DE2109854C3

DE2109854C3 - 7beta-(D-5- Amino- 5-carboxyvaleramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze, Verfahren zu Ihrer Herstellung und solche Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2109854C3
Application number: DE2109854A
Authority: DE
Inventors: Justo M Mata; Edward O Stapley
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1970-03-13
Filing date: 1971-03-02
Publication date: 1975-06-05
Also published as: BE764160A; SE385713B; NL171285B; CH586226A5; FR2085702B1; AR212149A1; IE35110L; DE2109854A1; FI51484C; DD100002A5; FR2085702A1; DE2166463A1; IL36281A; IL36281A0; DD99166A5; CH587856A5; AR201142A1; JPS581919B1; DE2109854B2; YU35164B

Description

Gegenstand der Erfindung sind 7/HD-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind wirksam gegen gramnegative und grampositive Bakterien.

Abgesehen von der antibiotischen Wirksamkeit sind diese erfindungsgemäßen Verbindungen auch Zwischenprodukte bei der Herstellung der entsprechenden 3-Hydroxy-, 3-Acyloxy- und Carbamoyloxy-Derivate. 7/HD-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoylao oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure we^;st

folgende Strukturformel auf:

OCH₃

HOOC — CH — (CH,)₃ — C — NH —

NH₁

N I CH.OCNH,

COOH

Im folgenden wird 7/3-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyI)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure als Antibiotikum 842A oder einfach mit 842 A bezeichnet.

In der Verbindung wird für den 5-Amino-5-carboxyvaleramidorest die ^-Konfiguration mit Bezug auf den Cephemkern angenommen.

Zu den erfindungsgemäßen Salzen gehören organische und anorganische Salze, z. B. Säureadditionssalze, Metallsalze, wie Alkali- und Erdalkalisalze, quaternäre Salze und Aminsalze, die sich von primären, sekundären und tertiären Aminen ableiten, beispielsweise von Monoalkylaminen, Dialkyiamineii, Trialkylamimen, niedrigmolekularen Alkanolamine^ Di-niedrigmolekularen Alkanolamine^ nicdrigmolekularen Alkylendiaminen.N.N-Diaralkyl-nicdrigmolekular.-alkylendiaminen, Aralkylamine^ aminosubstituierten niedrigmolekularenAlkanolen, N,N-di-niedrigmolekular.-alkylaminosubstituierten niedriginolekularen Alkanolen, amino-, polyamino- und guianidinosubstituierten niedrigmolekularen Alkansäuren und stickstoffhaltigen heterocyclischen Aminen. Zu typischen Beispielen dieser Salze gehören Salze, die sich von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid oder Calciumcarbonat ableiten und Salze, die sich von Aminen, wie Trirncthylamin, Triäthylamin, Piperidin, Mqrpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dil>enzyläthylendiamin, Diethanolamin, Piperazin, Dirnethylaminoäthanol, 2-Amino-2-mel:hyl-l-propanol, Theophyllin oder N-Methylglucamin, ableiten.

Die vorstehend erwähnten Salze können Monosalze sein, wie das Mononatriumsalz, oder gemischte Disalze, die durch Behandlung eines Äquivalents des Monosalzes mit einem Äquivalent einer abweichenden Base, erhalten wird. Diese Disalze ..können auch erhalten werden, indem ein Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie beispielsweise Calcium-

hydroxid, mit einem Äquivalent des Antibiotikums 842 A behandelt wird. Bevorzugt sind die Alkali- und Erdalkalisalze, besonders das Mono- und Dinatriumsalz.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden hergestellt, indem man Streptomyces lactamdurans NRLL 3802 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, die Verbindung gemäß Anspruch 1 an einem Ionenaustauscherharz isoliert und gewünschtenfalls in ein Salz überführt.

Kultur: Der das Antibiotikum 842A erzeugende Mikroorganismus ist ein bisher unbekannter Stamm der Actinomycetes. Das ursprüngliche Isolat wurde als eine Einzelkolonie aus Boden auf einer Agar-Schrägkultur erhalten und in einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

Hefeextrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphat-Puffer*) 2,0 ml

MgSO, · 7 H₂O 0,05 g

Destilliertes Wasser pH 6,5 1000,0 ml

·) Phosphat-Puffer:

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₁HPO, 95,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

65 Nach mehrtägigem Wachstum konnte keine Sporenbildung festgestellt werden. Der Mikroorganismus erzeugte ein Antibiotikum, das sich von bekannten

Antibiotika auf Grund seines Profils in verschiedenen *.„logischen und chemischen Untersuchungen unterhied Vergleiche dieser Daten mit solchen, die über bekannte Antibiotika erhalten wurden, ergaben, daß K42A eine neue Verbindung ist.
Taxonomie: Der 842 A erzeugende Mikroorganis_us (interne Bezeichnung Kultur MA-2908) wurde Is ein neuer Actinomycet identifiziert. Die bei dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe und in »The Actinomycetes«, Bd. 2, »Classification, Identification and Description of Genera and Species«, c A Waksman (1961), beschrieben. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, daß die Kultur zum Genus Streptomyces gehört und viele der Attribute der bekannten Species Streptomyces fradiae besitzt. Biochemisch stimmt sie vollständig mit letzterer überein. Morphologisch bestehen jedoch wesentliche Unterschiede. Beispielsweise ist die Farbe des Lufunycels von S.fradiae ein seemuschelfarbenes Rosa, während die Kultur MA-2908 gewöhnlich cremefarben eefärbt ist. Auch zeigt das vegetative Wachstum in der MA-2908-Kultur Pigmentunterschiede auf verschiedenen verwendeten Medien, und, wie vorstehend aneben, _wurde auf Standard-Taxonomie-Medium keine Sporenbildung wahrgenommen. Auf der Basis dieser Unterschiede wurde die Kultur als eine neue Species Streptomyces lactamdurans bezeichnet. Die folgende Tabelle I beschreibt die biochemischen Eigenschaften von Streptomyces lactamdurans und solche des bekannten Streptomyces fradiae. Sämtliche Werte in Tabelle I wurden nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28⁰C ermittelt, ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des verwendeten Mediums bei diesen Untersuchungen war etwa neutral, nämlich 6 8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche wurden nach Ablauf von 7 und 21 Tagen durchgeführt. im allgemeinen breitgeformt und von etwa 0,9 ■ 1,7 μ Größe unterteilt waren.

