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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm des Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus in einem wässrigen Nährmedium als Oberflächenkultur oder unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis besagtem Medium eine antibiotische Wirkung durch Entstehen von Bicyclomycin verliehen wird, worauf man dann das Bicyclomycin daraus gewinnt.
2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm des Streptomyces griseoflavus var.
bicyclomyceticus FERM-P Nr. 1805 züchtet.
3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm des Streptomyces griseoflavus var.
bicyclomyceticus FERM-P Nr. 1806 züchtet.
4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle beinhaltet, züchtet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin mit Hilfe eines neuen Stamms von Streptomyces griseoflavus.
Bicyclomycin ist als Antibiotikum mit Wirkung gegen gramnegative Bakterien, wie z. B. in The Journal of Antibiotics , Bd. XXV, Nr. 10,569-575 beschrieben, bekannt.
Neue Stämme von Streptomyces griseoflavus sind Stämme von Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus, wovon zwei Kulturen unter der Nr. FERM-P Nr. 1805 und 1806 am
Mittwoch, 20. Dez. 1972, beim Fermentation Research Insti tute, Agency of Industrial Science and Technology , Inage,
Chiba City, Japan, hinterlegt worden sind.
Dieser neue Mikroorganismus ist eine Varietät der Art
Streptomyces griseoflavus, die entweder aus bei der Stadt Fukuoka oder bei der Stadt Tottori in Japan gesammelten Bodenproben isoliert wurde.
Kulturen der lebenden Organismen wurden bei dem oben genannten Institut in Japan unter den erwähnten Bezeichnungen hinterlegt und werden in diesem Text als Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus bezeichnet.
Selbstverständlich ist das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin nicht auf die Verwendung der hierin beschriebenen einzelnen Organismen beschränkt; es umschliesst auch die Verwendung von Mutanten, die auf üblichem Wege, wie z. B. durch Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Stickstoffloste und dergleichen, aus dem beschriebenen Organismus hergestellt werden.
Die Stämme von Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P Nr.1805 und 1806 haben folgende morphologische, züchterische und physiologische Eigenschaften.
1. Morphologische Eigenschaften:
Die Morphologie der Kulturen wurde an bei 30 "C während 10 bis 14 Tagen auf Czapeks-Agar oder auf anorganischem Salz-Stärke-Agar gewachsenem Luftmyzel beobachtet, wobei beide Kulturen die gleichen morphologischen Eigenschaften, wie folgt, besitzen:
Das Luftmyzel dieser Kulturen ist reichlich und eng verzweigt und an manchen Orten gekrümmt. Die Spitzen der Luftmyzel sind geöffnet oder geschlossen, spiralförmig und formen eine Konidiakette.
Ein Sporangium, Sklerotium und eine Zoospore werden nicht beobachtet. Das Konidium ist rund bis viereckig und leicht unregelmässig, wobei seine Oberflächen warzenartig sind.
