DE2166462B2 - 7 beta -(d-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(alpha-methoxy-cinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaeure-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und solche verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft 7jS-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäuren und ihre Salze, die in der 3-SteIlung des Cephem-Kerns in bestimmter Weise substituiert sind. Diese Verbindungen werden durch Fermentation erhalten. Sie sind wirksam gegen gram-negative und gram-positive Bakterien.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Herstellung sind in den Patentansprüchen 1 und 2 definiert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 2 als Gemisch erhalten, das als Antibiotikum 810A oder einfach mit 810A bezeichnet wird.

Von den erfindungsgemäßen Verbindungen sind 7j3-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-psulfooxy-cinnamoyl-oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und ihre Salze, wie das Natriumsalz, bevorzugt.

Taxonomie und Morphologie von
Mikroorganismus NRRL 3851

Der Mikroorganismus NRRL 3851 (Kultur MA-2837), welcher das Antibiotikum 810A produziert, wurde als

45 Streptomyces griseus identifiziert Die zu dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in »Berge/s Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe und in »The Actinomycetes«, Band 2, von S. A. Waksman (1961) beschrieben. Unter Verwendung dieses Verfah-

jo rens wurde festgestellt, daß die Kultur aus einem Stamm von Streptomyces griseus besteht, der hinsichtlich der Beschreibung der Melanin-Erzeugung und des Kohlenstoff-Verbrauchs dem Streptomyces griseinus sehr stark gleicht, wie in »International Journal of Systemic

Bacteriology« 7. Ausgabe (1957) beschrieben, da die Gruppe von Streptomyces griseus-Kulturen 1959, zwei Jahre nach Veröffentlichung der Ausgabe, geteilt wurde. Jedoch sowohl von Waksman als auch in »International Journal of Systemic Bacteriology« wird Streptomyces griseinus als »grisein-erzeugender Stamm von Streptomyces griseus« oder als »grisein-erzeugende oder grisein-ähnliche Substanz« definiert. Streptomyces griseus MA-2837 ist ein Stamm, der sich von der klassischen Beschreibung von Bergey und von Waksman insofern unterscheidet, als er ein Luftmycel besitzt, das vorwiegend braungelb und auf einigen Medien grüngelb mit einem etwas abweichenden Kohlenstoffverbrauchsmuster ist. Waksman beschreibt auf Seite 111

60

und 133 von »The Actinomycetes« diese Streptomyces ffliseus-Reihe als eine Reihe, welche viele verwandte Species und Stämme umfaßt, was sich durch farbloses bis oliv-sanafarbenes Substratwachstum, Luftmycel, das gefljüch mit einer grünlichen Färbung oder grünlichgrau oder gelb-verbrannt oder gras-grün bis grau ist, Melanin negativ ist, gerade oder biegsame und in Büscheln erzeugte Sphorophore und ovale Sporen kennzeichnet Die folgenden Tabellen vergleichen die Eigenschaften der das Antibiotikum 810A erzeugenden Kultur mit den Streptomyces griseus und Streptomyces griseinus-Kulturen.

Die Charakterisierung des Ausgangsisolats MA-2837 im Vergleich mit von Bergey¹ und Waksman² beschriebenem Streptomyces griseus und auch die Charakterisierung von MA-2837 im Vergleich mit dera "on Waksman² beschriebenen Streptomyces griseinus sind in den Tabellen I und la aufgeführt

Tabelle I Vergleich der Kultureigenschaften von MA-2837 Kultur

MA-2837

Streptomyces griseus (Bergey)t) Streptomyces griseus (Waksman)^)

Streptomyces griseinus (Waksman)*}

Sporophoren sind monopodial verzweigt unter Bildung, von Büscheln, mit geraden bis etwas gebogenen Sporenketten. Sporen: kugelförmig bis oval, Durchmesser 0,9 μ bis 03 x 1,2 μ in Ketten von etwa 10—15 Sporen. Vegetative Hyphen von 03 μ Breite (Glycerin-Asparaginagar-970X)

1) Berge/s »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe (1957).

2) Waksman, S. A, »The Actinomycetes«, Band 2 (1961).

Luftmycel: Reichlich, pulverförmig, wassergrün. Sporophore erzeugt in Büscheln. Sporen kugelförmig bis ellipsoid, 0,8 χ 0,8 bis 1,7 μ. Vegetatives Wachstum: Kolonien glatt oder gefältelt, farblos, später nach oliv bis sandfarben übergehend Gerade in Büscheln erzeugte Sporophore. Sporen kugelförmig bis oval, 0,8 χ 0,8 bis 1,7 u. Oberfläche glatt

Gerade Sporophore erzeugt in Klumpen oder Büscheln ohne Spiralen. Sporen stabförmig, 1,0 bis 1,8 χ 0,8 bis 1,0 μ

Tabelle la Vergleich der Kultureigenschaften von MA-2837 Kultur

Medium

MA-2837

S. griseus (Bergey)

S. griseus (Waksman)

S. griseinus (Waksman)

Tomatenpaste — Hafermehl-Agar

Glycerin-Aspara-

ginagar

Czapek-Doxagar (Sacharosenitratagar)

Vegetatives Wachstum: Rückseite braun, eben, sich

verbreitend,

Luftmycel; Mitte gelbbraun

bis graugelb

Kante bräunlich-gelb Lösliches Pigment: gelbbraun

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun, eben, sich verbreitend, Luftmycel: pulverförmig, gelbbraun bis gelb Lösliches Pigment: hell, gelbbraun-gelblich

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelblichorange, eben, sich verbreitend, Luftmycel: pulverförmig gelbbraun bis gelb (verschiedene Schattierungen, jedoch vorwiegend Rand gelbbraun-gelblich) leichtes Wachstum im Mittelpunkt und stärkeres an den Rändern, Lösliches Pigment: heil, gelbbraun-gelblich Wachstum spärlich, sich verbreitend, farblos, wird olivbis sandfarben, Luftmycel dick, pulverförmig. Wasser grün, Pigment unlöslich

Substratwachstum faltig, Rückseite creme-farben bis bräunlich, Luftmycel: weiß bis creme-farben mit hellgrünlichem Stich, kein lösliches Pigment

Fortsetzung

Medium

MA-2837

S.griseus
(Bergey)

S. griseus (W a k 5 m a n)

S. griseinus (Waksman)

Eialbummagar

Nähragar

Agar

Synthetischer Agar

Gelatine-Ansatz

Nährgelatineagar

Lackmusmilch

Entrahmte Milch

Vegetatives Wachstum: ·'. Rückstite gräulich gelb-. braun, eben,sich ausbreitend Luftmycel: Gelbbraun bis gelblich mit grünlicher Schattierung. Rand gelbbraun gelblich, geringes Wachstum im Mittelpunkt, stärkeres Wachstum längs der Ränder Lösliches Pigment hell gelbbraun gelblich

Vegetatives Wachstum:

Rückseite baiunfichgelb

Luftmycel: samtig, geib-

braungelb, Rand gelbbraun

gelb

Lösliches Pigment: hell

braun

Flockiges creme-farbenes Wachstum setzt sich am Badendes Rohrs ab. Vollkommene Verflüssigung

Vegetatives Wachstum:

creme-farben

Luftmycel: blaß, gelbbraun

gelb

Lösliches Pigment: keines

Verflüssigung der Gelatine:

gut

Teilweiser Ring,

Vegetatives Wachstum:

bräunlich

Luftmycel: gering, weißlich

Peptonisierung wird alkalisch

Teilweiser Ring
Vegetatives Wachstum: bräunlich
Luftmycel: keines Lösliches Pigment: hellbraun Peptonisierung wird alkalisch Wachstum reichlich, fast transparent, creme-farben. Luftmycel pulverförmig, weiß bis hellgrau, kein lösliches Pigment

reichliches, cremefarbenes fast transparentes Wachstum, Luftmycel pulverförmig, weiß bis hellgrau, kein lösliches Pigment

Spärliches sich ausbreitendes farbloses Wachstum, das oliv bis sandfarben wird Luftmycel: dick, pulverförmig, wassergrün

Grünlich gelbes oder Wachstum cremecreme-farbenes farben mit bräun-Oberflächenlichem Stich

wachstum mit bräun- Luftmycel: fehlt lichem Stich. Rasche oderspärlich, weiß. Verflüssigung Rasche Ver

flüssigung

Creme-farbener Ring, Koagulierung mit rascher Peptonisierung, wird alkalisch

Wachstum cremefarben.

