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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm des Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus in einem wässrigen Nährmedium als Oberflächenkultur oder unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis besagtem Medium eine antibiotische Wirkung durch Entstehen von Bicyclomycin verliehen wird, worauf man dann das Bicyclomycin daraus gewinnt.
2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm des Streptomyces griseoflavus var.
bicyclomyceticus FERM-P Nr. 1805 züchtet.
3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm des Streptomyces griseoflavus var.
bicyclomyceticus FERM-P Nr. 1806 züchtet.
4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle beinhaltet, züchtet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin mit Hilfe eines neuen Stamms von Streptomyces griseoflavus.
Bicyclomycin ist als Antibiotikum mit Wirkung gegen gramnegative Bakterien, wie z. B. in The Journal of Antibiotics , Bd. XXV, Nr. 10,569-575 beschrieben, bekannt.
Neue Stämme von Streptomyces griseoflavus sind Stämme von Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus, wovon zwei Kulturen unter der Nr. FERM-P Nr. 1805 und 1806 am
Mittwoch, 20. Dez. 1972, beim Fermentation Research Insti tute, Agency of Industrial Science and Technology , Inage,
Chiba City, Japan, hinterlegt worden sind.
Dieser neue Mikroorganismus ist eine Varietät der Art
Streptomyces griseoflavus, die entweder aus bei der Stadt Fukuoka oder bei der Stadt Tottori in Japan gesammelten Bodenproben isoliert wurde.
Kulturen der lebenden Organismen wurden bei dem oben genannten Institut in Japan unter den erwähnten Bezeichnungen hinterlegt und werden in diesem Text als Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus bezeichnet.
Selbstverständlich ist das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin nicht auf die Verwendung der hierin beschriebenen einzelnen Organismen beschränkt; es umschliesst auch die Verwendung von Mutanten, die auf üblichem Wege, wie z. B. durch Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Stickstoffloste und dergleichen, aus dem beschriebenen Organismus hergestellt werden.
Die Stämme von Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P Nr.1805 und 1806 haben folgende morphologische, züchterische und physiologische Eigenschaften.
1. Morphologische Eigenschaften:
Die Morphologie der Kulturen wurde an bei 30 "C während 10 bis 14 Tagen auf Czapeks-Agar oder auf anorganischem Salz-Stärke-Agar gewachsenem Luftmyzel beobachtet, wobei beide Kulturen die gleichen morphologischen Eigenschaften, wie folgt, besitzen:
Das Luftmyzel dieser Kulturen ist reichlich und eng verzweigt und an manchen Orten gekrümmt. Die Spitzen der Luftmyzel sind geöffnet oder geschlossen, spiralförmig und formen eine Konidiakette.
Ein Sporangium, Sklerotium und eine Zoospore werden nicht beobachtet. Das Konidium ist rund bis viereckig und leicht unregelmässig, wobei seine Oberflächen warzenartig sind.
2. Kultureigenschaften:
Diese Stämme haben die folgenden Kultureigenschaften, wenn sie, falls nichts anderes angegeben ist, während 10 bis 15 Tagen bei einer Temperatur von unter 30 "C in den angegebenen Medien gewachsen sind:
Medium FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806 Czapeks-Agar G: grau, kleine Kolonien dunkelgrau, nicht ausgebreitet
A: dunkelgrau, pulverartig dunkelgrau, pulverartig
SP: kein kein Glucose-Asparagin-Agar G: mattgelb, kleine Kolonien mattgelb
A: mattgrau, pulverartig, mattgrau, pulverartig, reichlich reichlich
SP: kein kein Glyzerin-Asparagin-Agar G: mattbraun, etwas faltig mattbraun
A: weiss, pulverartig, dünn mattgrau, pulverartig, etwas dünn
SP: kein kein Tyrosin-Agar G: dunkelgelb-grau, kleine gelblich-braun, kleine
Kolonien Falten
A: dunkelgrau, pulverartig: der matt grünlich-weiss, untere Teil; weiss, pulverartig pulverartig
SP:
kein kein Nähragar G: mattgelb, kleine Kolonien mattgelb, kleine
Kolonien
A: weiss, pulverartig weiss, pulverartig
SP: kein kein
Medium FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806
Hefe-Malz-Agar G: dick, braun dick brauen
A: dunkelgrau, pulverartig, mausgrau, pulverartig, reichlich reichlich
SP: kein kein
Hafergrütze-Agar G: grau, kleine Kolonien grau, kleine Kolonien
A: gräulichweiss, pulverartig tief grau, pulverartig, reichlich
SP: gelb mattgelb
Pepton-Hefe-Eisen-Agar G: kein Wachstum mattgelb, matt A: mattgrau, pulverartig
SP: kein
Anorganische G: mattgelb, kleine Kolonien gräulich-gelb, mit
Salze-Stärke-Agar schwarzen, kleinen
Kolonien
A: grau, pulverartig dunkelgrau, pulverartig, reichlich
SP: kein kein
Gelatine-Versuch G: braun, matt in der braun, matt in der (während 20 Tagen Flüssigkeit Flüssigkeit bei Raumtemperatur)
A: kein kein
SP: kein kein
Milch G: mattrosa, ringförmig mattbraun, ringförmig
A:
mattweiss, pulverartig mattweiss, pulverartig
SP: mattrosa kein
G: Substratwachstum A: Luftmyzel SP: lösliches Pigment 3. Physiologische Eigenschaften:
FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806 Fürs Wachstum bestmögliche Temperatur 30 "C 30 "C (schwach bei 37"C)
Fürs Wachstum bestmöglicher pH-Wert 6-8 6-8
Produktion melaninartigen Pigments negativ negativ Tyrosinase-Reaktion negativ negativ
Stärkehydrolyse mittel mittel Verflüssigung von Gelatine ziemlich stark ziemlich stark
Peptonisierung von Milch negativ negativ
Koagulierung von Milch negativ negativ
4.