2. Kultureigenschaften:
Diese Stämme haben die folgenden Kultureigenschaften, wenn sie, falls nichts anderes angegeben ist, während 10 bis 15 Tagen bei einer Temperatur von unter 30 "C in den angegebenen Medien gewachsen sind:
Medium FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806 Czapeks-Agar G: grau, kleine Kolonien dunkelgrau, nicht ausgebreitet
A: dunkelgrau, pulverartig dunkelgrau, pulverartig
SP: kein kein Glucose-Asparagin-Agar G: mattgelb, kleine Kolonien mattgelb
A: mattgrau, pulverartig, mattgrau, pulverartig, reichlich reichlich
SP: kein kein Glyzerin-Asparagin-Agar G: mattbraun, etwas faltig mattbraun
A: weiss, pulverartig, dünn mattgrau, pulverartig, etwas dünn
SP: kein kein Tyrosin-Agar G: dunkelgelb-grau, kleine gelblich-braun, kleine
Kolonien Falten
A: dunkelgrau, pulverartig: der matt grünlich-weiss, untere Teil; weiss, pulverartig pulverartig
SP:
kein kein Nähragar G: mattgelb, kleine Kolonien mattgelb, kleine
Kolonien
A: weiss, pulverartig weiss, pulverartig
SP: kein kein
Medium FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806
Hefe-Malz-Agar G: dick, braun dick brauen
A: dunkelgrau, pulverartig, mausgrau, pulverartig, reichlich reichlich
SP: kein kein
Hafergrütze-Agar G: grau, kleine Kolonien grau, kleine Kolonien
A: gräulichweiss, pulverartig tief grau, pulverartig, reichlich
SP: gelb mattgelb
Pepton-Hefe-Eisen-Agar G: kein Wachstum mattgelb, matt A: mattgrau, pulverartig
SP: kein
Anorganische G: mattgelb, kleine Kolonien gräulich-gelb, mit
Salze-Stärke-Agar schwarzen, kleinen
Kolonien
A: grau, pulverartig dunkelgrau, pulverartig, reichlich
SP: kein kein
Gelatine-Versuch G: braun, matt in der braun, matt in der (während 20 Tagen Flüssigkeit Flüssigkeit bei Raumtemperatur)
A: kein kein
SP: kein kein
Milch G: mattrosa, ringförmig mattbraun, ringförmig
A:
mattweiss, pulverartig mattweiss, pulverartig
SP: mattrosa kein
G: Substratwachstum A: Luftmyzel SP: lösliches Pigment 3. Physiologische Eigenschaften:
FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806 Fürs Wachstum bestmögliche Temperatur 30 "C 30 "C (schwach bei 37"C)
Fürs Wachstum bestmöglicher pH-Wert 6-8 6-8
Produktion melaninartigen Pigments negativ negativ Tyrosinase-Reaktion negativ negativ
Stärkehydrolyse mittel mittel Verflüssigung von Gelatine ziemlich stark ziemlich stark
Peptonisierung von Milch negativ negativ
Koagulierung von Milch negativ negativ
4.
Verwertung von Kohlenstoffquellen nach dem Pridham-Gottlieb-Verfahren:
Kohlenstoffquellen FERM-P Nr. 1805 FERM-P Nr. 1806
L-Arabinose + +
D-Xylose +
D-Glucose + ++
D-Fruchtose + +
Rhamnose + +
Rohrzucker
Raffinose + +
D-Mannit + ++ i-Inosit + + + + : hervorragende Verwertung geringe Verwertung +: Verwertung -: keine Verwertung
Durch die oben erwähnte Beobachtung mikrobiologischer Eigenschaften erhält man folgende Charakteristika dieser Stämme:
1. Das Luftmyzel ist eng verzweigt und in manchen Teilen gekrümmt. Die Spitzen der Luftmyzel sind häufig spiralförmig geöffnet oder geschlossen. Die Oberfläche des Konidiums ist warzenartig.
2. Die Farbe des genügend gewachsenen Luftmyzelplexus nimmt eine matt- bis dunkelgraue Färbung an. Das Substratwachstum nimmt eine gelbe bis graue Farbe an, hat aber nicht die gleiche Farbe wie das verwendete Medium. Lösliches Pigment wird in einem synthetischen Medium nicht beobachtet, jedoch auf einem Hafergrütze-Agar in gelber und auf Milch in mattrosa Farbe. In anderen Medien werden keine löslichen Pigmente beobachtet. Beide Stämme sind nicht chromogen.
3. Die hydrolytische Wirkung auf Stärke ist mittelmässig, währenddem sie auf Gelatine eher stark ist. Peptonisierung und Koagulierung von Milch werden jedoch nicht beobachtet.
4. Viele Kohlenstoffquellen werden assimiliert, die Assimilation von Rohrzucker ist jedoch negativ.
Durch Nachforschen in den Werken The Actinomycetes Band 2(1961), von Waksman, und The Internationl Streptomyces Project Reports , von E. B. Shirling und D. Gottlieb, nach Stämmen mit den oben beschriebenen Eigenschaften wurden folgende Arten mit Stämmen analoger Eigenschaften wie die der FERM-P Nr.1805 und Nr.1806 gefunden: Streptomyces cacaoi, Streptomyces pseudogriseolus, Streptomyces griseoflavus und Streptomyces echinatus.