Tabelle I
Biochemischer Vergleich

Versuch	Streptomyces lactamdurans	Streptomyces fradiae
Luftmycel ...	gerade, einige	gerade, Verzwei
	Verzweigungen	gungsfäden
Conidien	nicht ermittelt	stabförmig
Lösliches
Pigment	keines	keines
optimale
Temperatur ..	28°C	25° C
Invertase	negativ	negativ
Reduktion
von Nitrat ...	negativ	negativ
Gelatine-
Verflüssigung .	positiv	positiv
Ccllulose-
verbrauch ...	negativ	negativ
Lackmusmilch	alkalische	alkalische
	Peptonisierung	Peptonisierung

Morphologie: Sporophore wurden nicht ermittelt, wenn die Kultur auf den bei der Beschreibung der Kultureigenschaften aufgeführten Medium gezüchtet wurde, selbst obgleich wiederholte Beobachtungen bis zu 8 Wochen durchgeführt wurden. Jedoch zeigten gefärbte Impressionsobjektträger lange Fäden, von denen viele in Untereinheiten verschiedener Größen Das Luftmycel ist kurz, gerade, wenig verzweigt. Es scheint etwa die gleiche Größe wie das vegetative Mycel aufzuweisen — 0,9 μ Breite. Es ist hell, pulverförmig und leicht abkratzbar.

Das vegetative Mycel ist grampositiv, nicht säurefest. Es haftet fest an dem Agar und ist in einigen Fällen in den Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse ίο Aufspaltung zu Stäben bei der Schüttelkolbenzüchtung, die jedoch nicht erheblich ist. Das vegetative Mycel auf den Schüttelkolben und den stationären Kolben (Impfmedium, 4 bis 6 Tage, 28°C) zeigte einige »Keime« und kurze, verdickte, fast knoten- oder keulenartige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht zahlreich und ihre Bedeutung, falls überhaupt, ist nicht bekannt.

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar
Vegetatives Wachstum — Rückseite orange, eben, »o trockenes Aussehen, faltig.

Luftmycel — spärlich, creme-farben. Kein lösliches Pigment.
Czapek-Dox Agar
Vegetativ — eben, tiefereme-farben. Luftmycsl — pulverförmig, creme-farben weiß. Kein lösliches Pigment.
Glycerin-Asparagin-Agar

Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite goldgelb bis orange

Luftmycel — pulverförmig, creme-farben mit blaßpfirsich-farbenen Tönungen.
Lösliches Pigment — blaß-berrtstein-farben. Eialbumin-Agar

Vegetatives Wachstum — eben, creme-farben bis gelb. Luftmycel — pulverförmig, creme-farben. Kein lösliches Pigment.
Calcium-Malat-Agar

Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite — gelb mit orange-fa! Denem Rand.

Luftmycel — pulverförmig, weiß bis creme-farben mit pfirsich-farbenem Rand.
Kein lösliches Pigment.
Tyrosin-Nähragar

Vegetatives Wachstum — eben, gelbbraun bis orange. Luftmycel — spärlich, creme-farben mit weiß. Kein lösliches Pigment.
Tyrosin-Kristalle werden zersetzt. Melasse — Hefe-Hydrolysat-Agar Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite — orange. Luftmycel — pulverförmig, creme-farben weiß. Kein lösliches Pigment.
Nähragar

Vegetativ — eben goldgelb.
Luftmycel — pulverförmig, creme-farben. Kein lösliches Pigment.
Lackmusmilch

Spärliches Ringwachstum — gelbbraunes, vegetatives Wachstum — kein Luftmycel.
Peptonisierung — alkalische Reaktion. pH 7,3 bis 7,4 (Vergleich pH — 6,7). Entrahmte Milch

Spärliches Ringwachstum — gelbbraun bis orange. Vegetatives Wachstum — kein Luftmycel, hell-gelbbraunes lösliches Pigment. Peptonisierung — alkalische Reaktion. pH 7,2 (Vergleich pH — 6,6).
Magermilch-Agar
Vegetatives Wachstum — eben, orange.

Luftmyccl — mäßig, creme-farben bis blaß-korallcnfarben, hell-gelbbraunes lösliches Pigment. Hydrolyse von Casein.
Gelatine-Ansatz

Spärliches, creme-farbenes bis orange-farbenes, vegetatives Kolbenwachstura innerhalb des Rohrs suspendiert.

Kein lösliches Pigment.
Vollständige Verflüssigung.
Gelatine-Nähragar

Vegetatives Wachstum — eben, orange. Luftmycel — spärlich, pulverförmig creme-farben. Kein lösliches Pigment.
Verflüssigung von Gelatine.
Stärke-Nähragar

Vegetatives Wachstum — eben, orange-farben. Luftmycel — spärlich, pulverförmig, rosa-farben bis creme-farben.
Kein lösliches Pigment.
Mäßige Hydrolyse der Stärke.
Synthetischer Stärkeagar

Vegetatives Wachstum — eben, Rückseite — cremefarben mit orange-farbenem Rand. Luftmycel — pulverförmig, weiß mit pfirsich-farbenem Rand.

Kein lösliches Pigment.
Mäßige Hydrolyse der Stärke.
Löffler's Blutserum-Agar

Vegetatives Wachstum — creme-farben bis orange. Luftmycel — keines.
Kein lösliches Pigment.
Keine Verflüssigung.
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum — creme-farben. Luftmycel — spärlich, weiß.
Kein lösliches Pigment.
Mikroaerophiles Wachstum

(Hefeextrakt — Dextrose-Stichkultur — 40 mm Tiefe des Stichs).