Verwertung von Kohlenstoffquellen nach dem Pridham-Gottlieb-Verfahren:
Kohlenstoffquellen FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806
L-Arabinose + +
D-Xylose +
D-Glucose + ++
D-Fruchtose + +
Rhamnose + +
Rohrzucker
Raffinose + +
D-Mannit + ++ i-Inosit + + + + : hervorragende Verwertung geringe Verwertung +: Verwertung -: keine Verwertung
Durch die oben erwähnte Beobachtung mikrobiologischer Eigenschaften erhält man folgende Charakteristika dieser Stämme:
1. Das Luftmyzel ist eng verzweigt und in manchen Teilen gekrümmt. Die Spitzen der Luftmyzel sind häufig spiralförmig geöffnet oder geschlossen. Die Oberfläche des Konidiums ist warzenartig.
2. Die Farbe des genügend gewachsenen Luftmyzelplexus nimmt eine matt- bis dunkelgraue Färbung an. Das Substratwachstum nimmt eine gelbe bis graue Farbe an, hat aber nicht die gleiche Farbe wie das verwendete Medium. Lösliches Pigment wird in einem synthetischen Medium nicht beobachtet, jedoch auf einem Hafergrütze-Agar in gelber und auf Milch in mattrosa Farbe. In anderen Medien werden keine löslichen Pigmente beobachtet. Beide Stämme sind nicht chromogen.
3. Die hydrolytische Wirkung auf Stärke ist mittelmässig, währenddem sie auf Gelatine eher stark ist. Peptonisierung und Koagulierung von Milch werden jedoch nicht beobachtet.
4. Viele Kohlenstoffquellen werden assimiliert, die Assimilation von Rohrzucker ist jedoch negativ.
Durch Nachforschen in den Werken The Actinomycetes Band 2(1961), von Waksman, und The Internationl Streptomyces Project Reports , von E. B. Shirling und D. Gottlieb, nach Stämmen mit den oben beschriebenen Eigenschaften wurden folgende Arten mit Stämmen analoger Eigenschaften wie die der FERM-P Nr.1805 und Nr.1806 gefunden: Streptomyces cacaoi, Streptomyces pseudogriseolus, Streptomyces griseoflavus und Streptomyces echinatus.
In der folgenden Tabelle wird der FERM-P Nr. 1805-Stamm mit diesen ähnlichen Stämmen verglichen. Der FERM-P Nr.
1805-Stamm unterscheidet sich durch folgende Merkmale von den ähnlichen Stämmen:
1. Streptomyces cacaoi unterscheidet sich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm durch glatte Oberfläche des Streptomyces cacaoi Konidiums, bei Beobachtung auf Rohrzuckernitrat Agar und auf Nähragar, bei Hydrolyse von Stärke und Gelatine und bei Assimilation von Kohlenstoffquellen usw.
2. Streptomyces pseudogriseolus unterscheidet sich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm bei der Hydrolyse und bei der Assimilation von Kohlenstoffquellen usw.
3. Streptomyces griseoflavus unterscheidet sich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm durch die dornige Oberfläche des Streptomyces griseoflavus Konidiums und auch etwas bei der Beobachtung auf Rohrzucker-Nitrat-Agar usw.
4. Streptomyces echinatus unterscheidet sich beträchtlich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm durch die dornige Oberfläche des Streptomyces echinatus Konidiums, bei der Beobachtung auf Rohrzucker-Nitrat-Agar und Rohrzucker-Asparagin-Agar und bei der Hydrolyse und Assimilation von Kohlenstoffquel lenusw.
Durch obige Beobachtungen kommt man zum Resultat, dass der FERM-P Nr. 1805-Stamm am nächsten mit dem Streptomyces griseoflavus verwandt ist, wobei der Unterschied zwischen beiden nicht sehr gross ist; d. h., die Oberfläche des Konidiums der beiden unterscheidet sich dadurch, dass sie beim Streptomyces griseoflavus kurzdornig ist, währenddem sie beim FERM-P Nr. 1805-Stamm warzenartig ist. Deshalb können die Stämme FERM-P Nr.1805 und FERM-P Nr.1806, welch letztgenannter fast keine Unterschiede zum erstgenannten aufweist, als Variante des Streptomyces griseoflavus mit dem Namen Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus betrachtet werden.