In der folgenden Tabelle wird der FERM-P Nr. 1805-Stamm mit diesen ähnlichen Stämmen verglichen. Der FERM-P Nr.
1805-Stamm unterscheidet sich durch folgende Merkmale von den ähnlichen Stämmen:
1. Streptomyces cacaoi unterscheidet sich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm durch glatte Oberfläche des Streptomyces cacaoi Konidiums, bei Beobachtung auf Rohrzuckernitrat Agar und auf Nähragar, bei Hydrolyse von Stärke und Gelatine und bei Assimilation von Kohlenstoffquellen usw.
2. Streptomyces pseudogriseolus unterscheidet sich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm bei der Hydrolyse und bei der Assimilation von Kohlenstoffquellen usw.
3. Streptomyces griseoflavus unterscheidet sich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm durch die dornige Oberfläche des Streptomyces griseoflavus Konidiums und auch etwas bei der Beobachtung auf Rohrzucker-Nitrat-Agar usw.
4. Streptomyces echinatus unterscheidet sich beträchtlich vom FERM-P Nr. 1805-Stamm durch die dornige Oberfläche des Streptomyces echinatus Konidiums, bei der Beobachtung auf Rohrzucker-Nitrat-Agar und Rohrzucker-Asparagin-Agar und bei der Hydrolyse und Assimilation von Kohlenstoffquel lenusw.
Durch obige Beobachtungen kommt man zum Resultat, dass der FERM-P Nr. 1805-Stamm am nächsten mit dem Streptomyces griseoflavus verwandt ist, wobei der Unterschied zwischen beiden nicht sehr gross ist; d. h., die Oberfläche des Konidiums der beiden unterscheidet sich dadurch, dass sie beim Streptomyces griseoflavus kurzdornig ist, währenddem sie beim FERM-P Nr. 1805-Stamm warzenartig ist. Deshalb können die Stämme FERM-P Nr.1805 und FERM-P Nr.1806, welch letztgenannter fast keine Unterschiede zum erstgenannten aufweist, als Variante des Streptomyces griseoflavus mit dem Namen Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus betrachtet werden.
Vergleich von FERM-P Nr. 1805 mit ähnlichen Stämmen
FERM-P Streptomyces Streptomy- Streptomyces Streptomyces
Nr. 1805 cacaoi ces pseudo- griseoflavus echinatus griseolus Morphologische Luftmyzel offene oder lang, offene viele ge- gerade, offene offene Spiralen Eigenschaften geschlossene Spiralen geschlossene Spiralen
Spiralen Spiralen
Konidium oberfläche warzenartig glatt dornig lang-dornig Rohrzucker- Substrat- grau, kleine gelb, mit rötlich braunnitrat-Agar wachstum Kolonien der Zeit orange
Farbwechsel nach rötlich braun
Luftmyzel dunkelgrau grau mit grau-gelblich weissem Rand grau
Lösliches kein kein mattgrün
Pigment gelb Glyzerin- Substrat- farblos- grünlich nitrat-Agar wachstum gräuliche zitronengelb
Lederfarbe gelb-grün
Luftmyzel gräuliche weiss-gelbgrau
Lederfarbe,
pulverartig
Lösliches kein grünlich
Pigment gelb
Substrat- mattgelb zitronengelb gold-grünlich wachstum kleine gelb-grünlich
Kolonien grau Glucose- Luftmyzel mattgrau, grüngrau, grau-rötlich Asparagin- pulverartig pulverartig purpurn Agar lösliches kein kein kein
Pigment Fl ltM-I' Strenlomyces Streptomy- Streptomyces Streptomyces
Nr.