Coagulierung und Peptonisierung

Fortsetzung

Medium

MA-2837

S. griseus
(B e r g e y)

S. griseus
(W a k s m a n)

S. griseinus (W a k s m a n)

Magermilchagar

Glucose-agar

Glucosefliissigkeit
Stärke-Agar

Nährstärkeagar
Kartoffelschnitt

Calciummalatagar

Vegetatives Wachstum: creme-farben, eben, sich

ausbreitend . ■

Luftmycel: spärlich, gelblichweiß bis cremefarben Lösliches Pigment: sehr hellbraun
Hydrolyse von Casein ■

Im Mittelpunkt verstärktes Wachstum strahlenförmig, creme-farben bis orange, Rand gezackt

Reichliche, gelbliche
Haut mit grünlichem
Stich, stark gefältelt

Dünnes, sich aus- Dünnes Wachstum, breitendes trans- sich ausbreitend, parentes Wachstum, transparent, Stärke ist starke Hydrolyse

hydrolysiert

Vegetatives Wachstum:

creme-farben

Luftmycel: blaß gelbbraun gelb

Lösliches Pigment: keines

Hydrolyse gut

Vegetatives Wachstum: Gelbliches, gefal- Runzliges, falti-

hellbraun tetes Wachstum, ges Wachstum,

Luftmycel: mäßig, braungelb bedeckt mit weißem, gelblich bis bräunleichtes Bräunlichwerden der pulverförmigem lieh, bedeckt mit Kartoffel Luftmycel weißem, pulver-

Farbloses bis creme-farbenes Wachstum, Luftmycel: grauolive

Faltiges gelblich weißes Wachstum Luftmycel gräulichweiß mit olive-

Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend durchscheinend und farblos an den Rändern opak und creme-farben im Mittelpunkt. Luftmycel: mäßig, cremefarben bis gelb, Ränder gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: keines förmigem Luftmycel farbenem Stich

Grünes oder gelbes Keine löslichen iösliches Pigment, Pigmente auf das auf dem Calcium-Calciummalat oder malat und Succinat- Succinatmedium medium erzeugt wird

Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, cremefarben

Laftmycei: gelblich braungelb mit grünlicher Schattierung,

Lösliches Pigment: sehr hellbraun

rii zersetzen

Vegetatives Wachstem: cretne-Carben

Lösliches Pigmenu keines Melanin negativ

Häufig erzeugtes dunkles Pigment

Kein erzeugtes Pigment

609583/469

Fortsetzung

JlO

Medium

MA-2837

S. griseus (B e r g e y)

S. griseus

(W a k s m a n)

S. griseinus (Waksman)

Erzeugung von H2S

Loeffler's
Blutserum-Schrägkulturen

Temperaturbereich
(Hefeextrakt-Dextrose-Salzagarschrägkulturen)

Mikroärophiles
Wachstum (Hefeextrakt-Dextrose-
Salze-Ansatz 40 mm
Tiefe)

Reduktion von
Nitraten zu Nitriten

Negativ

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: hellgelblich Lösliches Pigment: bräunlich Vollkommene Verflüssigung

28° C gutes Wachstum 37⁰C gutes Wachstum 50⁰C kein Wachstum

Die Oberfläche bedeckendes und längs der gesamten Ansatzlinie verlaufendes gutes Wachstum

Negativ

Negativ

Negativ

Optimaltemperatur 370⁰C

Aerob

Positiv Positiv

Positiv

Diese Beobachtungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28° C, falls nicht anders vermerkt ist. Der pH-Wert des bei diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche wurden nach Ablauf von 7 und 22 Tagen durchgeführt. Die zur Beschreibung verwendeten Farben entsprechen den Definitionen von »Color Harmony Manual«, 4. Ausgabe, 1958, Container Corporation of America.

Die Streptomyces griseus-Kultur MA-2837 wurde auch auf ihre Fähigkeit zur Assimilierung verschiedener Kohlehydrate in einem synthetischen Ausgangsmedium (T. G. Pridham and D. Gottlieb, 1948), das 1% des Kohlehydrats enthielt, bei 28° C während 3 Wochen getestet Die folgende Tabelle II gibt den Verbrauch oder die Assimilation dieser Kohlehydratquellen durch " die Streptomyces griseus-Kultur MA-2837 wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle II sind wie folgt: + bedeutet gutes Wachstum, ± bedeutet schlechtes Wachstum und - bedeutet kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat

Tabelle II

Streptomyces griseus: MA-4160 MA-4174 MA-4171

Streptomyces viridochromogenes: MA-4177 MA-4178 ΜΛ-4180 MA-4164 MA-4165 MA-4166 MA-4167 MA-2892 MA-3265 MA-4162 NA-4163

Streptomyces fimbriatus: MA-4159 MA-4169 MA-4170 MA-4179 MA-4161

Kohlehydrat

MA-2837 Kultur

Kohlehydrat

MA-2837 Kultur

Glucose

Arabmose

Xylose

4·
+

Maimose
Fructose
Mannit

Lactose

Inosit

Saccharose

Rhammose

Raifrnose

Ceflalose

Streptomyces halstedii: MA-4168 MA-4175 MA-4181

Streptomyces rochei: MA-2938

Streptomyces cjnnamonensis: MA-4176

Sireptomvces chartrensis: MA-4173

NRRL 3951 NRRL 3953 NRRL 3952

NRRL 3970 NRRL 3971 NRRL 3972 NRRL 3966 NRRL 3967 NRRL 3968 NRRL 3969 NRRL 3962 NRRL 3963 NRRL 3964 NRRL 3965

NRRL 3954 NRRL 3956 NRRL 3957 NRRL 3958 NRRL 3955

NRRL 3959 NRRL 3960 NRRL 3961

NRRL 3973 NRRL 3974 NRRL 397S

AöBer der vorstehendes Kultur MA-2837 wurden ?s weitere Kidioren als Erzeuger des Antfciotikums llOA 6s identi&aeit,dieimPaieHiaaspnich2genanM^ ^S

Die zugeteBöai NaSL-Kidmr-Bezeichmmffen wie folgt «eionmiagen

Die Charakterisierung der vorstehend '* ™ :**&&& «afc Streptonjyces grise

» . ___ rochei, SMeggfc.-t%iji

■-£" «miamonensis «and Sirepterayces d«»Ä^;| and in den folgenden Tabellen Ha bis lie wiedö^Ä^

(f2l 66 462

11 ' 12

Tabelle Ila

Kultureigenschaften der das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämme von Streptomyces griseus

Medium

MA-4160

MA-4174

MA-4171

Morphologie

Tomatenpäste-Hafermehlagar

Glycerinasparaginagar

Czapek-Dox Agar

Haferextrakt — Dextrose + Salzagar

Lösliches Pigment auf Pepton-Eisen-Hefe-Extraktagar

Sporophore bilden Büsche mit geraden bis leicht gewundenen Sporenketten. Sporen sind kugelförmig bis oval — 0,9 μ Durchmesser bis 0,9 μ χ 1;2 μ; in Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen

Vegetatives Wachstum: gut, eben, sich ausbreitend '.

gelbbraun

Luftmycel: pulverförmig, Luftmycel: pulverförmig, Luftmycel: pulvergelbbraun mit grünlicher gelbbraun mit stark grüner förmig, gelbbraun mit Schattierung Ubertönung stark grüner Über

tönung Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: gut, eben, gelbbraun

Luftmycel: pulverförmig, gelbbraun mit grünlicher Schattierung und graugrünen Vektoren

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, transparent Luftmycel: mäßig, gelbbraun Luftmycel: mäßig, gelbbraun Luftmycel: mäßig

gräulich Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment ·

Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, gelbbraun Luftmycel: gut, pulverförmig, beige

Lösliches Pigment: hellbraun

kein kein kein

Tabelle Hb

Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces viridochromogenes

Medium

MA-2892

MA-3265

MA-4162

MA-4163

Morphologie

Tomatenpaste-Hafermenlagar

Glycerinasparaginagar

Czapek-Dox

Hefeextrakt-

Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Sporen sind kugelförmig bis oval — 03 bis 1,2 μ Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ 1,2 bis IJu, Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen.