Gutes Oberflächenwachstum längs des oberen V4 der Stichlinie.

Temperatur — Hefeextrakt-Dextrose-Schrägkulturen Gutes Wachstum bei 28 ⁰C.
Spärliches Wachstum bei 37° C.

Kein Wachstum bei 50⁰C.
Hefeextrakt — Dextroseagar
Vegetatives Wachstum — eben, goldgelb.
Luftmycel — pulverförmig, cremc-farben bis blaßfleisch-farben rosa.
Kein lösliches Pigment.
Kartoffelschnitt

Vegetatives Wachstum — trocken, eben, creme-farben bis orange.

ίο Luftmycel — spärlich, creme-farben.
Kein lösliches Pigment.
Reduktion von Nitraten — negativ.

Sämtliche Werte wurden nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28 ⁰C genommen, ausgenommen, wo es

»5 anders vermerkt wird. Physiologische Versuche erfolgten nach 7 und 21 Tagen.

Die morphologischen Unterschiede zwischen Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae sind in der folgenden Tabelle H aufgeführt. Die Beobach-

ao tungen erfolgten auf den in Tabellen angegebenen Medien in Wachsintervallen von 1 Woche, 3 Wochen und 8 Wochen. Das Luftmycel von S. lactamdurans ist kurz und gerade mit wenig Verzweigung. Es scheint etwa die gleiche Größe wie das vegetative Mycel auf-

zuweisen, d. h. 0,9 μ. Breite. Es ist helL pulverförmig und leicht abkratzbar. Das vegetative Mycel ist grampositiv; es ist nicht säurefest. Es haftet fest an einigen Medien und ist in Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse Aufspaltung in Stäbe bei Schüttelkolben-

Wachstum, jedoch ist dies nicht erheblich. Das vegetative Mycel aus Schüttelkolben und stationären Kolben (Impfmedium während 6 Tagen, 28°C) zeigt einige »Keime« und kurze, verdickte, fast keulenförmige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht zahlreich. Sämtliche Werte in Tabelle II wurden nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28°C genommen, ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des zu diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche erfolgten nach Ablauf von 7 und 21 Tagen. Die zur Beschreibung verwendeten Farben stehen in Übereinstimmung mit den Definitionen nach »Color Harmony Manual«, 4. Ausgabe, 1958; Container Corporation of America.

Tabelle II
Morphologischer Vergleich von Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae

Medium

Streptomyces lactamdurans Streptomyces fradiae

Czapek-Dox-Agar
Nähragar

Glycerin-Asparaginagar

Hefeextrakt-Dextroseagar

Vegetatives Wachstum: eben, tief-creme-farben Luftmycel: pulverförmig, creme-farben-weiß Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: eben, creme-farben bis

goldgelb

Luftmycel: pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: eben,

Rückseite — goldgelb bis orange Luftmycel: pulverförmig, creme-farben mit

blaß-pfirsich-farbencr Tönung Lösliches Pigment: blaß-bernstein-farben

Vegetatives Wachstum: eben, goldgelb Luftmycel: pulverförmig, creme-farben bis

blaß-fleischrosa Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: farblos
Luftmycel: Muschelschalenrosa

Vegetatives Wachstum: orange bis gelb

Vegetatives Wachstum: sand-farben

Fortsetzung Tabelle II

Medium

Synthetischer
Stärkeagar

Streptomyces lactamdurans

Kartoffelschnitt

Gelalinestich

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum: eben,

Rückseite — cremc-farben mit orangefarbenen Rändern

Luftmycel: pulverförmig, weiß mit pfirsichfarbenen Rändern

Lösliches Pigment: mäßige Hydrolyse der Stärke

Vegetatives Wachstum: trocken, eben, creme-farben bis orange

Luftmycel: spärlich, creme-farben

Kein lösliches Pigment

Vegetatives Wachstum: spärliche, creme-farbene bis orange-farbene Flocken suspendiert in dem Rohr

Luftmycel:

Kein lösliches Pigment

Vollständige Verflüssigung

Vegetatives Wachstum: gelbbraun, spärlicher Wuchsring

Luftmycel: keines

Peplonisierung: alkalische Reaktion, pH 7,3 bis 7,4 (Vergleich pH — 6,7) Strcptomyccs fradiac

Vegetatives Wachstum: farblos
Luflmycel: Seemuschelrosa

Vegetatives Wachstum: orange

Vegetatives Wachstum: cremefarben bis braun

Vegetatives Wachstum: cremefarben

Kohlehydrat-Verwertung: Die Streptomyces lactamdurans Kultur (MA-2908) wurde auch hms.chthch ihrer Fähigkeit, verschiedene ^hlehydra e z" verwerten, oder zu assimilieren, untersucht '"dem der Mikrooreanismus in einem synthetischen Grund mediunT(T.G.Pridham und DG ο ti 1· eb 1948), das 1% des Kohlehydrats enthielt be 28 C während 3 Wochen gezüchtet wurde. Tabelle 111 gibt die Verwertung oder Assimilation *«« ^Kohlehyd atquellen durch die Streptomyces lactamdurans.Kult ur (MA-2908) wieder. Die Erklärung der Zeichen 'n Tabelle 111 sind wie folgt: + bezeichnet gutes Wachs turn, ± bezeichnet geringes Wachstum und - beze.ch net kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat.