Vergleich von FERM-P Nr. 1805 mit ähnlichen Stämmen
FERM-P Streptomyces Streptomy- Streptomyces Streptomyces
Nr. 1805 cacaoi ces pseudo- griseoflavus echinatus griseolus Morphologische Luftmyzel offene oder lang, offene viele ge- gerade, offene offene Spiralen Eigenschaften geschlossene Spiralen geschlossene Spiralen
Spiralen Spiralen
Konidium oberfläche warzenartig glatt dornig lang-dornig Rohrzucker- Substrat- grau, kleine gelb, mit rötlich braunnitrat-Agar wachstum Kolonien der Zeit orange
Farbwechsel nach rötlich braun
Luftmyzel dunkelgrau grau mit grau-gelblich weissem Rand grau
Lösliches kein kein mattgrün
Pigment gelb Glyzerin- Substrat- farblos- grünlich nitrat-Agar wachstum gräuliche zitronengelb
Lederfarbe gelb-grün
Luftmyzel gräuliche weiss-gelbgrau
Lederfarbe,
pulverartig
Lösliches kein grünlich
Pigment gelb
Substrat- mattgelb zitronengelb gold-grünlich wachstum kleine gelb-grünlich
Kolonien grau Glucose- Luftmyzel mattgrau, grüngrau, grau-rötlich Asparagin- pulverartig pulverartig purpurn Agar lösliches kein kein kein
Pigment Fl ltM-I' Strenlomyces Streptomy- Streptomyces Streptomyces
Nr.
1805 cacafli ccs pscudo- griseoflavus echinatus griseolus Nähragar Substrat- mattgelb, braun farblos kremfarbig mattgelb wachstum kleine
Kolonien
Luftmyzel weiss, pul- elfenbeinern, weiss weiss-grau kein verartig kleinfleckig lösliches kein kein kein oder kein oder kein
Pigment mattbraun grünlich grau Hydrolytische Reaktionsfähig- mittel stark stark schwach schwach keit auf Stärke Hydrolytische Reaktionsfähig- ziemlich stark schwach- positiv negativ keit auf Gelatinierung stark mittel Peptonisierung von Milch negativ schwach positiv stark Koagulierung von Milch negativ schwach negativ stark Verwertung von L-Arabinose f + + + + Kohlenstoff- D-Xylose + + + + quellen D-Fructose + + + + +
Rhamnose + - + +
+ Verwertung von Rohrzucker - + Kohlenstoff- Rafinose + - - + quellen D-Mannit + + + + + i-Inosit + - + + + Produktion von Antibiotikum Bicyclomycin Cacaomycin Xanthomycin- Griseoflavin Echinomycin ähnliche
Substanz + : Verwertung ¯ geringe Verwertung -: keine Verwertung
Das Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin ist dadurch gekennzeichnet, dass man den neuen Stamm des Streptomyces griseoflavus oder eine Mutante desselben in einem wässrigen Nährmedium als Oberflächenkultur oder unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis besagtem Medium eine antibiotische Wirkung durch Entstehen von Bicyclomycin verliehen wird, worauf man dann daraus Bicyclomycin gewinnt.
Das Nährmedium, das in der Regel assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze aufweist, kann ein beliebiges für Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus verwendbares Medium sein.
Die bevorzugten sich im Nährmedium befindlichen Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, z. B. Glucose, Fructose, Mannit und Stärke. Andere verwendbare Quellen sind Arabinose, Inosit, Raffinose, Dextrin und ähnliche.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind sowohl Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojamehl, Maisquellflüssigkeit, getrocknete Hefe und ähnliche als auch anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie z. B.
Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und ähnliche), Urea und ähnliche.
Obwohl die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen vorzugsweise zusammen verwendet werden, braucht man sie dennoch nicht in reiner Form zu benützen, weil weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen Mineralnährstoffe enthalten, auch zur Anwendung gebracht werden können.
Gewünschtenfalls kann das Medium Mineralsalze, z. B. Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Magnesiumsalze, Kupfersalze und ähnliches enthalten. Nötigenfalls kann man, besonders wenn das Kulturmedium beträchtlich schäumt, ein Antischaummittel beigeben, wie z. B. flüssiges Paraffin, ein fettes Öl, ein Pflanzenöl, ein Mineralöl und/oder ein Silicon.
Wie zur Herstellung von anderen Antibiotika in grossen Mengen werden auch zur Herstellung von Bicyclomycin in grossen Mengen submerse aerobe Kultureigenschaften bevorzugt. Zur Herstellung von kleinen Mengen kann man eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder einer Flasche verwenden. Wenn man die Kultur in grossen Behältern züchtet, ist es von Vorteil, die vegetative Form des Organismus zum Okulieren im Herstellungsbehälter zu verwenden, um Wachstumsverzögerungen im Herstellungsverfahren des Bicyclomycins zu vermeiden. Deshalb ist es auch wünschenswert, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Organismus durch Inokulieren einer relativ kleinen Menge des Kulturmediums mit Myzelsporen des Organismus herzustellen, sie zu züchten und den gezüchteten Vegetativimpfstoff aseptisch in grosse Behälter überzuführen.
Das zur Herstellung des vegetativen Impfstoffes benötigte Medium kann im wesentlichen gleich oder verschieden sein vom zur Herstellung des Bicyclomycins benötigten Medium.