Vegetatives Wachstum: Vegetatiges Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum Rückseite braun Rückseite gelbbraun Rückseite dunkelbraun Rückseite braun

Luftmycel: samtig, Luftmycel: samtig, Luftmycel: samtig, Luftmycel: samtig, dunkelgrau und weiß hellgrau und weiß bläulichgrau und weiß mittelgrau und weiß Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: hellbraun keines hellbraun hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum Rückseite dunkelbraun Rückseite dunkelbraun Rückseite dunkelbraun Rückseite braun

Luftmycel: Luftmycel:

dunkelgrau und hellgrau

cremefarben

Lösliches Pigment:

hellbraun

Vegetatives Wachstum

dunkelbraun

Luftmyceh

sehr spärlich

Lösliches Pigment:

dunkelbraun

Vegetatives Wachstum:

Lösliches Pigment:
keines

Luftmycel:
creme-farben und
hellgrau

Lösliches Pigment:
hellbraun

Luftmycel: creme-farben und grau

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum

dunkelbraun Luftmycel: hellgrau und weiß Lösliches Pigment: hellbraun

dunkelbraun
Luftmycel:
sehr spärlich
Lösliches Pigment:
hellbraun

gelbbraun Luftmycel: sehr spärlich Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachsten Rückseite braun dunkelbraun dunkelbraun

Lösücbes Pigment:

Luftmycel: hellgrau

Lösliches Pigment: keines

Luftmycel:
sehr sparsam
Lösliches Pigment:
hellbraun

Luftmycel: sehr spärlich

hellbraun

,¥

Fortsetzung

14

Medium

MA-2892

MA-3265 MA-4162

MA-4163

Lösliches
Pigment auf
Pepton-Eisen-Hefeextraktagar

Morphologie

Tomatenpaste-Haferfhehlagar

Glycerin-Asparaginagar

Czapek-Dox
Agar

dunkelbraun

Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Sporen sind kugelförmig bis oval — 0,9 bis 1,2 μ Durchmesser und 0,9—1,2 χ 1,2-1,7 μ, Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen

Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:

samtig, mittelgrau samtig, mittelgrau samtig, dunkelgrau

und creme-farben creme-farben und creme-farben

Lösliches Pigment: hellbraun

Luftmycel: samtig, bläulichgrau und creme-farben

Vegetatives Wachstum Rückseite dunkelbraun Luftmycel: dunkelgrau und creme-farben

Vegetatives Wachstum;

braun

Luftmycel:

sehr spärlich

Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:
Rückseite dunkelbraun dunkelgrau
Luftmycel: Luftmycel:

mittelgrau und spärlich gräulich

creme-farben Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:

Rückseite braun
Luftmycel:
hellgrau und
creme-farben
Lösliches Pigment:
hellbraun

braun
Luftmycel:
sehr spärlich

Lösliches Pigment:
braun

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun Luftmycel: hellgrau und creme-farben

Vegetatives Wachstum: gelbbraun Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

Tabelle Hb (Fortsetzung)

Medium

MA-4164 MA-4165

MA-4166

MA-4167

Hefeextrakt-Dextroseagar

Lösliches Pigment auf

Pepton-

Eisen-Hefeextraktagar

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun

Luftmycel: sehr sparsam
Lösliches Pigment: hellbraun

dunkelbraun

Tabelle Hb (Fortsetzung)

Medium

MA-4177 MA-4178

MA-4180

Morphologie

Tomatenpaste-Hafermehlagar

Sporophöre sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval — 0,9 bis 1,2 μ Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ 1,2 bis 1,7 μ in Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen

Vegetatives Wachstum:

Rückseite gelbbraun

Luftmycel:

samtig, dunkelgrau und weiß Vegetatives Wachstum:
Rückseite braun
Luftmycel:
samtig, dunkelgrau

Vegetatives Wachstum: Rückseite braun Luftmycel: dnnkelgrau Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum:
Rückseite dunkelbraun
Luftmycel:
dunkelgrau

Lösliches Pigment: beBbraim

Vegetatives Wachstum:

Rückseite braun

Luftmycel:

samtig, dunkelgrau und

creme-farben

Vegetatives Wachstum:

Lnfönycel; Gemisch aas hell und

15

16

Fortsetzung

Medium	MA-4177	MA-4178	MA-4169 MA-4170 MA-4179	MA-4180
Czapek-Dox Agar	Vegetatives Wachstum:	Vegetatives Wachstum:	Vegetatives Wachstum:
	gelbbraun	dunkelbraun	gelbbraun
		Luftmyceb sehr spärlich
		Lösliches Pigment: hellbraun
Hefeextrakt-Dextroseagar	Vegetatives Wachstum:	Vegetatives Wachstum:	Vegetatives Wachstum:
	dunkelbraun	braun	braun
	Luftmycel;	Luftmycel:	Luftmycel:
	spärlich-gräulich	sehr spärlich	sehr spärlich
		Lösliches Pigment: hellbraun
Lösliches Pigment auf		dunkelbraun
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-
agar
Tabelle Hc
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces	fimbriatns
Medium MA-4159	MA-4161

Morphologie

Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen und einige Schleifen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugelfcrmig bis oval — 0,9 μ Durchmesser <nd 0,9 χ 1,2 μ mit Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen

Tomatenpaste-Hafermehlagar

Glycerin'
Aspäraginagar

Czapek-Dox
Agar

Hefeextrakt
Dextrose+ SaIz-Agar

Lösliches
Pigment auf
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-
Agar

Vegetatives
Wachstum:
Rückseite gelbbraun
Luftmycel:
mäßig, hellgrau

Vegetatives
Wachstum:
dunkelbräunlich
bis grau

Vegetatives
Wachstum:
dunkelbräunlich
bis grau
Luftmycel: sehr
spärlich
Lösliches
Pigment: braun

Vegetatives
Wachstum:
dunkelbräunlich
bis grau

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun
Luftmycel: mäßig, hellgrau Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun
Luftmycel: mäßig, hellgrau und cremefarben

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun Luftmycel· spärlichgräulich

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau Luftmycel: mäßig, grau Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau
Luftmycel: mäßig, grau Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau

Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis grau Luftmycel: sehr spärlich Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Vegetatives

Wachstum: Wachstum:

dunkelbräunlich dunkelbräunlich bis grau bis grau

Luftmycel: sehr spärlich Lösliches Pigment: braun

dunkelbraun

Sporophore sind kurze Haken und Schleifen, die als Seitenzweige auf Luftmycel auftreten. Sporen in Ketten von weniger als Sporen sind kugelförmig bis oval, 0,9 μ Durchmesser und 0,9 χ \2 μ

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: spärlich, gräulich

Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun mit rötlich gelbbraunen Vektoren

Vegetatives Wachstum: gelbbraun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: braun

609583/469

Ao

Tabelle Hd

Kiiltureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces halstedü

Medium MA-4168 MA-4175 MA-4181

Morphologie

Tomatenpaste-Hafermehlagar

Glycerin-Asparagin-Agar

Czapek-Dox Agar

Sporophore sind lange, lose Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporensindkugelförmig bisoval — 0,9 μ Durchmesser und 0,9 χ 1,2 μ — in Ketten von mehr als 1!0 Sporen ν

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:

Rückseite gelbbraun Rückseite braun

Luftmycel: dunkelgrau und weiß, Luftmyceh dunkelgrau ■ pulverförmig und weiß

Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachstum: Rückseite braun Luftmycel: pulverförmig, dunkelgrau Vegetatives Wachstom: Rückseite gräulich Luftmycel: dunkelgrau, pulverförmig

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:

Rückseite braun bis dunkelbraun Rückseite gräulich Luftmycel: pulverförmig, Luftmycel: pulverförmig,

dunkelgrau und weiß vorwiegend dunkelgrau ge

mischt mit hellgrau und weiß
Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:

creme-farben Rückseite rötlichbraun creme-farben

Luftmycel: gräulich creme-farben Luftmycel: gräulich creme-farbenLuftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: keines

Hefeextrakt
Dextrose + Salz-Agar

Lösliches Pigment auf

Pepton-Eisen-Hefe-

extrakt-Agar

Vegetatives Wachstum:

gelbbraun

Luftmycel: gräulich, spärlich Vegetatives Wachstum:

gelbbraun

Luftmycel: spärlich, gräulich

Lösliches Pigment: keines
keines

Vegetatives Wachstum:

braun

Luftmycel: spärlich,

gräulich

Tabelle He

Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Streptomyces Species

Medium

MA-2938 MA-4176

MA-4173

Morphologie

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Glycerin-Asparagin-Agar

Czapek-Dox Agar

Streptomyces rochei Streptomyces cinnamonensis

Sporophore bilden kompakte Sporophore sind Haken, Spiralen, die als Seitenketten Schleifen und einige lose von etwa 10—15 Sporen Spiralen, die als Seitenzweige — kugelförmig bis oval, 0,9 μ auf Lufthyphen auftreten. Die Durchmesser und 0,9 χ 1,2 μ Sporen sind in Ketten von auftreten mehr als 10 Sporen, kugel

förmig bis oval, 0,9 μ Durchmesser und 0,9 χ 1,2 μ

Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis braun

Luftmycel: mittelgrau

Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachtum: Rückseite rötlich bis braun

Luftmycel: mittelgrau

Lösliches Pigment: keines

Vegetatives Wachstum: rötlichbraun Luftmycel: sehr sparsam

Lösliches Pigment: keines Vegetatives Wachstum:
gelbbraun

Luftmycel: beige mit rosa
Färbung, samtig
Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Wachstum:

Rückseite dunkelrötlich bis

braun Luftmycel: beige mit rosa

Färbung Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Wachstum:
Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: mäßig, beige mit
rosa Färbung
Lösliches Pigment: braun

Streptomyces chartreusis Sporophore sind kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind in Ketten von mehr als 10 Sporen, kugelförmig bis oval, 0,9 bis 1,2 μ Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ 1,2 bis 1,7 μ

Vegetatives Wachstum: hellbraun mit orange bis braunen Vektoren

Luftmycel: pulverförmig, dunkelgrau mit blau-grüner Färbung Lösliches Pigment: braun

Vegetatives Wachstum: braun

Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

Vegetatives Wachstum: orange- bis braun
Luftmycel: sehr spärlich

Lösliches Pigment: hellbraun

Fortsetzung

Medium

Hefeextrakt

Dextrose Agar

SIaIz-

MA-2938

Vegetatives Wachstum: lbb

MA-4176

A/in

MA-4173

gelbbraun Luftmycebgräulich

Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:

braun * braun "'

Luftmycel: spärlich, creme- Luftmycel: sehr spärlich farben bis weiß Lösliches Pigment: hellbraun Lösliches Pigment: hellbraun Lösliches Pigment: braun

Lösliches Pigment keines dunkelbraun dunkelbraun

juif Pepton-Bsen-

Hefeextrakt-Agar

Das Antibiotikum 810A wird erfindungsgemäß durch aerobe Züchtung der im Patentanspruch 2 genannten Mikroorganismen in wäßrigen Nährmedien erzeugt Derartige Medien enthalten durch den Mikroorganismus assüoflierbare übliche Kohlenstoff- und Stickstoff- quellen and anorganische Salze. Die Menge der verwendeten Kohlehydratquelle variiert im allgemeinen zwischen 1 und 6 Gew.-% des Mediums. Die Stickstoffquellen werden in Mengen von 0,2 bis 6 Gew.-% des wäßrigen Mediums verwendet

Die Fermentation erfolgt bei etwa 20 bis 37° C. vorzugsweise bei 22 bis 30" C Der pH-Wert der für das Wachstum des Mikroorganismus NRRL 3851 geeigneten Nährmedien soll zwischen etwa 5,5 und 8,0 liegen.

Das Antibiotikum 81OA kann durch Adsorption an ein Ionenaustauschharz, beispielsweise an synthetische Änionaustauschharze, die sich von Dextrose oder Acryl-Copolymeren ableiten, oder nicht-ionische, vernetzte Polymere gereinigt werden. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem Harz oder Polymeradsorbat mit Wasser oder mit einer wäßrigen, alkoholischen Lösung eines geeigneten Salzes, beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid eluiert Gegebenenfalls kann das so erhaltene Eluat durch eine zweite und dritte Adsorptions- und Eluierungsstufe gereinigt werden.

Das Antibiotikum 810A kann in seine beiden Komponenten, 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-

3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und 70-(D-5-Amino-S-carboxyvaleramido^S^a-niethoxy-p-hydroxycin- namoyloxymethyl^-methoxy-S-cephem-i-carbonsäure, durch Chromatographie getrennt werden. Dazu gehören:

(1) Chromatographie auf einem stark-hydrophilen so Anionenaustauschharz, beispielsweise einem synthetischen Anionenaustauschharz, das sich von Dextran in seiner Chloridform ableitet, d. h. mit Chlorid-Gegenionen; im folgenden »Harz 1«. Es wird hierbei mit einem Ammoniumbromid-Ameisensäure-System entwickelt Es können verschiedene Konzentrationen dieses Systems verwendet werden, jedoch wird in der Praxis eine Lösung aus 03 m Ammoniumbromid und 0,1 m Ameisensäure bevorzugt

(2) Chromatographie auf einem schwach-basischen Anionenaustauschharz, beispielsweise einem vernetzten Acrylcopolymerisat, das eine schwach-basische tertiäre Aminogruppe enthält; im folgenden »Harz 2«. Dies ist eine Gruppenabtrennung, wobei Material in roher Form bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 3,5 aufgegeben wird und zunächst mit einer Säure bei einem pH-Wert von etwa 2 und dann mit NaCl/HCl bei einem pH-Wert von etwa 1 eluiert wird.

(3) Chromatographie aiii einem nicht-ionischen, vernetzten Polystyrol-Polymerisat, beispielsweise einem nichtionischen, vernetzten Polystyrol-Polymersorbent,- im folgenden »Harz 3«. Die Eluierung erfolgt mit einem geeigneten, wäßrigen System, jedoch ist es im allgemeinen am günstigsten, eir? Gemisch aus Wasser und einem niederen Alkylketon zu verwenden. Typische verwendbare Eluiermittel sind beispielsweise 10% Methanol in Wasser und anschließend 50% Methanol <n Wasser. Anstelle der 50%igen Methanol-in-Wasser-Lösung kann 20% Aceton-in-Wasser verwendet werden.

Die nach den obigen Methoden erhaltenen Produkte können durch Rechromatographie gereinigt werden. So kann beispielsweise 70-{D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-{<x-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure gereinigt werden, indem dieses Produkt der in der obigen Methode 1 beschriebenen Reinigungsmethode unterzogen wird, mit nachfolgender Entsalzung auf Harz 2; 7/?-(D-5-Amino-S-carboxyvaleramidoJ-S-ia-rnethoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure kann durch Rechromatographie auf Harz 1, das mit 0,5 m Ammoniumbromid und 0,05 m Essigsäure entwikkelt wird, erneut gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen Säuren bilden eine große Vielzahl pharmakologisch verträglicher Salze mit anorganischen und organischen Basen; dazu gehören beispielsweise Metallsalze, z. B. Salze von Alkali- und Erdalkalihydroxiden, Carbonaten und Bicarbonaten, und Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, wie von Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niedrigmolekularen Alkanolamine^ Diniedrigmolekular.-alkanolaminen, niedrigmolekularen Alkylendiaminen, Ν,Ν-Diaralkyl-niedrigmolekular.-alkylendiaminen. Aralkylamine)!, aminosubstituierten niedrigmolekularen Alkanolen, Ν,Ν-di-niedrigmolekular.-alkylaminosubstituierten niedrigmolekularen Alkanolen, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierten niedrigmolekularen Alkansäuren und stickstoffhaltigen heterocyclischen Aminen. Zu typischen Beispielen dieser Salze gehören Salze, die sich von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid oder Calciumcarbonat ableiten und Salze, die sich von Aminen, wie

Trimethylamin,Triäthylamin, Piperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin.N.N'-Dibenzyläthylendiamin,

66

Diethanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanoI, Theophyllin und N-Methylglucamin

ableiten.

Die vorstehend erwähnten Sa'ze können Monosaize oder gemischte Disalze sein.

Die erfindungsgemäßen Salze sind auch Zwischenprodukte zur Herstellung der erfindungsgemäßen Garbonsäuren. Die Salze können auch zur Herstellung

anderer pharmazeutisch verträglicher Salze verwendet

werden.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum 81GA seine Bestandteile können in üblicher Weise zu pharmazeutischen Präparaten verarbeitet werden, z. B. zu Kapseln, Tabletten, Pulvern, Lösungen, Suspensionen oder Hixierea Sie können oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werdea Zu geeigneten Trägern gehören beispielsweise Mannit, Saccharose, Glucose oder sterile Flüssigkeiten, wie Wasser, Salzlösung, Glykole und öle.

In-vitro- und In-vivo-Prüfung von Antibiotikum 810A

Die biologische In-vitro-Prüfung des Antibiotikums 810A erfolgte durch die Petri-Schalen-Agar-Diffusionsmethode. Diese Versuche wurden so durchgeführt, daß mit der Antibiotikumlösung angefeuchtete 7-mm-Scheiben auf die Oberfläche von Petrl-Schalen gebracht wurden, die mit 5 ml Nähragar und 0,2%igem Hefeextrakt begossen wurden, der mit 5 oder 10 ml Impfstoff je 150 ml Medium beimpft war, und bei 25° C oder 37°C 16 Stunden inkubiert wurde. Die Methode

Tabelle III

810A antibakterielles Spektrum, in-vitro-Wirksamkeit

und Abhandlung über diese Versuche sind in der Veröffentlichung: »Cross Resistance Studies and Antibiotic Identification«, Applied Microbiology, Band 6, Seiten 392 bis 398 (1958) beschrieben. Die folgenden Tabellen III, IV und V geben die Ergebnisse dieser Versuche hinsichtlich der antibakteriellen und Kreuzungsresistenz wieder und führen die verwendeten Versuchsorganismen und die angewendeten Bedingungen auf.