Tabelle III

Kohlehydrat

Glucose

Arabinose

Maltose

Raffinose

Saccharose

Xylose

Mannit

Lactose

Mannose

MA-2908
Kultur

Kohlehydrat

Rhamnose

Cellulose

Fructose

Inosit

Acetat

Citrat

Paraffin

Glycerin

MA-2908 Kultur

Die in den Tabellen I bis III ^^h™* *£_ schäften wurden zur Zurückführung der Streptomyces lactamdurans-Kultur (MA-2908) auf e.ne Spec» Klassifikation über die in »Bergeys Manual oi!Deter minative Bacteriology«, 7. Ausgabe, S.694 bis 8zv (1957) und in »The Actinomycetes<s Bd. 2 S..61 bis 292 (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet Em Vergleich der detaillierten Eigenschaften der Strepto myces-lactamdurans-Kultur mit bekannten Species zeigt, daß die Kultur biochemisch Streptomyces fradiae ähnlich ist. Jedoch bestehen, wie oben angegeben, bedeutende morphologische Unterschiede, beispielsweise

hinsichtlich der Farbe des Luftmycels von S. fradiae, die seemuschelrosa-farben ist, im Vergleich zur Creme-Farbe der Kultur. Auch wurde, während das vegetative Wachstum bei S. fradiae keine Pigmentunterschiede auf verschiedenen Medien ergibt, keine Sporenbildung

bei der Kultur festgestellt. Auf der Basis dieser Unterschiede und der in den vorangehenden Tabellen beschriebenen Eigenschaften, wurde der das Antibiotikum 842 A (MA-2908) erzeugende Mikroorganismus als neue Species Streptomyces lactamdurans bezeichnet.

Fermentation: Das Antibiotikum 842A wird durch aerobe Fermentation geeigneter wäßriger Nährmedien unter geregelten Bedingungen durch Beimpfen mit dem Organismus Streptomyces lactamdurans erzeugt. Im allgemeinen können zahlreiche Kohlenstoff- und

Stickstoffquellen eingesetzt werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Zucker, z. B, Glucose, Arabinose, Maltose, Xylose und Mannit und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Reis, Maisstärke und Maismehl. Beispiele für StickstoffquelleE

sind Hefehydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl. Hydrolysate von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche Destillationsrückstände oder Tomatenpaste. Die genaue Menge der Kohlehydrat- und Stickstoffqueller hängt von den anderen im Fermentationsmedium ent-

haltenen Bestandteilen ab, jedoch liegt im allgemeiner die Kohlehydratmenge gewöhnlich bei 1 bis 6 Ge· wichtsprozent des Mediums und die Menge an ver fügbarem Stickstoff, entweder allein oder in Kombi nation liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 0,2 bi;

etwa 6 Gewichtsprozent des Mediums. Die verschie denen, im folgenden beschriebenen Medien dienen zui Erläuterung von Medien, die zur Herstellung de: Antibiotikums 842A geeignet sind.

509 623/157

Medium iX

Autolysierte Braucreihefe 10,0g

Lösliche Brauerei-Rückstände 20,0 g

Dextrose 10,0 i>

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 7,0

Medium X

Sojabohnenmehl 30,0 g

Lösliche Brauerei-Rückstände .... 7,5 g

Glucose 20,0 g

NaCI 2,5 g

CaCOa (nachher pH-Wert auf 7,0) 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

Medium XI

Autolysierte Brauereihefe 10,0 g

Lösliche Brauerei-Rückstände 20,0 g

Deslilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 7,0

_ml(j jj_e Tempenitur bei etwa 28 ¹C gehalten wird Durch Veränderung der faltwicklung des Inoculums ^un^ Veränderungen des Produktionsmediums ist es ^auc'¹ möglich, eine mehrfache Verbesserung der Pro-Auktion und eine Steigerung der Wirksamkeit dieses Antibiotikums zu erreichen.

Isolierung und Reinigung: Das Antibiotikum 842A ^w'^fd durch Adsorption an einem lonenau*iauschharz, ^w'^e beispielsweise an Harzen, die aus quaternären

Ammonium- oder Sulfonsäure-Austauschmedien aufgebaut sind, gereinigt. Das adsorbierte Antibiotikum ^{wird aus de}m Harzadsorbat mit wäßrigen Lösungen ^{oder mit einer} wäßrigen, alkoholischen Lösung eines geeigneten Salzes, z. B. Ammoniumchlorid oder Na-

'^{5 tr}iumch!orid, eluiert. Zu geeigneten, verwendbaren lonenaustauschharzen gehören beispielsweise die PoIystyrolharze mit im Kern befindlichen Sulfonsäuregruppen (45 oder 53 "_u Wasser) oder Polystyroltri-

^ ^Zub-ei«ungen: D* AntZükum842A und seine

NähSfn Slim tt th> »«A geeigneten Salze können in Kapselform oder als Tabletten. Pulver NJirmedien soll im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 8,0 *₅ oder flüssige Lösungen oder als Suspensionen oder

^E"*'ere verwendet werden. Sie können oral, intravenös

bei man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 28°C während mehrerer Tage auf einer Schüttelvorrichtung fortschreiten läßt. Nach Beendigung des Inkubierungszeitraums wird das Mycel entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird untersucht.

In der Praxis

vierstufige Keimentwicklung. Das Näh Medium 1ü die Keimstufe kann irgend eine geeignete KombTat on von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein be "d ils weise eines der vorstehend beschriebenen Medien' b s" III. Der Keimkolben wird in einer bei konstanter Temperatur von etwa*28^cC gehaltenen Kammer 1 bis etwa 3 Tage geschürt, und'der erhaltene WuTh wird entweder zur Beinipfung einer zweiten Keim stufe oder des Produktioismediums verwendet Sl Zwischenstufen-Keimkolben verwendet werden wer den diese in praktisch d,r gleichen Weise emwicket ά. h., der Inhalt des Kolbens wird zur Beinmfune des so Produktionsmediums verwendet, die beimpften K₀U ben werden bei einer konstanten Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und nach Beendigung des S_erungszeitraumes wird der Inhalt der Kolben zur Entfernung des Mycels zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit oder Brühe wird dann konzentriert _u"nd unter Erhalt des Antibiotikums 842 A SSt

Beim Arbeiten in groß .rem Maßstab wird Is bevorzugt, die Fermentation h geeigneten Tanks durch^uführen, die mit einem Rührwerk und einer Einrichtung zur Belüftung des Ferraentalionsmediums versS sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Temperatüren bis zu etwa 12O⁰C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit der Produktionskultur beimpft, und man läßt die Fermentation einige

Tage, beispielsweise 2 bis 4 Tage, fortschreiten, während das N_äh_rmed_ium b₅„e_E, „„d,od„

Zubereitungen enthalten je Einheitsdosierung, gleich ob flüssig oder fest, im allgemeinen etwa 15 bis etwa 700 mg aktivem Bestandteil, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen, bevorzuct 80 bis 320 mg.