Schütteln und Luftzufuhr des Kulturgemisches kann man auf verschiedene Weise bewerkstelligen. Schütteln kann man mit einem Rührer oder einem ähnlichen mechanischen Instrument, durch Rotieren oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pumpinstrumente oder durch Durchblasen von steriler Luft durch das Medium. Luftzuführen kann man dadurch, dass man sterile Luft durch das Fermentationsgemisch durchbläst.
Die Fermentation wird gewöhnlich während 30 bis 100 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 20 bis 40 "C, vor zugsweise bei ungefähr 30 "C, durchgeführt.
Nach diesem Herstellungsverfahren erzeugtes Bicyclomy cin kann man durch eines der üblichen für Antibiotika verwen deten Verfahren aus dem Kulturmedium gewinnen.
Der grösste Teil des Bicyclomycins wird normalerweise im Kulturnährbouillon gefunden, so dass man das Bicyclomycin durch übliche Verfahren, z. B. durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln oder durch Adsorption, von der Flüssigkeit, die man durch Filtrieren oder Zentrifugieren des Nährbouillons erhält, trennen kann.
So kann man ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zum Filtrat zugeben, um die Löslichkeit von Verunreinigungen herabzusetzen, so dass man sie entfernen und die übriggebliebene wässrige Phase verdampfen kann, worauf man das gewünschte Antibiotikum erhält. Beispiele für auf diese Art verwendbare Lösungsmittel sind Pyridin, Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanol, und wässrige Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, z. B.
wässrige Alkohole, wie z. B. wässriges Methanol, Äthanol und
Butanol. Man kann auch Gemische von mit Wasser mischbaren und nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln verwenden; in diesen Fällen wird das gewünschte Antibiotikum durch das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel extrahiert. So kann man Gemische eines Alkohols mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Ketone (z. B. Aceton), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform), Alkylester von Fettsäuren (z. B. Äthylacetat), Benzol oder Pyridin verwenden.
Andererseits kann man das Antibiotikum auch mit einem Adsorptionsmittel, z. B. Kieselgur, aktiviertem Aluminiumoxyd, Silicagel, Aktivkohle oder Kieselsäure, aus dem Filtrat gewinnen. Des weiteren kann man das Antibiotikum mit grossporigen nicht ionischen Adsorptionsharzen aus dem Filtrat entfernen. Bevorzugte Harze sind Polystyrolharze mit einer Oberfläche von 100 bis 1000 m2 pro Gramm, z. B. mit Divinylbenzol vernetzte Styrolpolymere, die unter den Handelsbezeichnungen Amberlit XAD-1, XAD-2, XAD4, XAD-5 (hergestellt von Rohm & Haas Co.) oder unter der Handelsbezeichnung Diaion HP-20, HP-30, HP40, HP-50 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co.) Verwendung finden. Das durch ein Adsorbens oder grossporiges nicht ionisches Adsorptionsharz adsorbierte Antibiotikum wird durch die Verwendung eines geeigneten organischen Lösungsmittels, wie z. B.
Pyridin, Alkohol, wässriger Alkohol oder ein Gemisch aus Alkohol und einem anderen organischen Lösungsmittel, leicht eluiert.
Ein geeignetes Verfahren, um das Antibiotikum aus dem Extrakt oder dem Eluat zu isolieren, besteht darin, dass man das Lösungsmittel bis auf ein relativ kleines Volumen verdampft und das Antibiotikum durch Zugabe eines geeigneten Mittels ausfällt
Durch Umkristallisieren oder Chromatographie kann man das Antibiotikum reinigen. Zum Umkristallisieren verwendbare Lösungsmittel sind z. B. Aceton, wässriges Aceton, Alkohol (z. B. Methanol oder Äthanol), wässriger Alkohol oder Äthylacetat. Die zur Rückgewinnung des Antibiotikums verwendbaren Adsorptionsmittel können auch zur chromatographischen Reinigung wirkungsvoll benützt werden. Als Elutionsmittel kann man diejenigen gebrauchen, die man auch zur Gewinnung der Antibiotika verwendet
Die vorliegenden Beispiele sollen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen.
Beispiel 1
Es wird ein Fermentationsmedium aus folgenden Bestandteilen zubereitet: Stärke 2Gew.-% Baumwollsamenmehl 1 Gew.-% Glutenmehl 1 Gew.-% Sojamehl 1 Gew.-%
Ebios (registrierte Handelsmarke) 1 Gew.-%
KH2PO4 2,1 Gew.-% Na2HPO4- 12H20 1,4 Gew.-%
Leitungswasser zur Genüge
20 Liter dieses Mediums werden in einem 30-Liter-Fermenter auf übliche Weise sterilisiert und dann aseptisch mit einer Vorkultur inokuliert; letztere wurde hergestellt, indem man den Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P Nr.
1805-Stamm in einer Menge wie oben erwähnt, während 2 Tagen in einem Betrag von 3 Vol.-% des Mediums züchtet. Die Hauptkultur wurde während 3 Tagen bei 30 "C herangezüchtet Während der Inkubationszweit wurde der Nährbouillon mit einem Rührer, der in 1 Minute 300 Umdrehungen vollführte, gerührt, während sterile Luft in einer Menge von 20 Litern pro Minute durchgeblasen wurde. Nach vollendeter Fermentation wurde dem Kulturbouillon zuerst 2% Kieselgur zugefügt, und dann die Myzel abfiltriert. Dem so erhaltenen Filtrat (20 Liter) wurde 400 g Aktivkohle zugegeben, das Gemisch während 5 Minuten gerührt und dann die Aktivkohle durch Filtrieren gesammelt Die Elution des aktiven Materials aus der Aktivkohle wurde mit 21/2 Liter 80%igem wässrigem Aceton durchgeführt.