1805 cacafli ccs pscudo- griseoflavus echinatus griseolus Nähragar Substrat- mattgelb, braun farblos kremfarbig mattgelb wachstum kleine
Kolonien
Luftmyzel weiss, pul- elfenbeinern, weiss weiss-grau kein verartig kleinfleckig lösliches kein kein kein oder kein oder kein
Pigment mattbraun grünlich grau Hydrolytische Reaktionsfähig- mittel stark stark schwach schwach keit auf Stärke Hydrolytische Reaktionsfähig- ziemlich stark schwach- positiv negativ keit auf Gelatinierung stark mittel Peptonisierung von Milch negativ schwach positiv stark Koagulierung von Milch negativ schwach negativ stark Verwertung von L-Arabinose f + + + + Kohlenstoff- D-Xylose + + + + quellen D-Fructose + + + + +
Rhamnose + - + +
+ Verwertung von Rohrzucker - + Kohlenstoff- Rafinose + - - + quellen D-Mannit + + + + + i-Inosit + - + + + Produktion von Antibiotikum Bicyclomycin Cacaomycin Xanthomycin- Griseoflavin Echinomycin ähnliche
Substanz + : Verwertung ¯ geringe Verwertung -: keine Verwertung
Das Verfahren zur Herstellung von Bicyclomycin ist dadurch gekennzeichnet, dass man den neuen Stamm des Streptomyces griseoflavus oder eine Mutante desselben in einem wässrigen Nährmedium als Oberflächenkultur oder unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis besagtem Medium eine antibiotische Wirkung durch Entstehen von Bicyclomycin verliehen wird, worauf man dann daraus Bicyclomycin gewinnt.
Das Nährmedium, das in der Regel assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze aufweist, kann ein beliebiges für Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus verwendbares Medium sein.
Die bevorzugten sich im Nährmedium befindlichen Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, z. B. Glucose, Fructose, Mannit und Stärke. Andere verwendbare Quellen sind Arabinose, Inosit, Raffinose, Dextrin und ähnliche.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind sowohl Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojamehl, Maisquellflüssigkeit, getrocknete Hefe und ähnliche als auch anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie z. B.
Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und ähnliche), Urea und ähnliche.
Obwohl die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen vorzugsweise zusammen verwendet werden, braucht man sie dennoch nicht in reiner Form zu benützen, weil weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen Mineralnährstoffe enthalten, auch zur Anwendung gebracht werden können.
Gewünschtenfalls kann das Medium Mineralsalze, z. B. Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Magnesiumsalze, Kupfersalze und ähnliches enthalten. Nötigenfalls kann man, besonders wenn das Kulturmedium beträchtlich schäumt, ein Antischaummittel beigeben, wie z. B. flüssiges Paraffin, ein fettes Öl, ein Pflanzenöl, ein Mineralöl und/oder ein Silicon.
Wie zur Herstellung von anderen Antibiotika in grossen Mengen werden auch zur Herstellung von Bicyclomycin in grossen Mengen submerse aerobe Kultureigenschaften bevorzugt. Zur Herstellung von kleinen Mengen kann man eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder einer Flasche verwenden. Wenn man die Kultur in grossen Behältern züchtet, ist es von Vorteil, die vegetative Form des Organismus zum Okulieren im Herstellungsbehälter zu verwenden, um Wachstumsverzögerungen im Herstellungsverfahren des Bicyclomycins zu vermeiden. Deshalb ist es auch wünschenswert, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Organismus durch Inokulieren einer relativ kleinen Menge des Kulturmediums mit Myzelsporen des Organismus herzustellen, sie zu züchten und den gezüchteten Vegetativimpfstoff aseptisch in grosse Behälter überzuführen.
Das zur Herstellung des vegetativen Impfstoffes benötigte Medium kann im wesentlichen gleich oder verschieden sein vom zur Herstellung des Bicyclomycins benötigten Medium.
Schütteln und Luftzufuhr des Kulturgemisches kann man auf verschiedene Weise bewerkstelligen. Schütteln kann man mit einem Rührer oder einem ähnlichen mechanischen Instrument, durch Rotieren oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pumpinstrumente oder durch Durchblasen von steriler Luft durch das Medium. Luftzuführen kann man dadurch, dass man sterile Luft durch das Fermentationsgemisch durchbläst.