Eine Schwierigkeit bei der Anwendung der Antini,!^ ict η;» Empfindlichkeit der meisten Antibiotika zymatischem Abbau. Beispielsweise ist virksam gegen zahlreiche grampositive gramnegative Mikroorganismen, jedoch wird es in Gegenwart von Penicillinase zu einer Form abgebaut, die gegenüber den meisten pathogenen Erregern unwirksam ist.

Beständigkeit gegenüber Pevon Cephalosporinasen ange-1 nur mäßig wirksam, Anti-

... — nur beständig geeenüber Pe-

mciUinase, sondern gleichfalls gegenüber den Cephalosporinasen.

842 A hat in vielen Fällen eine größere gegenüber gramnegativen Mikroorgaals Cephalosporin C, Cephaloridin und Ce- - . '· ^Zu den gramnegativen Bakterien gehören: tscherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Salmonella schottmuelleri, Klebpneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B und

SÄST,?

durch etnJ I ■ ^{842A Zeichnet SiCh} *^uQeTdem _t Sw?. -If""⁸* ^T<>xizität aus und erzeugt

VerabreTchT '" J"' ^{Innerhalb VO}" ⁶ ^"^l" T
^Verabreichung ^s'"d etwa 100 % im Urin ausgeschieden.

Beispiel 1
Antibiotikum 842 A
^{Slufe A:} Schüttelkolben-Produktion

net. Das Röhrchen wurde dann zum Beimpfen eines mit Unterteilungen versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Kolbcns verwendet, der 50 ml Nährmedium V enthielt, indem das Röhrchen in steriler Gaze zerbrochen wurde und der Klumpen aseptisch in den Kolben überführt wurde. Das Medium V besaß die folgende Zusammensetzung:

Medium V

Hefe-Autolysat 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer*) 2,0 ml

MgSO₄ · 7 H„O 0,05 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 6,5

brauchte Lösung wurde in 500-ml-Fraktionen gesammelt. Die Harzkolonne wurde mit Wasser gewaschen und mit 3"„igem NH₁CI in 90"tigern Methanol eluiert. Das Eluat wurde in 100-ml-Fraktionen gesammelt.

Scheiben-Plattenversuche gegen Vibrio percolans (MB-1272) wurden bei sämtlichen Fraktionen durchgeführt; die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

♦) Phospl.-.pufTer:

KH₂PO₄

Na₂HPO₁

Destilliertes Wasser

91,0 g

95,0 g

1000,0 ml

Dieser Keimkoiben wurde bei 28 C auf einem Rotationsschüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm 3 Tage geschüttelt. Aliquote Mengen von 5 mi vl0% Inoculum) dieses Wuchses wurden dann unter Verwendung steriler Pipetten in vier Keimkolben der zweiten Stufe von der gleichen Größe überbracht, welche das gleiche Medium wie vorstehend beschrieben enthielten, und diese Kolben wurden dann in der oben angegebenen Weise geschüttelt. Die Keimkolben der zweiten Stufe wurden dann in einen Kolben aseptisch zusammengegeben und zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 350 ml Medium IX mit 2 bis 3% Inoculum enthielten, unter Verwendung steriler Pipetten beimpft. Das Medium IX hatte die folgende Zusammensetzung:

Medium IX

Autolysierte Brauereihefe 10,0 g

Lösliche Brauereirückstände 20,0 g

Dextrose 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml

pH 7,0

Die Produktionskolben wurden dann bei 28° C auf einem Schüttler bei 145 Upm mit einem Hub von 5 cm 4 Tage geschüttelt. Nach Beendigung des Inkubierungszeitraums wurde der Inhalt von 10 derartigen Kolben vereinigt, und eine Probe wurde zur Entfernung des Mycels zentrifugiert.

Das Vorhandensein des Antibiotikums 842 A in der Brühe wurde durch Agar-Diffusionsversuche bestimmt, die mit 13-mm-Filterpapierscheiben durchgeführt wurden, weiche in der Brühe getränkt wurden und auf die Oberfläche der Versuchsplatten gebracht wurden, die 10 ml Medium aus N"hragar plus 0,2% Hefeextrakt enthielten, und mit dem Bakterieninoculum geimpft war. Die Inhibierungszonen wurden nach Übernacht-Inkubierung bei 28°C in mm gemessen. Die Untersuchungen der nach 4tägiger Fermentation gesammelten Brühe zeigte eine Inhibierungszone von 31,5 mm Durchmesser auf mit Vibrio percolans (MB-1272) beimpften Platten.

Stufe B: Adsorption an ein Anionenaustauschharz

Die filtrierte Brühe wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 7,0 eingestellt, und 2900 ml wurden auf 100 ml eines starkbasischen Anionenaustauschharzes mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Chloridzyklus) bei 10 ml/min, adsorbiert. Die ver-

Filtriert	5 Brühe	Verbrauchte Fraktion	Zonen- größe	Eluatfraktion	Zonen größe
Ver dünnung	Zonen größe mm	Fraktion	0	Fraktion	25
keine	26,5	1.	16	1.	29
1 :2	24	2.	23	2.	29
1:4	20	3.	25	3.	26,5
		4.	27	4.	22
		5.	27	5.	18
		6.		6.	15
				7.	0
			8 bis 10.