Die Elution wurde zweimal wiederholt. Das Eluat (ungefähr 5 Liter) wurde auf ein Volumen von 200 ml konzentriert und dann lyophilisiert. Zum so erhaltenen lyophilisierten Pulver (ungefähr 60 g) wurde 50 ml Methanol zur Entfernung von unlöslichem Material zugegeben, worauf man die Lösung zu einem Sirup konzentrierte. Der Sirup wurde durch eine Silikagelsäule geleitet, und diese Säule mit Chloroform : Methanol (10 1) entwickelt. Die aktivierten Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu einem weissen Pulver getrocknet.
Das Pulver wurde aus Aceton kristallisiert, worauf man 900 mg Bicyclomycin in Form von weissen Kristallen erhielt. Das IR Spektrum dieser Kristalle ist aus Fig. 1 ersichtlich. Man kann daraus ersehen, dass es identisch ist mit dem bekannten Spektrum von Bicycylomycin.
Beispiel 2
Es wurde 600 mg Bicyclomycin in Form von weissen Kristallen durch ein im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebenes Verfahren erhalten mit der Ausnahme, dass man den Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P Nr.1806 Stamm verwendet. Das IR-Spektrum der Kristalle war identisch mit dem bekannten Spektrum von Bicyclomycin.
Beispiel 3
Ein Fermentationsbouillon, erhalten durch auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschriebenes Fermentieren, wurde filtriert. Das Filtrat (20 Liter) wurde durch eine Säule mit nicht ionischem Adsorptionsharz, Amberlit XAD4 ( Amberlit ist eine registrierte Handelsmarke), geleitet. Nachdem die Kolonne mit Wasser gewaschen worden war, wurde das aktive Material mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, worauf man das Eluat konzentriert und dann lyophilisiert hat. Zum so erhaltenen lyophilisierten Pulver wurde zum Entfernen von unlöslichem Material 50 ml Methanol zugegeben, worauf man die Lösung zu einem Sirup konzentrierte.
Der Sirup wurde durch eine Silikagelsäule geleitet, und die Säule darauf mit Chloroform: Methanol (10: 1) entwickelt Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu einem weissen Pulver getrocknet. Das weisse Pulver wurde aus Aceton kristallisiert, worauf man 1,5 g Bicyclomycin in Form von weissen Kristallen erhielt. Das IR-Spektrum dieser Kristalle war identisch mit dem bekannten Spektrum von Bicyclomycin.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of bicyclomycin, characterized in that a strain of Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus is grown in an aqueous nutrient medium as a surface culture or under submerged aerobic conditions until said medium is given an antibiotic effect by the formation of bicyclomycin, whereupon one then the bicyclomycin wins from it.
2. The method according to claim, characterized in that a strain of Streptomyces griseoflavus var.
bicyclomyceticus FERM-P No. 1805.
3. The method according to claim, characterized in that a strain of Streptomyces griseoflavus var.
bicyclomyceticus FERM-P No. 1806.
4. The method according to claim, characterized in that Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus is grown in an aqueous nutrient medium which contains a carbon and nitrogen source.
The present invention relates to a method for producing bicyclomycin using a new strain of Streptomyces griseoflavus.
Bicyclomycin is an antibiotic with action against gram-negative bacteria, such as. B. in The Journal of Antibiotics, Vol. XXV, No. 10,569-575, known.
New strains of Streptomyces griseoflavus are strains of Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus, two cultures of which under the number FERM-P No. 1805 and 1806 am
Wednesday, December 20, 1972, at the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Inage,
Chiba City, Japan.
This new microorganism is a variety of the species
Streptomyces griseoflavus isolated from soil samples collected from either the city of Fukuoka or the city of Tottori in Japan.
Cultures of living organisms have been deposited with the above-mentioned institute in Japan under the names mentioned and are referred to in this text as Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus.
Of course, the process according to the invention for the production of bicyclomycin is not restricted to the use of the individual organisms described herein; it also encompasses the use of mutants which are commonly used, such as. B. by X-rays, UV rays, nitrogen mustards and the like, from the described organism.
The strains of Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus FERM-P No. 1805 and 1806 have the following morphological, breeding and physiological properties.
1. Morphological properties:
The morphology of the cultures was observed on aerial mycelium grown at 30 ° C. for 10 to 14 days on Czapeks agar or on inorganic salt-starch agar, both cultures having the same morphological properties as follows:
The aerial mycelium of these cultures is plentiful and closely branched and curved in some places. The tips of the aerial mycelium are open or closed, spiral and form a conidia chain.
A sporangium, sclerotium and a zoospore are not observed. The conidium is round to quadrangular and slightly irregular, its surfaces being wart-like.
