojabohnenmehl.................... io g |
| Glucose des Handels . . . . . . . . . . . . . . . io g |
| NaCl ......................:.... 5 g |
| CaC0.............................. i g |
| Specköl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
cm3 |
| Leitungswasser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 |
welcher bei i2i° C i Stunde lang mit Dampf sterilisiert worden ist, wird mit
300 cm3 (2,5 Volumprozent) einer Kultur des Nocardia-Stammes NRRL 243o, die
in einem Schüttelkolben in der in Beispiel I beschriebenen Weise gewachsen war,
beimpft. Die Fermentation wird bei 24° und einer Belüftung von o,81 Luft pro Liter
Medium pro Minute durchgeführt. Zum Rühren benutzt man- einen vierflügeligen Rührer
von
20,3 cm Durchmesser, der eine Geschwindigkeit von 48o Umdrehungen pro
Minute hat. Als _Antischaummittel gibt man Specköl, das 2,5 °/o Octadecanol enthält,
hinzu. Nach 4 Tagen werden die Kulturen aus den Fermentern entfernt. Die dabei erhaltene
Gärflüssigkeit weist nach der Papierscheiben-Versuchsmethode etwa 5oo bis iooo Bacillus-subtilis-Agar-Verdünnungseinheiten
pro cm2 auf.
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Die sich daran anschließende Aufarbeitungsmethode umfaßt: Adsorption
des Antibiotikums an Kohlenstoff, Elutiön mit warmem, angesäuertem, wäßrigem Aceton,
Entfernung des Lösungsmittels und Konzentration der Festteilchen durch Verdampfung,
Fällung der Verunreinigungen mit Methanol, Eindampfen zur Trockne, wiederholte Extraktion
der Festteilchen mit heißem Methanol, Extraktion mit 5007, Glycerin in Methanol
und Fällung der antibakteriellen Substanz mit Methanol in der in Beispiel III angegebenen
Weise.
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Das erfindungsgemäß gewonnene Material löst sich in Wasser, verdünnten
Säuren und Alkalien zu einer dunkelbraunen Lösung und ist in Methanol, Aethylalkohol,
Aceton, - Äther, Dioxan, Chloroform und Eisessig unlöslich.
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Serienmäßig durchgeführte Sensitivitäts-Teste zeigen, daß das neue
Antibiotikum eine Wirksamkeit gegen Stämme von Staphylococcen und Streptococcen,
die gegenüber Penicillin, Aureomycin, Terramycin, Streptomycin, Erythromycin oder
Carbomycin resistent sind, besitzt.
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Papierchromatographische Untersuchungen wurden in ioo-cm3-Meßzylindern
mit der aufsteigenden Streifentechnik durchgeführt, wobei Streifen in die zur Entwicklung
verwendete Lösung, die sich am Boden des Zylinders befindet, gehängt werden, indem
man sie zwischen dem Schliff des Glaszylinderstopfens und
dem Zylinderhals
befestigt. Bei einigen der verwendeten Lösungsmittel-Systeme werden die Streifen
mit der Atmosphäre des Zylinders ins Gleichgewicht gebracht, indem man sie eine
Zeitlang, bevor man sie in das Lösungsmittel eintaucht, über der Lösungsmitteloberfläche
hängenläßt. Alle Lösungsmittel-Systeme werden in eine mit Luft erhitzte Apparatur
zur Bebrütung auf 28° C eingebracht. Lösungsmittel-Systeme, die sich nicht mischen,
können sich bei 28° C trennen. Als Test-Organismus für Bioautographen wurde Bacillus
subtilis ATCC 10707 und als Papier ein i5,97--mm-Streifen von Eaton-Dikeman 513
verwendet.
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Lösungsmittel-System 1: n-Butanol mit deionisiertem Wasser gesättigt,
Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = 3 Stunden, Entwicklungszeit = 16 bis 17
Stunden, RF = o'`).
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Lösungsmittel-System II: n-Butanol mit deionisiertem Wasser gesättigt.
Der an n-Butanol reichen Schicht werden 2 % Gewichtsvolumen p-Toluolsulfonsäure
zugefügt. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = 3 Stunden, Entwicklungszeit
= 16 bis 17 Stunden. RF = o bis 0,05, o,16 (geringere Aktivität o,16 wird
mit 500 mcg/Streifen aufgezeigt).
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Lösungsmittel-System III: n-Butanol mit deionisiertem Wasser gesättigt.
Der an n-Butanol reichen Schicht werden 2 °/o Gewichtsvolumen p-Toluolsulfonsäure
und 2 % Volumen/Volumen Piperidin zugefügt. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts
= 3 Stunden, Entwicklungszeit = 16 bis 17 Stunden, RF = 0. Geringere Aktivität bei
RF 0,07 wird mit 500 mcg/ Streifen gezeigt.
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Lösungsmittel-System IV: Methylisobutylketon mit deionisiertem Wasser
gesättigt. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = keine, Entwicklungszeit = 3
Stunden, RF = o.
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Lösungsmittel-System V : Methylisobutylketon mit Wasser gesättigt,
welchem 2°/o Gewichtsvolumen p-Toluolsulfonsäure zugefügt ist. Zeit zur Einstellung
des Gleichgewichts = keine, Entwicklungszeit = 3 Stunden, RF = o.