Testorganismus	Testbedingungen	Inkubierung	Inhibierungszone, Durchmesser
		Temp. *C	mm*)
	Impfstoff*)	25	810A
	ml/150 ml	25	5 mg/ml
Escherichia coli	5	37	15
Bacillus species	(Jl	25	22
Proteus vulgaris	5	25	29
Pseudomonas aeruginosa	5	25	7
Serratia marcescens	5	25	7
Staphylococcus aureus	5	25	26
Bacillus subtilis	5	37	33
Sarcina lutea	5		26
Staphylococcus aureus	5	37	19
(Streptomycin-Streptothricinresistent)		37
Streptococcus faecalis	15	37	7
Alcaligenes faecalis	5	25	25
Bruceila bronchiseptica	10	27	21
Salmonella gallinarum	10	25	15
Vibrio percolans	10	36
Xanthomonas vesicatoria	5	15

*) 7^mm = Scheibengröße (keine Inhibierungszone beobachtet). '*) Übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 ΐημ auf dem Golorimeter.

Tabelle IV

810A Kreuzungsbeständigkeit, in-vitro-Untersuchung

Escherichia coü-Stamm**)

Untersuchungsbedingungen

Impfstoff·**) ml/150ml

	Inhibierungszone
	Durchmesser
	mm*)
Inkubierung	810A
Temp. "C	5 mg/ml
25	15
25	13
25	17

Sensitiver Ausgangsstamm

Streptomycin-resistent

Streptothricin-resistent

10

*\ 7 mm = Scheibengröße (keine Inhibierungszone beobachtet). **) Versuche gegenüber einer Reihe von Stämmen von E. coil, isoliert aus der gleichen Ausgangskultur, durchgeführt und

anschließend gegeiiüber den einzelnen Antibiotika ausgesetzt. **) Übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 mu auf dem Lumetron-Colorimeter.

Fortsetzung

Escherichia coli-Stamm*·);

Untersuchungsbedingungen,	lnkubierung	Inhibierungszone
	Temp. "C — ■	Durchmesser
	25 .	mm,*)
Impfstoff"*)	37	. 810A
ml/150ml —	25	5 mg/ml ■
10	25	τ . ■ . . - . - ■ - 10
10	25	26
10	37	7
10	25	7
10	37	• 7
10	25	2O1
10	25	7
10	17
10	13
5	15

OXAMYCIN-resistent

Pieoxidin-resistent

Cjhlorainphenicol-resistent

Ghlortetracyclin-resistent

QxytetrÄcyclih-resistent

Nepmycjri-resistent

TetracycUn-resistent

Yiomycin-resistent

Polymyxin-resistent

Grisein-resistent

*) 7 mm = Scheibengröße (keine Inhibierungszone beobachtet). *·) Versuche gegenüber einer Reihe von Stämmen von E. coli, isoliert _L.:_n__j --l_„ j._{n e}i_nzei_nen Antibiotika ausgesetzt

auf einen Wert von 60 mu. auf dem Lumetron-Colorimeter.

aus der gleichen Ausgangskultur, durchgeführt und

Χ angegeben) Testbedingungen

Impfstoff) ml/150 ml lnkubierung
Temp. °C

Inhibierungszone

Durchmesser

mm*)

810A

5 mg/ml

²⁵

Vergleich (keine Zusätze) ₅ 25

0,lmol. Phosphat-Puffer - pH 5 ₅ 25

0,lmoL Phosphat-Puer - pH 7 ₅ 2j

0,lmol. Phosphat-Puffer -pH 9 ₅ 25

Menschliches ^"^^(Agar-Konzentration auf 5 ²⁵

JJ ÖÄÄ ί^^{Α dem} —"

13 13 16 18 15 12

Die biologische
Antibiotikum mit

η zierten Mäuse, wenn zwei Dosierungen, die jeweils 1 mg

, das des Produktes enthielten, itttraperitoneal verabreicht

zwei wurden, oder wenn zwei Dosierungen von jeweils 18 mg

si subkutan oder oral verabreicht wurden.

Diplococcuspneumoniae schuft-

bie zu dieser f
folgt: Weiße,

pyogenes und Tabelle Vl 810A in vivo Wirksamkeit

ist wie mit einem

toneal mit dem ³'.^D,_K7_etalfür 50% der infizierten Organismen infiziert die aUletamr w ₃ ^

Kontroütiere berechnet^*giS*iiini 6 Stunden Zum SS^t¹SfSSiSS Weg THerapie

_der Kultur und nicht-iafizierte Tage - 50 Testorganismus

Therapieweg

EDm in Mikrogramm χ zwei Dosierungen

Proteus vulgaris

55 l.p. s. α ρ. ο. Lp. ϊ>.ο. Salmonella schottmuelleri Lp.

Proteus mirabiiis

Verabreichung Ergebnisse

^keiae

60 Escherichia coli
Escherichi coü
Klebstella pneumoniae
Salmonella gaiafiaruni

6s Salmonella paüoitnö
Diplococcns pneamomae
StaphylocoGOas anröus
Streptococcus pyogenes

33

500

12100

200

5Ö0Q

4t9

9 ©00

Lp. Lp. ipip. Lp. Lp. Lp. Lp.

1670 625

927 625

Bakterielle Inaktivierung mit 810A

Ein In-vitro-Versuch diente zur Bestimmung der Resistenz des Antibiotikums 810A gegenüber bakterieller Inaktivierung im Vergleich mit Cephalosporin C, Cephaloridin uftji Cephalothin.

Das in diesem" Versuch verwendete abbauende Bakterien war ,der Cephalosporin C abbauende Mikroorganismus .Alcaligenes faecalis ATCC 212.

(a) Alcaigenes faecalis-Zellen wurden wie folgt hergestellt: Der Inhalt eines L-Rohres wurde mit einigen ml Nährflüssigkeit, die 0,2% Hefeextrakt enthielt, vermischt. Eine Schleife Aufschlämmung wurde über die Oberfläche einer Nähragar-Schrägkultur verteilt und 18 Stunden bei 37° C inkubiert. Sämtliche Schrägkulturen wurden bei 5° C aufbewahrt und innerhalb 1 Woche nach der Inkubierung verwendet. Eine Schleife des Oberflächenwachstums aus jeder Schrägkultur wurde aseptisch in 50 ml Nährbrühe, die 0,2% Hefeextrakt enthielt, übergeführt und 18 Stunden bei 28° C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde dann bei 4000UpM 10 Minuten zentrifugiert. Das überstehende Material wurde abdekantiert, und der restliche Zellklumpen wurde zweimal mit sterilem 0.1 m Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5 (6,8 g Kaliumphosphat und 7.1 g Natriumhydrogenphosphat je Liter destilliertes Wasser) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann in einem Zehntel des Orginialvolumens einer 4 mg/ml Antibiotikumlösung in 0,1 m Phosphatpuffer wieder suspendiert. Das Versuchsgemisch wurde dann ohne Schütteln in einem auf 37° C eingestellten Wasserbad bis zu 4 Stunden inkubiert. Die Versuchsgemische wurden dann bei 2000UpM 10 Minuten zentrifugiert, wobei sich ein klares überstehendes Material bildete, das in sterile Reagenzgläser dekantiert wurde und unmittelbar in Trockeneis gefroren wurde, bis es zur biologischen Bestimmung bereit war, gewöhnlich innerhalb von 3 Stunden. Vergleichsproben wurden in genau der gleichen Weise, jedoch ohne Zellen inkubiert.

(b) Die überstehenden Flüssigkeiten wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit in folgender Weise getestet: Papierscheiben von 6,4 mm wurden mit den überstehenden Flüssigkeiten angefeuchtet und auf die Oberfläche von Nähragar-(0,2%-)Hefeextrakt-Platten gebracht, die vorher mit dem entsprechenden Testorganismus beimpft worden waren. Versuchsplatten von B.-subtilis ATCC 6633 wurden in folgender Weise beimpft: 5 ml einer Suspension von gewaschenen Sporen in 0,9% Salzlösung wurden zu jeweils 150 ml Nähragar-(0,2%-)Hefeextrakt zugegeben wovon 5 ml dann in Petri-StMeä «erte3t wurden. Sämtliche Versuchsplatten «raten bei 5°C gelagert and innerhalb von 3 Tagen verwendet Die Versuchsplatten wurden ober Nacht bei 25° C inkubiert bevor Inhibierungszonen rund am die Testscheiben gemessen wurden.

indem der Mittelwert der aus jedem Versi erhaltenen drei Inhibierungszonen genommen mn! die Menge an verbleibendem Antibiotikum in Testlösung bestimmt wurde, wie sich aus ά Standardkurve ergibt. Dieser Wert wurde dann von der Ausgangskonzentration (4 mg/ml) subtrahiert und der Rest durch die Ausgangskonzentratipn_; geteilt und mit 100 multipliziert wobei die vorhandene Inaktivierung erhalten wurde, /ο folgenden Tabellen VII und VIII geben erhaltene Inaktivierung für Cephalosporin Cephalothin und das Antibiotikum 810A unter den! oben beschriebenen Bedingungen wieder. >