2. Cultural characteristics:
These strains have the following cultural properties if, unless otherwise stated, they have grown for 10 to 15 days at a temperature below 30 ° C. in the media indicated:
Medium FERM-P No. 1805 FERM-P No. 1806 Czapeks agar G: gray, small colonies dark gray, not spread out
A: dark gray, powdery dark gray, powdery
SP: none no glucose-asparagine agar G: dull yellow, small colonies dull yellow
A: matt gray, powdery, matt gray, powdery, abundant abundant
SP: none no glycerine-asparagine agar G: matt brown, somewhat wrinkled matt brown
A: white, powdery, thin matt gray, powdery, somewhat thin
SP: none no tyrosine agar G: dark yellow-gray, small yellowish-brown, small
Colonies fold
A: dark gray, powdery: the matt greenish-white, lower part; white, powdery powdery
SP:
none no nutrient agar G: dull yellow, small colonies dull yellow, small
Colonies
A: white, powdery white, powdery
SP: no no
Medium FERM-P No. 1805 FERM-P No. 1806
Yeast-Malt Agar G: Brew thick, brown thick
A: dark gray, powdery, mouse gray, powdery, abundant plentiful
SP: no no
Oat groat agar G: gray, small colonies gray, small colonies
A: greyish white, powdery deep gray, powdery, plentiful
SP: yellow matt yellow
Peptone-yeast-iron agar G: no growth matt yellow, matt A: matt gray, powdery
SP: no
Inorganic G: dull yellow, small colonies greyish-yellow, with
Salts starch agar black, small
Colonies
A: gray, powdery dark gray, powdery, plentiful
SP: no no
Gelatin test G: brown, matt in the brown, matt in the (liquid for 20 days at room temperature)
A: no no
SP: no no
Milk G: matt pink, ring-shaped matt brown, ring-shaped
A:
matt white, powdery matt white, powdery
SP: matt pink no
G: substrate growth A: aerial mycelium SP: soluble pigment 3. Physiological properties:
FERM-P No. 1805 FERM-P No. 1806 The best possible temperature for growth 30 "C 30" C (weak at 37 "C)
The best possible pH for growth 6-8 6-8
Production of melanin-like pigments negative negative Tyrosinase reaction negative negative
Starch hydrolysis medium medium Liquefaction of gelatin fairly strong fairly strongly
Peptonization of milk negative negative
Coagulation of milk negative negative
4th
Utilization of carbon sources according to the Pridham-Gottlieb process:
Carbon sources FERM-P No. 1805 FERM-P No. 1806
L-arabinose + +
D-xylose +
D-glucose + ++
D-fruitose + +
Rhamnose + +
Cane sugar
Raffinose + +
D-Mannitol + ++ i-Inosit + + + +: excellent utilization low utilization +: utilization -: no utilization
By observing the microbiological properties mentioned above, the following characteristics of these strains are obtained:
1. The aerial mycelium is closely branched and curved in some parts. The tips of the aerial mycelium are often open or closed in a spiral. The surface of the conidium is wart-like.
2. The color of the adequately grown aerial mycelial plexus assumes a matt to dark gray color. The substrate growth takes on a yellow to gray color, but is not the same color as the medium used. Soluble pigment is not observed in a synthetic medium, but on oatmeal agar in yellow and on milk in matt pink color. No soluble pigments are observed in other media. Both strains are not chromogenic.
3. The hydrolytic effect on starch is moderate, while it is rather strong on gelatin. However, peptonization and coagulation of milk are not observed.
4. Many carbon sources are assimilated, but the assimilation of cane sugar is negative.
By researching The Actinomycetes Volume 2 (1961), by Waksman, and The Internationl Streptomyces Project Reports, by EB Shirling and D. Gottlieb, for strains with the characteristics described above, the following species were identified with strains of analogous characteristics to those of the FERM P No.1805 and No.1806 found: Streptomyces cacaoi, Streptomyces pseudogriseolus, Streptomyces griseoflavus and Streptomyces echinatus.
The following table compares the FERM-P No. 1805 strain with these similar strains. The FERM-P no.
1805 strain differs from similar strains in the following ways:
1. Streptomyces cacaoi differs from the FERM-P No. 1805 strain by the smooth surface of the Streptomyces cacaoi conidium, when observed on cane sugar agate and nutrient agar, upon hydrolysis of starch and gelatin and upon assimilation of carbon sources etc.
2. Streptomyces pseudogriseolus differs from FERM-P No. 1805 strain in hydrolysis and assimilation of carbon sources, etc.
3. Streptomyces griseoflavus differs from the FERM-P No. 1805 strain by the thorny surface of the Streptomyces griseoflavus conidium and also somewhat when observed on cane sugar-nitrate agar etc.
4. Streptomyces echinatus differs considerably from the FERM-P No. 1805 strain in the thorny surface of the Streptomyces echinatus conidium, in the observation of cane sugar-nitrate agar and cane sugar-asparagine agar and in the hydrolysis and assimilation of carbon sources etc.
The above observations lead to the conclusion that the FERM-P No. 1805 strain is most closely related to the Streptomyces griseoflavus, the difference between the two being not very great; d. that is, the surface of the conidium of the two differs in that it is short-thorned in the Streptomyces griseoflavus, while it is wart-like in the FERM-P No. 1805 strain. Therefore, the strains FERM-P No. 1805 and FERM-P No. 1806, which latter has almost no differences from the former, can be regarded as a variant of Streptomyces griseoflavus with the name Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus.