Diese Versuche zeigen, daß etwa 60% der Wirksamkeit in der verbrauchten Fraktion und etwa 18% in den Eluaten vorliegen. Ferner zeigen sie an, daß die Harzkapazität lediglich zwei Fraktionen oder 10 Säulenvolumen Brühe beträgt. Die Eluatfraktionen 1 bis 4 wurden kombiniert und unter Entfernen des Methanols konzentriert. Die verbrauchten Fraktionen 3 bis 6 wurden unter Erzielung von 1960 ml Lösung kombiniert. Ein 1860-ml-Anteil der Lösung wurde mit verdünntem Natriumhydroxid von pH 7,2 auf 8,0 eingestellt und an ein starkbasisches Anionenaustauschharz mit einer Styrol-Divinylbenzcl-Matrix (Chloridzyklus) bei 14 ml/min, adsorbiert. Die verbrauchte Lösung wurde in vier gleichen Fraktionen gesammelt.

und Versuche ergaben, das 5 % der Wirksamkeit vorlag. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und mit 5%igem, wäßrigem Natriumchlorid eluiert. Da: Eluat wurde in 50-ml-Fraktionen gesammelt unc untersucht. Die Untersuchungen zeigten, daß 90°; der Wirksamkeit in den Schnitten 3 bis 16 vorlag so diese kombiniert wurden.

Stufe C: Adsorption an ein Kationenaustauschharz

Ein 50-ml-Anteil eines gemäß Stufe B hergestellter Konzentrats, wurde auf 500 ml verdünnt, der pH Wert von 8,8 auf 2,0 mit verdünnter Salzsäure einge stellt und an 25 ml eines starksauren Kationenaus tauschharzes vom Sulfonat-Typ mit einer Styrol Divinylbenzol-Matrix (Wasserstoffzyklus) bei 2,5 ml min adsorbiert. Die Kolonne wurde mit 25 ml Wasse gewaschen, dann mit 2%igem Pyridin eluiert, bis de pH-Wert des Kolonnenauslaufs auf 7 anstieg (54 ml) Untersuchungen der verbrauchten Fraktionen um des Eluats zeigten 9% der Wirksamkeit in der ver brauchten Fraktion und 90% im Eluat an. Das Elua wurde als das Pyridiniumsalz des Antibiotikums 842/ identifiziert.

Das Produkt ist amphoter mit einem scheinbare] isoelektrischen Punkt bei etwa pH 3,5. Das Produk ist oberhalb pH 7 instabil, jedoch bei pH 1,5 stabil Das so erhaltene Eluat wurde auf pH 8,0 mit verdünn ter Natriumhydroxidlösung eingestellt und unter Va kuum zur Entfernung des Pyridins konzentriert. Da

13 14

so erhaltene Produkt wurde als das Mononatriumsalz men zu verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen um. des Antibiotikums 842 A identifiziert. Das Molekular- die Wirksamkeit durch Scheibcn-PlaUenversuche er gewicht beträgt 468, bezogen auf die empirische Formel. mittell. Die Fermentationsbrühe wurde dann durcl

Diatomeenerde bei einem pH-Wert von 7,8 filtriert Analyse für Ci₆H₂IN₄MJ₈Na: _{5 und das s0 cr}h_a|_tene Produkt wurde als 842A identi

Berechnet C 41,0%; H 4,5%; N 12,0%; fiziert. Scheiben-Plattenversuche einer 1 : 10-Verdiin-

S 6,8%; 0 30,8%; Na 4,9%; nung ergaben eine Inhibierungszonc von 21,5 mir

gefunden C 39,31%; H 4,76%; N 11,16%; gegen Vibrio percolans (MB-1272).

S 6,46%; 0 34,12%; Na 4,19%.

„.... ¹⁰ Beispiel3

B eιs ρ ie I 2

Antibiotikum 842A Mononatriumsalz der 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvalcr-

amido)-3-(carbamoyIoxymethyl)-

Stufe 1: Ein lyophilisiertes Röhrchen von Strepto- 7-methoxy-3-cephcm-4-carbonsäure

myces lactamdurans Kultur (MA-2908) wurde zur Be- . „,,,,·,-

impfung von 50 ml sterilem Medium V in einem unter- ^1J Adsorption an Kohle: V.er hermenlaiionsansatze, die

teilten 200-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet. gemäß Beispiel 1 gewonnen wurden, wurden jeweils

an 100 ml eines starkbasischen Anioncnaustausch-

Medium V harzes mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Chlorid-

,_ΛΓ) zyklus) adsorbiert und mit 1 %igem, wäßrigem Na-

Hefe-Autolysat ιυ,υ g ,_{0 lriumcn}i_{orid e}luiert. Das Eluat wurde in 50-ml-Frak-

Glucose . g tionen cesammclt und untersucht. Eluatfraklionen

Phosphatpuffer ) -,u mi _{yon sämt}|_{jchell vjer Ansälzen wur}den auf einen pH-

MgSO_? · 7 H₂O mnn'fT ^§i ^{Wert von 5 mit} verdünnter Salzsäure eingestellt und

Destilliertes Wasser ΐυυυ,υ mi _{untef Erzie}, _{von 4300 m}, _{Losung vere}inigt. ₄₂oo ml

pH unter Verwendung von NaOH _{2J djeser L}„_{sung wurden mU 42 g Koh},_c ^ _{S[unde ge}

auf 6,5 eingestellt _{rührt Dje Koh},_{e wurde ablillriert und mit} Wasser

*) PhosphatpufTer: gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung zeigten

n^Hh"?A 95 0 g keine Aktivität. Der Kohlekuchen wurde zweimal mit

Destilliertes Wasser'^!'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. lOOoioml einer 1-Liter-Menge 60%igem, wäßrigem Aceton

3o eluiert, indem das Gemisch ¹J₂ Stunde gerührt und

Der beimpfte Kolben wurde auf einem Rotations- jeweils filtriert wurde. Die Eluate wurden unter Va-

schüttler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm ge- kuum auf 108 ml bzw. 100 ml konzentriert. Versuche

bracht und 72 Stunden bei 28 C inkubiert. zeigten, daß das erste Eluat 76% der Aktivität enthielt,

Stufe 2: Ein Inoculum von 10,0 ml des erhaltenen, 18mal so wirksam wie das Ausgangsmaterial war und

vegetativen Wuchses wurde dann zur Beimpfung eines 35 daß das zweite Eluat 17% der Wirksamkeit enthielt

unterteilten 2-Liter-Erlenmeyer-Kolbens, der 50 ml und 14mal so wirksam wie das Ausgangsmaterial war.