Tabelle VIl

!Prozentuale Inaktivierung nach Iikubierung mit gewaschenen Bakterienzellen (bestimmt auf B.-subtilis-Platten)

Antibiotikum

3 Stunden Inkubierung mit Alcaligenes faecalis

810A	0
Cephalosporin C	>99
Cephalothin	62,5

35

Tabelle VIII

Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen Bakterienzellen (bestimmt auf Platten von V.-percolans ATCC 8461)

Antibiotikum

3 Stunden Inkubierung mit Alcaligenes faecalis

810A Cephalosporin C
Cephalothin

>99 50

wur-

den in VerdSnnUBgen von 1:1, 1:2, 1:4, 1 :8, 1: IS und 1:32 untersucht um eine Standard-Be-Die Fähigkeit des Antibiotikums 810A und von Cephalosporin C, dem Abbaueffekt der Aerobactercloacae-KuItur zu widerstehen, wurde ebenfalls bestimmt Diese Kultur ist gram-negativ und gegenüber Cephalosporin C resistent Bei Durchführung des Versuchs wurden Proben der einzelnen Gemische der Organismen und eine Probe des AntibiotUum-Gemischs nach 2stündiger Inkubierung entnommen und auf die verbliebene antibiotische Wirksamkeit untersucht Das Verfahren ist die gleiche Untersuchangsmethode, wie oben für Alcaligenes faecalis beschrieben. Die Quelle der Inaktivierungssubstanz ist eine,- 1:16Ö-

Verdünnung des Filtrats einer bei 37° C während 18 Stunden durchgeführten Schüttelkultur von Aerobacter cloacae in Nährbrühe, die 0,2% Hefeextrakt enthielt Die folgende Tebelle IX gibt die prozentuale Inakriyie-

und Cephalosporin C aaf Vibrio percolans ATCC S$6f' gemäß dieser Meiböde nieder:

Tabelle IX

Prozentuale InsdaimeiMag nadi Infcufeieruig aat zeilfreiem Extrakt iihpcttmm* i-rit Xr «__„„J___ tür·.**»»!

Antibiotikum

•ti-

fca wurden bei voller Stärke nach Inkubierung in Gegenwart der gewaschenen Bakterienzellen un- 65 810A tersudtt SfönttScbe Proben worden dreifach gefah- Cephalothin

(e) ©ie prozentuale Inaktivierung wurde berechnet Cephaloridin
Cephalosporin C

«6 96 96

Unter Verwendung des gleichen Versuchsablaufs wie oben beschrieben, gibt die folgende Tabelle X die relative Beständigkeit des Antibiotikums 810A gegenüber enzymatischer Inaktivierung durch Aerobacter cloacae wieder. Die Ausgangskonzentration beträgt 250 μg/ml. Die Ergebnisse sind in μg/ml ausgedrückt.

Tabelle X

Verbleibende antibiotische Wirksamkeit
(Ausgangskonzentration = 250 μg/ml)

Antibiotikum	Versuchsorganismus	2stündige
		Inkubierung
		mit Aero
		bacter
		cloacae*) ν
810A	B. subtilis	190
Cephalothin	B. subtilis	140
Cephaloridin	B. subtilis	<10
810A	V. percolans	210
Cephalothin	V. percolans	85
Cephaloridin	V. percolans	<10
·) Zellfreier Extrakt

1 Medium I:	10,0 g
1 Hefeextrakt	10.0 g
I Glucose	2,0 ml
I *) Phosphatpuffer	0,05 g
I S^SO4-TH2O	1000,0 ml
1 Destilliertes Wasser	25,0 g
1 Agar. 1	91,0 g
ICH2PO4	95,0 g
NajiBPO,	1000.0 ml
t Destilliertes Wasser I

Das erhaltene Inoculum wurde zur Beimpfung von Schrägkulturen des gleichen Mediums verwendet. Diese Schrägkuituren wurden bei 28°C 5 Tage oder bis sie gut mit Sporen versehen waren, inkubiert, und dann wurden 10 m! Medium 11 zu den Schrägkulturen zugegeben.

Medium 11:
Fleischextrakt
NaCl
NZ Amin
Dextrose
pH 7,0

Das Antibiotikum 810A ist offensichtlich beständiger als Cephalosporin C, Cephalothin und Cephaloridin gegen Inaktivierung durch Aerobacter cloacae.

Da das Antibiotikum 810A und dessen Salze das Wachstum verschiedener Species von Salmonella in wirksamer Weise inhibieren, können sie als Desinfektionsmittel im Haushalt und in der Industrie verwendet werden. Beispielsweise ist 810A wirksam gegen Salmonella schottmuelleri und S. gallinarum.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden als Verbindungen mit dem S-Amino-S-carboxyvaleramidorest in der ^-Konfiguration mit Bezug auf den Cephemkern beschrieben. Obgleich dies auf derzeit verfügbaren Information beruht und als richtig angenommen wird, sollen die Verbindungen nicht auf diese spezielle Konfiguration festgelegt sein, falls sie auf Grund weiterer Erkenntnisse als unkorrekt nachgewiesen würde.

Beispiel 1

Herstellung des Antibiotikums 81OA und
Trennung in seine Bestandteile

Stufe A: Fermentation.

Stufe 1: Der Inhalt eines lyophilisierten Röhrchens mit Streptomyces griseus NRRL 3851 (MA-2837) wurde in 2 ml des Folgenden Mediums I suspendiert:

0,3%
0,50/0
1%
1%

Der Wuchs auf jeder Schrägkultur wurde durch Abkratzen in eine Suspension übergeführt und die Suspension als Inoculum in der folgenden Stufe 2 verwendet.

Stufe 2: Die in Stufe 1 erhaltene Suspension wurde zur Beimpfung eines mit Unterteilungen versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml sterilisiertes Medium II enthielt, verwendet Der beimpfte Kolben wurde dann auf einen Rotationsschüttler bei 220 UpM gebracht und 48 Stunden bei 28° C inkubiert.

Stufe 3: Der Inhalt eines Impfkolbens aus Stufe 2 wurde zur Beimpfung eines mit Unterteilungen versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 500 ml des Mediums II enthielt. Der beimpfte Kolben wurde dann auf einen Rotationsschüttler bei 220 UpM gebracht und 48 Stunden bei 28° C inkubiert

Stufe 4: Ein Inoculum aus 500 ml des aus Stufe 3 erhaltenen Wuchses wurde zur Beimpfung eines 750-Liter-Fermentationsbehälters aus rostfreiem Stahl, der 467 Liter eines sterilen Mediums II enthielt, verwendet Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur von 28°C unter Bewegung (130UpM) fortschreiten während ein Luftstrom von 280 l/Min.

65 Stunden beibehalten wurde. Während der Fermentation wurde ein Antischaummittel in kleinen Mengen zugegeben, um übermäßiges Schäumen zu verhindern.

Stufe 5: Ein Inoculum aus 380 Liter des erhaltenen Wuchses aus Stufe 4 wurde zur Beimpfung eines 5700-Liter-Fermentationsbehä'ters aus rostfreiem Stahl der 4500 Liter des folgenden Mediums enthielt, verwendet

Medium III:

Maisquellflüssigkeit 4%

Dextrose 2%

pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt

Man UeB die Fermentation bei einer Temperatur von 28°C unter Bewegung (120UpM) fortschreiten, während ein Luftstrom von ISBOIfMm. 30 bis 36 Standen beibehalten wurde. Wahrend der Fermentation wurde ein Polyglyfcol mit einem Molekulargewicht von 2Θ00 in kleinen Mengen zugegeben, um übermäßiges Schaamen zu verhindern. Per Ansatz wurde gewonnen und die Wirksamkeit im Scheiben-Plattenversuch foestumm.

6s Unter Verwendung von 13-mm-Scheiben ergab diese Brühe bei Gewinnung nach 31stSndiger Alterung eine Inhibierungszone von 32,5 ram gegen Proteus vulgäres.

Stufe B: Isolierung des Antibiotikumgemischs 810A.