Comparison of FERM-P No. 1805 with similar strains
FERM-P Streptomyces Streptomy- Streptomyces Streptomyces
No. 1805 cacaoi ces pseudogriseoflavus echinatus griseolus Morphological aerial mycelium open or long, open many straight, open open spirals Properties closed spirals closed spirals
Spirals spirals
Conidium surface wart-like smooth thorny long-thorny cane sugar substrate gray, small yellow, with reddish brown nitrate agar growth colonies of the time orange
Color change to reddish brown
Air mycelium dark gray gray with gray-yellowish white border gray
Soluble no no matte green
Pigment yellow glycerine substrate - colorless greenish nitrate agar growth greyish lemon yellow
Leather color yellow-green
Aerial mycelium greyish white-yellow-gray
Leather color,
powdery
Soluble no greenish
Pigment yellow
Substrate-matt yellow lemon yellow gold-greenish growth small yellow-greenish
Colonies gray glucose aerial mycelium matt gray, green gray, gray-reddish asparagine powdery powdery purple agar soluble none none none
Pigment Fl ltM-I 'Strenlomyces Streptomy- Streptomyces Streptomyces
No.
1805 cacafli ccs pscudo- griseoflavus echinatus griseolus nutrient agar substrate- matt yellow, brown colorless cream-colored matt yellow growth small
Colonies
Aerial mycelium white, powder ivory, white white-gray no such little spotty soluble no no no or no or none
Pigment dull brown greenish gray Hydrolytic reactive agent strong strong weak weak weakness on starch Hydrolytic reactive ability - fairly strong weak weak positive negative on gelatinization strong medium Peptonization of milk negative weak positive strong Coagulation of milk negative weak negative negative strong utilization of L-arabinose f + + + + Carbon D-xylose + + + + swell D-fructose + + + + +
Rhamnose + - + +
+ Utilization of cane sugar - + carbon rafinose + - - + swell D-mannitol + + + + + i-inositol + - + + + Production of antibiotic Bicyclomycin Cacaomycin Xanthomycin- Griseoflavin Echinomycin-like
Substance +: utilization ¯ low utilization -: no utilization
The process for producing bicyclomycin is characterized in that the new strain of Streptomyces griseoflavus or a mutant thereof is grown in an aqueous nutrient medium as a surface culture or under submerged aerobic conditions until said medium is given an antibiotic effect by the formation of bicyclomycin, whereupon then bicyclomycin wins from it.
The nutrient medium, which generally has assimilable carbon and nitrogen sources and inorganic salts, can be any medium which can be used for Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus.
The preferred carbon sources in the nutrient medium are carbohydrates, e.g. B. glucose, fructose, mannitol and starch. Other sources that can be used are arabinose, inositol, raffinose, dextrin and the like.
Preferred nitrogen sources are meat extract, peptone, gluten flour, cottonseed flour, soy flour, corn steep liquor, dried yeast and the like as well as inorganic and organic nitrogen compounds, such as. B.
Ammonium salts (e.g. ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium phosphate and the like), urea and the like.
Although the carbon and nitrogen sources are preferably used together, they do not need to be used in a pure form, because less pure materials containing traces of growth factors and substantial amounts of mineral nutrients can also be used.
If desired, the medium can include mineral salts, e.g. B. calcium carbonate, sodium or potassium phosphate, sodium or potassium chloride, magnesium salts, copper salts and the like. If necessary, especially if the culture medium foams considerably, an anti-foaming agent can be added, e.g. B. liquid paraffin, a fatty oil, a vegetable oil, a mineral oil and / or a silicone.
As for the production of other antibiotics in large quantities, submerged aerobic cultural properties are also preferred for the production of bicyclomycin in large quantities. To produce small quantities, a shake or surface culture in a flask or bottle can be used. If the culture is grown in large containers, it is advantageous to use the vegetative form of the organism for oculation in the production container in order to avoid growth delays in the production process of the bicyclomycin. Therefore, it is also desirable to first prepare a vegetative vaccine of the organism by inoculating a relatively small amount of the culture medium with mycelium spores of the organism, to grow it and to aseptically transfer the cultured vegetative vaccine into large containers.
The medium required to produce the vegetative vaccine can be substantially the same or different from the medium required to produce the bicyclomycin.
The culture mixture can be shaken and supplied with air in various ways. One can shake with a stirrer or a similar mechanical instrument, by rotating or shaking the fermenter, by various pumping instruments or by blowing sterile air through the medium. Air can be supplied by blowing sterile air through the fermentation mixture.
The fermentation is usually carried out for 30 to 100 hours at a temperature between 20 to 40 "C, preferably at about 30" C.
Bicyclomy cin produced by this production process can be obtained from the culture medium by one of the customary methods used for antibiotics.
Most of the bicyclomycin is normally found in the culture broth, so that the bicyclomycin can be obtained by conventional methods, e.g. B. by adding organic solvents or by adsorption, from the liquid obtained by filtering or centrifuging the nutrient broth.