des oben beschriebenen sterilisierten Mediums V ent- Die beiden Konzentrate wurden vereinigt und weiter

hielt, verwendet. Der beimpfte Kolben wurde dann auf 61 ml konzentriert und von pH 4 auf pH 5 mit

auf einen Rotationsschüttler bei 220 Upm gebracht verdünnter Natriumhydroxidlösung eingestellt. Dieses

und 48 Stunden bei 28°C inkubiert. 4° Konzentrat enthielt 40 mg/ml trockene Feststoffe und

Stufe 3: Der Inhalt des Inoculum-Kolbens wurde ergab eine 25-mm-Zone gegen MB-1272 bei einer Vcr-

dann zur Beimpfung eines 190 1 rostfreien Fermenta- dünnung von 1 : 100 (400 mcg/ml). Das Produkt wurde

tionsbehälters, der 160 Liter des vorstehend beschrie- als das Mononatriumsalz der 7/HD-5-Amino-5-carb-

benen Mediums V enthielt, verwendet. Das beimpfte oxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-

Medium wurde bei 28°C 48 Stunden unter Bewegung 45 3-cephem-4-carbonsäure identifiziert,
inkubiert, während eine Luftströmung von 85 l/min

durch die Fermentationsbrühe beibehalten wurde. Beispiel 4

Während des Fermentationszeitraums wurden kleine .

Mengen Polypropylenglykol (MG 2000) zur Regelung Mononatriumsalz der 7/?-(D-5-Am.no-5-carboxyvaler-

der Schäumung zugegeben. So am.do)-3-(carbainoyloxymethyl)-

Stufe 4: Ein Inoculum von 43 Liter des erhaltenen 7-melhoxy-3-cephem-4-carbonsaure

Wuchses wurde dann zur Beimpfung eines 7501 Fer- Adsorption an Gel: Ein 22-ml-Anteil des oben

mentationsbehälters aus rostfreiem Stahl verwendet, gemäß Beispiel 1, Stufe B, erhaltenen Eluats wurde

der 467 Liter eines sterilen Mediums XI der folgenden mit verdünntem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert

Zusammensetzung enthielt: 55 von 7,0 eingestellt und auf einer 388 ml eines GeI-

. . mediums aus kugelförmigem Polyacrylamid, das mit

Medium Xl Methylen-bis-acrylamid versetzt ist, enthaltenden Ko-

Autolysierte Brauereihefe 10,0 g lonne chromatographiert. Die Kolonne wurde mit

Lösliche Brauereirückstände 20,0 g Wasser entwickelt, das ausströmende Gut mit einem

Destilliertes Wasser 1000,0 ml ^6o Differential-Refraktometer aufgezeichnet und 5-ml-

pH 7,0 Fraktionen automatisch gesammelt und biologisch

untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in den

Man ließ die Fermentation bei einer Temperatur Fraktionen 47 bis 63 auf, während Natriumchlorid in

von 28⁰C unter Bewegung fortschreiten, während eine den Fraktionen 62 bis 72 auftrat. Die Fraktionen 50

Luftströmung von 280 l/min während 72 Stunden bei- ⁶5 bis 60 wurden zusammengegeben, wieder untersucht

behalten wurde. Während der Fermentation wurde und zur Trockne eingeengt, wobei 10,8 mg Rückstand

ein Antischaummittel, Polypropylenglykol (MG 2000), erhalten wurden, der als das Mononatriumsalz der

in kleinen Mengen zugegeben, um übermäßiges Schau- 7/J-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyl-

15 16

oxymethyl^-methoxy-S-cephca-^-carboiissiureidenti- mungsmittel. Das Medium wird mit einer geringen

fiziert wurde. Nach Untersuchung mit Vibrio percoians Menge konzentrierter NaOH-Lösung auf einen pH-

ergab dieses Produkt eine 25-mm-Zone bei 8 mcg/ml. Wert von 7,0 eingestellt, in Erlenmeyer-Kolben ver-

1,0 g des so hergestellten Mononatriiumsalzes der teilt und 15 oder 20 Minuten bei 121"C autoklaviert.

T/J-iD-S-Amino-S-carboxyvaleramidoJ-S-icarbamoy!- 5 Nach Abkühlen erhielt das Medium ein 2,5%iges

oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wur- Inoculum der in Stufe B erhaltenen Keimkultur. Die

den in 20 ml 1 %igem, wäßrigem, n-Butaciol gelöst und Inkubationszeit kann zwischen etwa 50 Stunden und

auf eine Kolonne Chromatographien, die 2530 ml 100 Stunden variieren, jedoch wird ein Inkubations-

eines modifizierten Dextrangels in PerlenJ'orm enthielt. Zeitraum von etwa 72 Stunden bevorzugt. Das Vo-

Die Kolonne wurde mit 1 %igem, wäßrigem n-Butanol io lumen des Mediums in jedem Kolben kann zwischen

bei 10 ml/min entwickelt, und 10,5-ml-Fraktionen 30 und 50 ml variieren, jedoch wurden routinemäßig

wurden automatisch gesammelt. Die ausströmende 40 ml verwendet. Das Ausmaß an Inoculum kann