40501 filtrierte Brühe aus Stufe A, Stufe 5, wurde nach 36 Stunden gewonnen und der pH^LWert in dem Fermentationsbehälter durch Zugabe von Phosphorsäure von 7 bis 8 auf 3,0 eingestellt Das Mycel wurde durch Durchleiten durch eine Filterpresse vom Platten-Siebtyp entfernt und verworfen. Die filtrierte Brühe wurde dann durch ein 380-1-Bett aus Adsorptionsharz 3 mit einer Fließgeschwindigkeit von 381 je Minute gegeben. Die verbrauchte Brühe wurde untersucht und verworfen, und das Harzbett mit 2 Volumen Wasser gewaschen. Das Antibiotikum wurde aus dem Harzbett mit einer 60%igen Lösung von Methanol und Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 191 je Minute eluiert. 40 Fraktionen mit jeweils 191 wurden gesammelt und untersucht Die Fraktionen 2 bis 40 wurden vereinigt und das Methanol durch Eindampfen im Vakuum entfernt Das Endkonzentrat (1581) wurde durch Zugabe von Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und eingefroren gehalten.

Proben wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris biologisch untersucht

An 40001 filtrierter Brühe durchgeführte Versuche ergaben die folgenden Zonendurchmesser:

Eluatzusammensetzung und Eluatkonzentrat: Es wurden ebenfalls Versuche an 7401 (195 gallons) Eluatzusammensetzung und 1581 (413 gallons) Antibiotikum 810A in Form von Eluatkonzentrat durchgeführt

Eluatzusammensetzung	Eluatkonzentrat 810A	1V9 kg
Verdünnung ZonengröBe	Verdünnung Zonengröße
1 :5 28,8 mm	1:16 27,25 mm	7,23 kg
1:10 27,0 mm	1:32 243 mm	7,20 kg
1 :20 23,8 mm
1 :40 21,0 mm
Untersuchung der Gesamtfeststoffe:
Filtrierte Brühe
7401 Eluatzusammen
setzung
1581 Eluatkonzentrat

Stufe C: Adsorption an einem Anionenaustauschharz.

Das Konzentrat aus Stufe B (78,51) wurde mit Wasser auf 1181 verdünnt und an ein 223-1-Bett des Harzes 2 (Chloridzyklus) bei einem pH-Wert von 4,0 und einer Strömung von 7,61 je Minute adsorbiert Danach folgte eine Wäsche mit 451 Wasser, wonach das Harzbett mit einer Lösung aus 1 m Natriumnitrat und 0,1 m Natriumacetat bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 l/Min, eluiert wurde. Zehn 19-1-Eluatfraktionen wurden dann gesammelt und der pH-Wert mit der aufgefangenen Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt

Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Platte-Methode gegen Proteus vulgaris biologisch wie folgt untersucht:

Beschickungslosung Verdünnung Zonengröße

Eluatfraktionen, Verdünnung 1 :10 Fraktion ZonengröBe Fraktion Zonen

große

1:10	283 mm	1	27 mm	6	25 mm
1 :20	26,5 mm	2	30 mm	7	23 mm
1 :40	24 mm	3	28,5 mm	8	22 mm
		4	26 mm	9	21 mm
		5	26 mm	10	17,5 inm

Der verbrauchte Strom ergab nach Untersuchung 25 mm ohne Verdünnung und das Waschwasser ergab nach Untersuchung 23 mm ohne Verdünnung.

Stufe D: Adsorption an Anionenaustauschharz.

Die Fraktionen 1 bis 10 aus Stufe C wurden kombiniert und einem 45-Liter-Bett aus Harz 3 bei einen} pH-Wert von 3,0 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 l/Min, zugeführt Das Harzbett wurde mit 901 Wasser bei der gleichen Geschwindigkeit gewaschen. Das Antibiotikum wurde dann aus dem Harz durch eine 25%ige Lösung aus Aceton und Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 51/Mm. eluiert Sechzehn tö-t-Fraktionen wurdea gesammelt

45 Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris untersucht Die Beschickung (190 Liter) ergab die folgenden Zonendurchmesser:

Beschickungslösung Verdünnung ZonengröBe

1 :5 30 mm

1:10 273 mm

1 · 0Π Oi ·» _MM

l . £AM JirT^L· ΠΤΓΠ

Die Zonendurchmesser der Eluatfraktionen wurden in der folgenden Tabelle zusanuneageiaßt-.

Ehiatfraktion Fraktion

Verdünnung ZonengröBe

Etaatfraktion Fraktion

Zaaeogrofie

!:»
l:Kf 1:10 1:10 1:10 1:1© 1:10

203 mm 29 ram 29 mm 29 mm 28 mm 27 bob 26 nan 26 nun

9 10 U 12 13 14 15 16 :5 :5 :5 :S :5 :5

273 nam SS en

mm

Λ*

* 32

Die obigen Eluatfraktionen 2 bis 16 wurden Lombiniert und das Aceton durch Eindampfen im /akuum auf ein Bndvolumen von 17,4 liter entfernt 3as 17,4-Lher-KonzeBtrat wurde durch Ammoniumhyiroxid auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wobei 620 g Antibiotikum 810A, d. h. ein Gemisch, bestehend im wesentlichen aus 7/?-(D-5-

Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(«-methoxy-p-sulfo-

oxycinnamoyloxymethylH-methoxy-a-cephem^-carbonsäure und 7ß-{D-5-Anüno-5-carboxyvaleramido>3-

(a-methoxy-p-hydroxydmiamoyloxymethylH-methoxy-a-cephem-^carbonsäure, erhalten wurde. Dieses trockene Produkt hatte eine Wirksamkeit auf Grund der biologischen Untersuchung von 320mcg/ml für eine 25-mm-Zone.

_l5

Stufe E: 70-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl^-methoxy-S-cephem-4-carbonsture.

20

Eine Chromatographie-Kolonne von 2,5 cm Durchmesser wurde auf eine Betthöhe von 100 cm mit Anionenaustauschharz 1 in einem 0,5 m Ammoniumbromid und 0,05 m Essigsäure enthaltenden System gepackt Das in Stufe D erhaltene Gemisch des Antibiotikums 810A (10,0 g) wurde in 18 ml einer Lösung aus 0,5 m Ammoniumbromid und 0,05 m Essigsäure gelöst und in die Kolonne eingebracht Die Eluierlösung wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 81 ml/h gepumpt und es wurden 10-ml-Fraktionen des Eluats maschinell gesammelt Der Eluatstrom wurde durch ein Differential-Refraktometer überwacht Die Refraktometer-Aufzeichnung zeigte Massenpeaks bei den Röhren 19, 36, 79, 109 und 206. Scheiben-Plattenversuche gegen Proteus vulgaris ATCC 21100 wurden bei jeder dritten Fraktion unter Verwendung von bei einem pH-Wert von 7,0 gepufferten 13-mm-Scheiben durchgeführt Die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt (Die Fraktionen 1 bis 66 ergaben auf Grund der Untersuchung Null.)

82 bis 130 wurden kombiniert und die Fraktionen 180 bis 234 wurden kombiniert

Die die erste aktive Komponente enthaltenden Fraktionen aus den obigen Versuchen wurden kombiniert und an ein 100-ml-Bett aus Harz 3 adsorbiert Das Bett wurde mit 1 Volumen Wasser gewaschen und dann mit 3 Volumen einer 90%igen Lösung aus Methanol und Wasser eluiert Das Methanol wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt und das wäßrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet wobei 810 mg 70-(D-5-Ainino-S-carboxyvaleramidoJ-S-ta-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden. Die biologische Wirksamkeit dieses Produktes, bestimmt nach der Scheiben-Plattenuntersuchungsmethode gegen Proteus vulgaris, betrug 18 μ£/ιη1 und ergab eine 25-mm-Zone. Analyse auf Grund von Ultraviolett-Adsorption ergab die folgenden charakteristischen Daten:

UV-AdsorptioninO,l n-HCl:Amax305;E il 524, UV-AdsorptioninO,l n-NaOH:Ämax328;E ,* 564.

Stufe F: 7|3-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(«- methoxy-p-sulfoxycinnamoyloxymethylH-methoxy-S-cephem-4-carbonsäure.

Die Fraktionen aus den beiden Versuchen auf Harz 1, welche die zweite aktive Komponente enthielten, wurden vereinigt und an ein 100-ml-Bett von Harz 3 adsorbiert. Das Bett wurde mit 1 Volumen Wasser gewaschen und dann mit" 3 Volumen einer 90%igen Lösung aus Methanol und Wasser eluiert. Die angereicherten Eluate wurden kombiniert, und das Methanol wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt Das wäßrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 720 mg 7/}-(D-5-Amino-5-carboxy-

valeramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure.