Die Fermentation wird gewöhnlich während 30 bis 100 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 20 bis 40 "C, vor zugsweise bei ungefähr 30 "C, durchgeführt.
Nach diesem Herstellungsverfahren erzeugtes Bicyclomy cin kann man durch eines der üblichen für Antibiotika verwen deten Verfahren aus dem Kulturmedium gewinnen.
Der grösste Teil des Bicyclomycins wird normalerweise im Kulturnährbouillon gefunden, so dass man das Bicyclomycin durch übliche Verfahren, z. B. durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln oder durch Adsorption, von der Flüssigkeit, die man durch Filtrieren oder Zentrifugieren des Nährbouillons erhält, trennen kann.
So kann man ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zum Filtrat zugeben, um die Löslichkeit von Verunreinigungen herabzusetzen, so dass man sie entfernen und die übriggebliebene wässrige Phase verdampfen kann, worauf man das gewünschte Antibiotikum erhält. Beispiele für auf diese Art verwendbare Lösungsmittel sind Pyridin, Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanol, und wässrige Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, z. B.
wässrige Alkohole, wie z. B. wässriges Methanol, Äthanol und
Butanol. Man kann auch Gemische von mit Wasser mischbaren und nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln verwenden; in diesen Fällen wird das gewünschte Antibiotikum durch das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel extrahiert. So kann man Gemische eines Alkohols mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Ketone (z. B. Aceton), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform), Alkylester von Fettsäuren (z. B. Äthylacetat), Benzol oder Pyridin verwenden.
Andererseits kann man das Antibiotikum auch mit einem Adsorptionsmittel, z. B. Kieselgur, aktiviertem Aluminiumoxyd, Silicagel, Aktivkohle oder Kieselsäure, aus dem Filtrat gewinnen. Des weiteren kann man das Antibiotikum mit grossporigen nicht ionischen Adsorptionsharzen aus dem Filtrat entfernen. Bevorzugte Harze sind Polystyrolharze mit einer Oberfläche von 100 bis 1000 m2 pro Gramm, z. B. mit Divinylbenzol vernetzte Styrolpolymere, die unter den Handelsbezeichnungen Amberlit XAD-1, XAD-2, XAD4, XAD-5 (hergestellt von Rohm & Haas Co.) oder unter der Handelsbezeichnung Diaion HP-20, HP-30, HP40, HP-50 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co.) Verwendung finden. Das durch ein Adsorbens oder grossporiges nicht ionisches Adsorptionsharz adsorbierte Antibiotikum wird durch die Verwendung eines geeigneten organischen Lösungsmittels, wie z. B.
Pyridin, Alkohol, wässriger Alkohol oder ein Gemisch aus Alkohol und einem anderen organischen Lösungsmittel, leicht eluiert.
Ein geeignetes Verfahren, um das Antibiotikum aus dem Extrakt oder dem Eluat zu isolieren, besteht darin, dass man das Lösungsmittel bis auf ein relativ kleines Volumen verdampft und das Antibiotikum durch Zugabe eines geeigneten Mittels ausfällt
Durch Umkristallisieren oder Chromatographie kann man das Antibiotikum reinigen. Zum Umkristallisieren verwendbare Lösungsmittel sind z. B. Aceton, wässriges Aceton, Alkohol (z. B. Methanol oder Äthanol), wässriger Alkohol oder Äthylacetat. Die zur Rückgewinnung des Antibiotikums verwendbaren Adsorptionsmittel können auch zur chromatographischen Reinigung wirkungsvoll benützt werden. Als Elutionsmittel kann man diejenigen gebrauchen, die man auch zur Gewinnung der Antibiotika verwendet
Die vorliegenden Beispiele sollen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen.