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Lösungsmittel-System VI : Methylisobutylketon mit deionisiertem Wasser
gesättigt, plus 2 °/p Volumen/Volumen Piperidin, Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts
= keine, -Entwicklungszeit = 3-Stunden, RF = o.
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Lösungsmittel-System VII: Deionisiertes Wasser mit Methylisobutylketon
gesättigt. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = keine, Entwicklungszeit = 3
Stunden, RF = o bis o,5, 0,8o. Diese beiden Fraktionen sind mit 50o mcg/Streifen
sichtbar, mit weniger als Zoo mcg/Streifen tritt lediglich die langsame Fraktion
auf.
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Lösungsmittel-System VIII: Deionisiertes mit Methylisobutylketon gesättigtes
Wasser, dem i °/o Gewichtsvolumen p-Toluolsulfonsäure zugefügt ist. Zeit zur Einstellung
des Gleichgewichts = keine, Entwicklungszeit = 3 Stunden, RF = o,68, o,88. Zwei
Fraktionen von nahezu gleicher Aktivität (Zonen-`) RF-Verhältnis der auf dem Papierstreifen
zurückgelegten Weglänge des antibiotischen Materials zur Weglänge des Lösungsmittels.
Durchmesser) mit 50o mcg/Streifen. Die langsame Fraktion verschwindet schließlich
bei Anwendung einer geringeren Menge auf dem Streifen.
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Lösungsmittel-System IX: Deionisiertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes
Wasser, dem 10/0
Volumen/Volumen Piperidin zugefügt ist. Zeit zur Einstellung
des Gleichgewichts = keine, Entwicklungszeit = 3 Stunden. RF =nahezu o,75, 0,9o.
Zonen verschmolzen.
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Lösungsmittel-System X: 3 Teile deionisiertes Wasser: 1 Teil einer
Mischung, bestehend aus Methanol: Aceton im Verhältnis 3: 1 Volumen/Volumen wird
mit NH40H auf PH 10,5 eingestellt und dann mit Phosphorsäure auf p$ 7,5 gebracht.
Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = keine, Entwicklungszeit = 3 Stunden. RF
= bei 50o mcg/Streifen verschmelzen augenscheinlich zwei Zonen mit RFs von nahezu
0,75 und 0,9o. Wenn etwas weniger als Zoo mcg/Streifen verwendet werden,
wird eine Zone von mir 0,9o erhalten.
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Lösungsmittel-System XI: 8o Teile Methanol: 2o Teile Volumen/Volumen
deionisiertes Wasser plus 1,5 °% NaC1 Gewichtsvolumen werden der Lösung hinzugefügt.
Streifen werden mit einer Lösung, welche 0,95 M Na2S04 und 0,o5 M NaHS04
enthält, gepuffert. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = 3 Stunden, Entwicklungszeit
= 16 bis 17 Stunden. RF = o,16, 0,41. Zwei Zonen von nahezu dem gleichen Durchmesser
bei 500 mcg/Streifen. Mit weniger als Zoo mcg/Streifen wird lediglich die
Zone bei o,16 gefunden.
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Lösungsmittel-System XII : Eine Lösung, bestehend aus 8o Teilen Äthanol:
2o Teilen deionisiertem Wassef Volumen/Volumen, der 1,5 °% NaC1 Gewichtsvolumen
zugefügt sind. Die Streifen werden mit einer Lösung von 0,95 M Na2S04 und
0,o5 M NaHS04 in deionisiertem Wasser gepuffert. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts
= 3 Stunden. Entwicklungszeit = 16 bis 17 Stunden. RF = 0,2o.
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Lösungsmittel-System AA: Amylacetat mit o,1 M Calcium-Phosphat-Puffer
von 6,15 gesättigt. Der Puffer wird aus K2 H P 04 und K HZ P 04 Salzen in deionisiertem
Wasser hergestellt. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = 3 Stunden, Entwicklungszeit
= 16 bis 17 Stunden (der Lösungsmittelteil verdampft durch den Zylinderhals), RF
= o.
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Lösungsmittel-System -MO: 40 cm3 n-Butanol, 10 cm3 Methanol, 2o cm3
deionisiertes Wasser werden zusammengemischt und Methylorange im Überschuß (nahezu
1,5 gms) hinzugefügt, bei 28° stehengelassen. Man trennt von ungelöstem Methylorange
ab. Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts = 3 Stunden, Entwicklungszeit = 16 bis
17 Stunden. RF = 0,30 bis 0,34 und o. Mit weniger als Zoo mcg/Streifen ist nur eine
Aktivität bei 0,3o bis 0,34 auf den Bioautographen wahrzunehmen.
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Die papierchromatographischen Untersuchungen zeigen, daß das Antibiotikum
sich von allen anderen -bekannten Antibiotika oder Chemotherapeutika unterscheidet.
Darüber hinaus ist dem papierchromatographischen Test zu entnehmen, daß das Antibiotikum
gemäß der Erfindung ein Glied einer neuen Gruppe von Chemotherapeutika darstellt
und sich aus mehr
als einer Komponente zusammenzusetzen scheint
und etwa drei oder vier Glieder der Gruppe enthalten kann.