UV-Adsorption in 0,1 n-HCl:A max 287 mm; Ei?» 432, UV-Adsorption in 0,1 n-NaOH: λ max 280 mm: ΕΛ

Fraktion	Zonen	Fraktion	Zonen	Fraktion	Zonen
	durch		durch		durch
	messer		messer		messer
69	18mm	122	29	204	>40
72	24	125	28	207	>40
75	26	128	27	210	>40
78	31	131	26	213	>40
81		134	24	216	>40
83	35	137	21	219	40
86	37	140	20	222	38
89	38	150	18	225	35
92	38	160	20	228	32
95	>40	170	29	231	31
98	>40	180	35	234	27
101	>40	183	38	237	24
104	>40	186	40	240	23
107	>40	189	>40	243	19
110	>40	192	>40	246	17
113 l	40	195	>40	249	0
116	38	198	>40	252	0
Ü9	33	?0t	>40

Beispiel 2

45

50

55

60

Die Fraktionen 80 bis 133 wurden kombiniert und die Fraktionen l70bis 230 wurden kombiniert Der obige Versuch wurde wiederholt die Fraktionen Abtrennung von 70-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-S-cephem^-carbonsäure aus dem Antibiotikum öl OA.

Das antibiotische 810A-Gemisch aus 70-{D-5-Amino-

S-carboxyvaleramidoyS-ia-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

und 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(<x-meth-

oxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl^-methoxy-S-ce-

phem-4-carbonsäure (5,0 g), das nach Beispiel 1, Stufe D, erhalten wurde, wurde in 20 ml einer 20%igen Lösung aus Aceton und Wasser gelöst und der pH-Wert auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde auf ein Bett aus Harz 3

von 5 cm Durchmesser χ 100 cm Höhe in 20%iger Aceton- und Wasserlösung gegeben. Eine Lösung aus

20% Aceton und Wasser wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von 88OmUh gepumpt, und 20-ml-Fraktionen wurden automatisch gesammelt

Scheiben-Plattenuntersuchungeh gegen Proteus vulgaris ATCC 21100 wurden bei jeder dritten Fraktion unter Verwendung von 6-mm-Scheiben durchgeführt. Die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

609 583/469

Fraktion Zonen- Fraktion Zonen- Fraktion Zonen- <}jirch- «durch- durchmesser messer messer

-41	0	131	0	221	18
44	12mm	134	0	224	18
47	22	137	0	227	18
50	25	140	8	230	17
53	29	143	H	233	17
56	31	146	13	236	15
59	35	149	13	239	15
62	30	152	15	242	!5
65	28	155	15	245	15
68	.27	158	16	248	14
71	25	161	17	251	14
74	24	164	18	254	14
77	21	167	17	257	13
80	20	170	18	260	13
83	19	173	20	263	12
86	16	176	21	266	12
89	14	179	21	269	12
92	13	182	21	272	11
95	13	185	21	275	11
98	13	188	22	278	10
101	13	191	23	281	10
104	14	194	23	284	9
107	13	197	23	287	8
110	13	200	22	290	0
113	11	203	24	293	0
116	10	206	24	296	0
119	9	209	24	299	0
122	8	212	24	302	0
125	8	215	24
128	8	218	19	330	0

Die Fraktionen 44 bis 90 wurden vereinigt, Aceton wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt, und das wäßrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 33 g rohe 70-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(amethoxy-p-sulfooxycinnamoyl-oxymethylj^-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden.

Die Fraktionen 150 bis 225 wurden vereinigt und ergaben bei ähnlicher Behandlung 700 mg 7/?-(D-5-Amino-S-carboxyvaleramidoJ^a-methoxy-p-hydroxycin- namoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure.

Eine Wiederholung des obigen Versuchs ergab 3,1 g rohe 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)3-(«-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethylJ^-methoxy-S-cephem-4-carbonsäure und 40O¹ mg 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramidoJO-ia-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure. Die beiden Mengen an 7/J-(D-5-Amino-5-carboxy-

valeramidoJ-S-ia-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4carbonsäure, die nach der vorangehenden Methode erhalten wurden, wurden vereinigt, und die 6,4 g Material wurden in ein Bett aus Harz 3 von 5 cm Durchmesser χ 100 cm Höhe in einer 5°/oigen Lösung aus Methanol und Wasser eingebracht. Eine 5%ige Methanol- und Wasserlösung würde durch das Bett mit einer FÜeflgeschwindigkeit Von 880 ml/h gepumpt, und 20-ml-Fraktionen wurden automatisch gesammelt 287 Fraktionen wurden gesammelt, und jede vierte Fraktion wurde nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris ATCC 21100 unter Verwendung von 6-mm-Scheiben untersucht. Die Untersuchungsergebnisse sind ir der folgenden Tabelle aufgeführt Die Fraktionen 1 bis 50 wurden dty un??rsucht

Fraktion Zenengröße Fraktion

Zonengrafie

20

20

19

18

19

16

17

15

16

15

13

11

Die Fraktionen 95 bis 159 wurden vereinigt, das Methanol wurde im Vakuum abgedampft, und das wäßrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 700 mg 70-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(«- methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden. Das Ultraviolett-Spektrum von 7jJ-(D-5-Amino-5-carboxyvalerami-

do)-3-(«-methoxy-p-sulfooxycinnamoyIoxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure ergab die folgenden Adsorptionsdaten:

51	23 mm	115
55	26	119
59	23	123
63	18	127
67	12	131
71	0	155
75	0	139
79	0	143
83	7	147
87	9	151
91	13	155
95	19	159
99	21	163
103	22	167
107	22	171
111	21	287

160, 1 166.

UV-Adsorption in 0,1 n-HCl:Amax 285; E₁U_n UV-Adsorption in 0,1 n-NaOH:Amax 277; E

Bei Untersuchung mit 13-mm-Scheiben nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus vulgaris ergab die Probe von 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfoox_iycinnamoyloxymethyl)-7-meth·· oxy-3-cephem-4-carbonsäure eine 25-mm-Zone bei 88 mcg/ml und die Probe aus 7j8-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido^S-fc-methoxy-p-hydroxycinnamoyl- oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eine 25-mm-Zone bei 167 mcg/ml.

Beispiele für pharmazeutische Zubereitungen:

a) Kapseln

je Kapsel

7j9-(D-5-Amino-5-carbaoxy-	120 mg
valeramido)-3-(a-methoxy-	20 mg
p-sulfooxycinnamoyl)-oxy-	5 mg
methyl)-7-methoxy-3-cephem-
4-carbonsäure
Lactose
Magnesiumstearat

145 mg

Die 7jJ-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(A-

methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird auf ein Pulver einer Korngröße entsprechend einem Siebdurchgang durch ein Sieb mit 0,25 mm Maschenweite zerkleinert; dann werden Lactose und Magnesiumstearat durch ein

35

Siebtuch mit 0,25 nun lichter Maschenweite auf das Pulver gegeben. Die vereinigten Bestandteile werden 10Minuten vermischt und dann in Gelatine-Kapseln eingefüllt

b) Tabletten

70-(D-5^Anüno-5-carboxyvaleramido)-3-(«-methoxyp-sulfooxydnnamoyl oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

je Tablette

250 mg

Dicalciumphosphat, USP. Magnesiumstearat Lactose, U.S.P.

192 mg

5 mg

65 mg

Der Wirkstoff wird mit dem Dicalciumphosphat und der Lactose vermischt Das Gemisch wird mit 15%iger Maisstärkepaste (6 mg) granuliert und grobgesiebt Es wird bei 45° C getrocknet und wieder durch ein S«eb mit 1,2 mm lichter Maschenweite gesiebt, Das Magnesiumstearat wird zugegeben und das Gemisch zu Tabletten von etwa 13 mm Durchmesser gepreßt

Claims (3)

1. s|ure-Verbindungen der allgemeinen Formel

   HOOC-CH-(CH₂)₃—CG—NH

   NH₂

   Patentansprache: ~ '.-.

   worin R¹² eine Hydroxy- oder Sulfooxy-Gruppe bedeutet, und deren Salze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces griseus NRRL 3851, 3951, 3952 oder 3953, oder Streptomyces viridochromogenes NRRL 3970,3971,3972,3966,3967.3968,3969,3962, 3963,3964 oder 3965, oder Streptomyces fimbriatus NRRL 3954, 3956, 3957, 3958 oder 3955, oder Streptomyces halstedii NRRL 3959,3960 oder 3961, oder Streptomyces rochei NRRL 3973, oder Streptomyces cinnamonensis NRRL 3974, oder Streptomyces chartreusis NRRL 3975 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium züchtet, aus der Fermentationsbrühe in an sich bekannter Weise durch Adsorption an ein Anionenaustauscherharz ein Gemisch der beiden Verbindungen gemäß Anspruch 1 isoliert und das erhaltene Gemisch in an sich bekannter Weise durch Chromatographie in die beiden Verbindungen trennt und gegebenenfalls eine oder beide der erhaltenen Verbindungen in Salze überführt
3. 3. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Hufs und/oder Trägerstoffen.