Beispiel 1
Es wird ein Fermentationsmedium aus folgenden Bestandteilen zubereitet: Stärke 2Gew.-% Baumwollsamenmehl 1 Gew.-% Glutenmehl 1 Gew.-% Sojamehl 1 Gew.-%
Ebios (registrierte Handelsmarke) 1 Gew.-%
KH2PO4 2,1 Gew.-% Na2HPO4- 12H20 1,4 Gew.-%
Leitungswasser zur Genüge
20 Liter dieses Mediums werden in einem 30-Liter-Fermenter auf übliche Weise sterilisiert und dann aseptisch mit einer Vorkultur inokuliert; letztere wurde hergestellt, indem man den Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P Nr.
1805-Stamm in einer Menge wie oben erwähnt, während 2 Tagen in einem Betrag von 3 Vol.-% des Mediums züchtet. Die Hauptkultur wurde während 3 Tagen bei 30 "C herangezüchtet Während der Inkubationszweit wurde der Nährbouillon mit einem Rührer, der in 1 Minute 300 Umdrehungen vollführte, gerührt, während sterile Luft in einer Menge von 20 Litern pro Minute durchgeblasen wurde. Nach vollendeter Fermentation wurde dem Kulturbouillon zuerst 2% Kieselgur zugefügt, und dann die Myzel abfiltriert. Dem so erhaltenen Filtrat (20 Liter) wurde 400 g Aktivkohle zugegeben, das Gemisch während 5 Minuten gerührt und dann die Aktivkohle durch Filtrieren gesammelt Die Elution des aktiven Materials aus der Aktivkohle wurde mit 21/2 Liter 80%igem wässrigem Aceton durchgeführt.
Die Elution wurde zweimal wiederholt. Das Eluat (ungefähr 5 Liter) wurde auf ein Volumen von 200 ml konzentriert und dann lyophilisiert. Zum so erhaltenen lyophilisierten Pulver (ungefähr 60 g) wurde 50 ml Methanol zur Entfernung von unlöslichem Material zugegeben, worauf man die Lösung zu einem Sirup konzentrierte. Der Sirup wurde durch eine Silikagelsäule geleitet, und diese Säule mit Chloroform : Methanol (10 1) entwickelt. Die aktivierten Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu einem weissen Pulver getrocknet.
Das Pulver wurde aus Aceton kristallisiert, worauf man 900 mg Bicyclomycin in Form von weissen Kristallen erhielt. Das IR Spektrum dieser Kristalle ist aus Fig. 1 ersichtlich. Man kann daraus ersehen, dass es identisch ist mit dem bekannten Spektrum von Bicycylomycin.
Beispiel 2
Es wurde 600 mg Bicyclomycin in Form von weissen Kristallen durch ein im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebenes Verfahren erhalten mit der Ausnahme, dass man den Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus FERM-P Nr.1806 Stamm verwendet. Das IR-Spektrum der Kristalle war identisch mit dem bekannten Spektrum von Bicyclomycin.
Beispiel 3
Ein Fermentationsbouillon, erhalten durch auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschriebenes Fermentieren, wurde filtriert. Das Filtrat (20 Liter) wurde durch eine Säule mit nicht ionischem Adsorptionsharz, Amberlit XAD4 ( Amberlit ist eine registrierte Handelsmarke), geleitet. Nachdem die Kolonne mit Wasser gewaschen worden war, wurde das aktive Material mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, worauf man das Eluat konzentriert und dann lyophilisiert hat. Zum so erhaltenen lyophilisierten Pulver wurde zum Entfernen von unlöslichem Material 50 ml Methanol zugegeben, worauf man die Lösung zu einem Sirup konzentrierte.
Der Sirup wurde durch eine Silikagelsäule geleitet, und die Säule darauf mit Chloroform: Methanol (10: 1) entwickelt Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu einem weissen Pulver getrocknet. Das weisse Pulver wurde aus Aceton kristallisiert, worauf man 1,5 g Bicyclomycin in Form von weissen Kristallen erhielt. Das IR-Spektrum dieser Kristalle war identisch mit dem bekannten Spektrum von Bicyclomycin.