Flüssigkeit wurde mit einem Registrier-Refraktometer zwischen 1 bis 5% variieren, jedoch wird in der Praxis

aufgezeichnet, und die Fraktionen wurden biologisch im allgemeinen ein Betrag von 2,5% verwendet,

untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in den 15 „ . ,^ ,, ,

Fraktionen 99 bis 122 auf, und diese wurden zusam- ^{Slufe D:} Untersuchung

mengegeben und zur Trockene eingeengt, wobei Nach beendeter Fermentation wurden die Zellen 670 mg Produkt erhalten wurden, das vorwiegend das abzentrifugiert und die Brühe mit Phosphatpuffer, Mononatriumsalz der 7/9-(D-5-Amino-5-carboxyvaler- pH-Wert 7,0, verdünnt. Die Konzentration an 7/J-(D-amido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-20 S-Amino-S-carboxyvaleramidoJ-S-icarbamoyloxyme-4-carbonsäure enthielt. thyl)-7-methoxy-3-ce|)hem-4-carbonsäure in der Fer-Die Kolonne wurde anschließend durch Chromato- mentationsbrühe wurde nach der biologischen Stangraphie auf einem Gemisch von Dextran und Natrium- dard-Scheiben-Untersuchungsmethode bestimmt. Der Chlorid unter identischen Bedingungen geeicht. Dex- verwendete Untersuchungsorganismus war Vibrio trän wurde in den Fraktionen 85 bis 93 und Natrium- 25 percoians (ATCC 8461). Filterpapierscheiben werden chlorid in den Fraktionen 140 bis 155 ermittelt, was in die verdünnten Brühen eingetaucht und auf die anzeigt, daß das biologisch-wirksame Produkt von Oberfläche von Agar enthaltenden Petri-Schalen geVerunreinigungen dieser Art abgetrennt werden kann. bracht, die mit dem Versuchsorganismus Vibrio per-. . colans inokuliert worden waren. Auch wurden auf B e 1 s ρ 1 e 1 5 _Jo ^\_ese p_etri-Schalen Scheiben gebracht, die vorher in 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyv!ileramido)-3-(carbamoyl- Standardlösungen getaucht worden waren, welche oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure bekannte Konzentrationen an 842A enthielten. Die , .. Scheiben wurden über Nacht bei 28°C inkubiert und Mute A: Schragkulturen _{die Durchm}esser der Inhibierungszonen aufgezeichnet. Ein lyophilisiertes Röhrchen von Streptomyces- 35 DieKonzentrationenan842AinderfermentiertenBrühe lactamdurans-Kultur (MA-2908) wurde aseptisch ge- werden durch Interpolieren aus der Standardkurve öffnet und der Organismus in ein Medium der folgen- erhalten, die Zonendurchmesser mit den bekannten den Zusammensetzung überführt: Konzentrationen der 842A-Standardlösungen in Be-

ziehung setzen. Nach diesem Verfahren wurde beMedium XlI 40 rechnet, daß Streptomyces lactamdurans MB-2908 1 /„ Restmelasse, 78,6 μg/ml 842 A in dem modifizierten Fermentations-1 % Brauereihefe, verfahren erzeugte. 2,5% Agar pH 7,0,
Wasser zur Auffüllung des Volumens. Beispiele

\5 für pharmazeutische Zubereitungen

Die Schragkulturen wurden 7 Tage bei 28°C inku- a) Trockengefüllte Kapsel

biert. Wenn sie in der Kälte gelagert wurden, waren ^Je Kapsel

die Schragkulturen mehr als 13 Wochen stabil. Antibiotikum 842 A 40 mg

Stufe B: Keimstufen: Zweistufiges System _Jo Ma'gnSiumstearat"".'.".'.".".'.'.'.'.'.'.".'.'. ^ mg

Erste Keimung: Die erste Keimkultur wird direkt _{145 mg}

aus der Schrägkultur der Stufe A zu 40 ml 1 %iger

primärer, getrockneter Hefe, pH-Wert 7,0 in einen Das Antibiotikum 842 A wird auf ein Pulver einer

unterteilten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft. Korngröße entsprechend einem Siebdurchgang durch Die Kolben wurden dann auf einem Rotationsschütt- 55 ein Sieb mit 0,25 mm zerkleinert und dann werden ler bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm bei 28°C Lactose und Magnesiumslearat durch ein Siebtuch währendeines Zeitraums von 2 bis 3 Tagen geschüttelt. mit 0,25 mm lichter Maschenweite auf das Pulver Zweite Keimung: Ein 2,5%iges Inoculum aus der gegeben, und die vereinigten Bestandteile werden ersten Keimstufe wurde in einen Kolben gegeben, der 10 Minuten vermischt und dann in Gelatine-Kapseln ein 2 %iges Hefeautolysat, pH-Wert 7,0, enthielt. Der 60 eingefüllt. Wuchs in dieser Stufe ist in charakteristischer Weise b) Tabletten

hell, und die Inkubierung, die wie in der eisten Stufe Je Tablette

erfolgte, wurde nicht über 48 Stunden ausgedehnt. 7/J-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-

amido)-3-(carbamoyloxymethyl)-Stufe C: Produktionsmedium S₅ 7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure 125 mg

Das Produktionsmedium enthielt je Liter destilliertes Maisstärke, U.S.P 6 mg

Wasser: 30 g lösliche Brauereirücksl.ände, 7,5 g pri- Dicalciumphosphat 192 mg

märe, getrocknete Hefe und 0,25% V/V Entschäu- Lactose, U.S.P 190 mg

17 18

Der aktive Bestandteil wird mit dem Dicalcium- mit einem Durchmesser von etwa 13 mm. die je 800 mg

phosphat und der Lactose uid etwa der Hälfte der wiegen, verpreßt.

Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird dann mit c) Parenterale Lösung

einer 15%igen Maisstärkepaste (6 mg) granuliert und Je Ampulle

grobgesiebt. Es wird bei 45°C getrocknet und durch 5 7/S-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-

Sicbe mit 1,2 mm lichte Maschenweite gesiebt. Der amido)-3-(carbamoyloxymethyl)-

Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat 7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure 170 ..g

werden zugegeben, und das Gemisch wird zu Tabletten Steriles Wasser für die Injektion ... 2 cm³

Claims

Patentansprüche:

1.7/S-(D-S-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(c-arbamoyloxymethyO^-methoxyO-cephem-^carbonsäure und deren Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lactamdurans NRLL 3802 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, die Verbindung gemäß Anspruch 1 an einem Ionenaustauscherharz isoliert und gewünschtenfalls in ein Salz überfuhrt.

3. Arzneimittel, bestehend aus der ^-rbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Hüf- und/oder Trägerstoffen.