For example, a water-miscible organic solvent can be added to the filtrate to reduce the solubility of contaminants so that they can be removed and the remaining aqueous phase evaporated to give the desired antibiotic. Examples of solvents which can be used in this way are pyridine, alcohols, e.g. As methanol, ethanol and butanol, and aqueous solutions of water-miscible organic solvents, e.g. B.
aqueous alcohols, such as. B. aqueous methanol, ethanol and
Butanol. Mixtures of water-miscible and immiscible organic solvents can also be used; in these cases the desired antibiotic is extracted by the water-immiscible organic solvent. So you can mix an alcohol with organic solvents, e.g. B. ketones (e.g. acetone), halogenated hydrocarbons (e.g. chloroform), alkyl esters of fatty acids (e.g. ethyl acetate), benzene or pyridine.
On the other hand, the antibiotic can also be used with an adsorbent, e.g. B. diatomaceous earth, activated aluminum oxide, silica gel, activated carbon or silica, from the filtrate. Furthermore, the antibiotic can be removed from the filtrate using large-pore, non-ionic adsorption resins. Preferred resins are polystyrene resins with a surface area of 100 to 1000 m2 per gram, e.g. B. with styrene polymers crosslinked with divinylbenzene, which are sold under the trade names Amberlit XAD-1, XAD-2, XAD4, XAD-5 (manufactured by Rohm & Haas Co.) or under the trade name Diaion HP-20, HP-30, HP40, HP -50 (manufactured by Mitsubishi Chemical Co.) can be used. The antibiotic adsorbed by an adsorbent or large-pore non-ionic adsorption resin is by the use of a suitable organic solvent, such as. B.
Pyridine, alcohol, aqueous alcohol or a mixture of alcohol and another organic solvent, easily eluted.
A suitable method for isolating the antibiotic from the extract or the eluate is to evaporate the solvent to a relatively small volume and to precipitate the antibiotic by adding a suitable agent
The antibiotic can be purified by recrystallization or chromatography. Solvents that can be used for recrystallization are e.g. B. acetone, aqueous acetone, alcohol (e.g. methanol or ethanol), aqueous alcohol or ethyl acetate. The adsorbents that can be used to recover the antibiotic can also be used effectively for chromatographic purification. As an eluent you can use those that are also used to obtain the antibiotics
The present examples are intended to illustrate the present invention.
example 1
A fermentation medium is prepared from the following components: starch 2% by weight cottonseed flour 1% by weight gluten flour 1% by weight soybean meal 1% by weight
Ebios (registered trademark) 1% by weight
KH2PO4 2.1% by weight Na2HPO4-12H20 1.4% by weight
Tap water enough
20 liters of this medium are sterilized in a 30 liter fermenter in the usual way and then aseptically inoculated with a preculture; the latter was produced by using Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P no.
1805 strain in an amount as mentioned above, growing for 2 days in an amount of 3% by volume of the medium. The main culture was grown for 3 days at 30 "C. During the incubation period, the nutrient broth was stirred with a stirrer which made 300 revolutions in 1 minute while sterile air was blown through at a rate of 20 liters per minute. After completion of the fermentation, the Culture broth was first added 2% diatomaceous earth and then the mycelium was filtered off, 400 g of activated carbon were added to the filtrate (20 liters) thus obtained, the mixture was stirred for 5 minutes and then the activated carbon was collected by filtration. The elution of the active material from the activated carbon was carried out with 21/2 liters of 80% aqueous acetone performed.
The elution was repeated twice. The eluate (approximately 5 liters) was concentrated to a volume of 200 ml and then lyophilized. To the lyophilized powder thus obtained (about 60 g), 50 ml of methanol was added to remove insoluble material, and the solution was concentrated to a syrup. The syrup was passed through a silica gel column and this column was developed with chloroform: methanol (10 1). The activated fractions were collected, concentrated and dried to a white powder.
The powder was crystallized from acetone to give 900 mg of bicyclomycin in the form of white crystals. The IR spectrum of these crystals can be seen in FIG. 1. It can be seen from this that it is identical to the known spectrum of bicycylomycin.
Example 2
600 mg of bicyclomycin in the form of white crystals was obtained by a procedure essentially as described in Example 1, with the exception that the Streptomyces griseoflavus var. Bicyclomyceticus FERM-P No. 1806 strain was used. The IR spectrum of the crystals was identical to the known spectrum of bicyclomycin.
Example 3
A fermentation broth obtained by fermentation similar to that described in Example 1 was filtered. The filtrate (20 liters) was passed through a column of non-ionic adsorption resin, Amberlit XAD4 (Amberlit is a registered trademark). After the column was washed with water, the active material was eluted with 50% aqueous acetone. The active fractions were collected, the eluate was concentrated and then lyophilized. To the lyophilized powder thus obtained, 50 ml of methanol was added to remove insoluble material, and the solution was concentrated to a syrup.
The syrup was passed through a silica gel column and the column then developed with chloroform: methanol (10: 1). The active fractions were collected, concentrated and dried to a white powder. The white powder was crystallized from acetone, whereupon 1.5 g of bicyclomycin was obtained in the form of white crystals. The IR spectrum of these crystals was identical to the known spectrum of bicyclomycin.