DE1492111C - Verfahren zur Herstellung von Poly oxm A und B - Google Patents

Description

durch Züchten eines Bakterienstamms in einem Kulturmedium bei einer Temperatur von 25 bis 35° C, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterienstamm den Stamm ATCC Nr. 19093 oder 19094 verwendet und das Reaktionsgemisch in an sich bekannter Weise aufarbeitet.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur 30 durch Züchten eines Bakterienstamms in einem KuI-Herstellung der Antibiotika Polyoxin A und Poly- turmedium bei-einer Temperatur von 25 bis 35° C,

dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterienstamm den Stamm ATCC Nr. 19 093 oder 19 094 verwendet und das Reaktionsgemisch in an sich be-35 kannter Weise aufarbeitet.
CH₂OH Die Eigenschaften der Stämme ATCC 19 093 und

oxin B mit den folgenden Formeln:

CH,-CH

CH₇OH

ATCC 19 094, die die Polyoxine A und B erzeugen, sind folgende:

1. Mikroskopische Untersuchung

Das Wachstum ist gut von 20 bis 32° C.

Das Luftmycel ist monopodisch verzweigt auf synthetischem Agar und proteinhaltigen Agarmedien. Die Sporophoren bilden offene Spiralen und keine Quirle. Form und Größe der Sporen sind asymmetrisch stabähnlich (1,5 bis 1,8 μ χ 0,5 bis 0,7 μ) und oval (1,2 bis 1,0 μ χ 1,0 bis 0,7 μ), und die Oberfläche ist glatt.

2. Kultureigenschaften

1. Czapek-Agar27°C,ATCC19 093:

Gutes Wachstum in farblos oder Weißbraun, Bildung von reichlichem Luftmycel, das pulvrig ist und sich von Weiß bis Rauchgrau ändert.

Die Rückseite ist blaßolivgrau ohne lösliches

Pigment. ATCC 19 094:
bildet Luftmycel, das pulvrig ist und sich von Weiß bis Erdbraun ändert. Die Rückseite ist gelbstichigblaßbraun.

2. Glycerin-Czapek-Agar 27° C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum, blaßolivbraun. Es wird keines oder spärliches dünnweißes Luftmycel gebildet.

Die Rückseite ist blaßolivbraun oder cremefarbig ohne lösliches Pigment.
ATCC 19 094:

Es wird kein Luftmycel gebildet, im übrigen gleich ATCC 19 093.

3. Nähragar 27° C, ATCC 19 093:

Gutes Wachstum, gewinkelt, rauchgrau, spärliches Luftmycel mit Änderung von Weiß zu Blaßgrau; die Rückseite hat schwachbraungelbliche Farbe und ergibt ein braunes lösliches Pigment.

ATCC 19 094:

Wachstum wie ATCC 19 093, Bildung von sehr _w spärlichem Luftmycel mit Weiß bis Weißlichgrau, lösliches Pigment geringer als bei ATCC 19 093.

4. Glukose-Pepton-Agar 27⁰C₁ATCC 19 093:
Wachstum cremefarbig bis blaßgräulicholiv, keines oder spärliches weißgraues Luftmycel wird gebildet. Die Rückseite ist blaßbraun und bildet ein hellbraunes lösliches Pigment.

ATCC 19 094:

Wachstum spärlich und schwache Bildung von weißem oder blaßgrauem Luftmycel im späteren Zeitraum der Kultur. Die Rückseite ist olivbraun.

5. Glukose-Asparagm-Agar27°C,ATCC 19 093:
Wachstum gewinkelt und Änderung von Weiß bis Kupferbraun, Bildung von Luftmycel mit Weiß bis Blaßgrau oder Grau. Die Rückseite ist kupferbraun und ergibt kein lösliches Pigment. ATCC 19 094:

Sehr wenig Luftmycel, bisweilen wird weißgraues Luftmycel gebildet.

6. Stärke-Agar 27° C, ATCC 19 093: Gutes Wachstum, farblos oder olivbraun, Bildung von reichlich pulvrigem, blaßmausgrauem Luftmycel. Die Rückseite ist olivgelb und ergibt kein lösliches Pigment. Die Hydrolysierungsaktivität für Stärke ist wie üblich. ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

7. Calcium-Malat-Agar 27° C, ATCC 19 093:
Wachstum farblos oder blaßbraun und gelb, Bildung von reichlich mausgrauem Luftmycel. Die Rückseite ist cremegelb und bildet bisweilen schwachgelblichbraunes lösliches Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

8. Tyrosin-Agar 27° C, ATCC 19 093:
Spärliches Wachstum, braun, keine Bildung von Luftmycel. Die. Rückseite ist cremefarbig und gibt kein lösliches Pigment.

ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

9. Ei-Albumin-Agar 27⁰C, ATCC 19 093:

Gutes Wachstum, farblos bis Weiß, keine Bildung von Luftmycel, bisweilen jedoch sehr wenig weißes Luftmycel im späteren Zeitraum der Kultur. Die Rückseite ist weiß, ergibt kein lösliches Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

10. Hafermehl-Agar-Kulturmedium 27°C, ATCC 19 093:

Wachstum olivbraun, Bildung von etwas blaßgrauem Luftmycel, bisweilen keine Bildung desselben. Die Rückseite ist farblos und ergibt kein lösliches Pigment.

ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

11. Kartoffelschnitt 27⁰C, ATCC 19 093:

Gutes Wachstum, dunkelolivbraun, Bildung von blaßgrauem Luftmycel. Das Medium ändert sich zu Blaßrauchgrau.

ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

12. Gelatinestab 18⁰C, ATCC 19 093:

Gutes Wachstum, geringfügige Gelatineverflüssigung, Erzeugung eines geringfügig dunkelbraunen löslichen Pigmentes.
ATCC 19 094: gibt kaum Gelatineverflüssigung.

13. Glukosebrühe 27⁰C, ATCC 19 093:

Gutes Wachstum auf der Oberfläche und innerhalb der Lösung, Erzeugung eines löslichen braunen Pigments.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.

14. Czapek-Lösung 27° C, ATCC 19 093:

Gutes Wachstum auf der Oberfläche und am Boden der Lösung, Bildung einer dünrten Membran auf der Oberfläche und etwas weißen Luftmycels. Keine Erzeugung löslichen Pigmentes.
ATCC 19 094: bildet keine Membran an der Oberfläche.

15. Melaninbildung:

Sowohl ATCC 19 093 als auch ATCC 19 094 sind negativ.

16. Nitratreduktion:

Sowohl ATCC 19 093 als auch ATCC 19 094 sind schwach positiv.

17. Cellulose-Kulturmedium:

Kein Wachstum in einer synthetischen Kulturlösung, die Cellulose als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

18. Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Nach der Metholde von A. G. B1 i d u m unter Verwendung der folgenden Kohlenstoffquellen:

ATCC 19 093

ATCC 19 094

Glukose + + + + + +

Rohrzucker + + + + + +

Stärke '. + + + + + +

Lactose ++ + + +

Fructose 4- + +

Maltose + + + + + +

Inulin + + + + + +

Inosit ' ++ + + +

Raffinose + + + + + +

Arabinose + +

Galactose + + +

Xylose + +

+ + + Gutes Wachstum.
+ + Mittleres Wachstum.
+ Spärliches Wachstum.

Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten verschiedenen Eigenschaften der Mikroorganismen ATCC 19 093 und 19 094 dürfte angenommen werden, daß sie zur Gruppe Streptomyces griseus gehören.

Gemäß der Erfindung kann die Fermentierung gemäß den üblichen Fermentierungsverfahren für übliche Actinomyceten ausgeführt werden. Allgemein ausgedrückt, werden Stärke, Dextrin, Glukose, Glycerin, Maltose und Fructose als Kohlenstoffquelle verwendet. Fleischextrakte, Pepton; Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl und Hefe werden als Stickstoffquelle verwendet. Anorganische Stoffe, beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und andere Phosphate, werden zu dem nahezu neutralen flüssigen Kulturmedium zugegeben. Das Medium wird mit

dem Stamme inokuliert und unter Rühren bei 25 bis 35° C kultiviert. Im allgemeinen erreicht die Konzentration der erzeugten Antibiotika das Maximum zwischen 40- und lOOstündiger Kultivierung. Da diese Zeit entsprechend der Belüftung und den Rührbedingungen trotz Anwendung der gleichen Temperatur und eines Kulturmediums aus den selben Bestandteilen variieren kann, ist es ratsam sie durch Ermittlung der Wirksamkeit in jedem Fall zu bestimmen.

Allgemein bekannte physikalisch-chemische Verfahren können angewandt werden, um die Antibiotika aus der Kulturbrühe zu isolieren. Beispielsweise wird zuerst das Mycel durch Filtration unter Zugabe von Filterhilfe, beispielsweise saurer oder neutraler Diatomeenerde, entfernt, und das Filtrat wird auf Aktivkohle bei saurem oder neutralem pH-Wert adsorbiert. Die Antibiotika können durch geeignete Lösungsmittel, beispielsweise wäßriges Methanol oder wäßriges Aceton, eluiert werden. Da die Polyoxine amphotere Verbindungen sind, werden sie auf Kationen- oder Anionenaustauschharzen adsorbiert und lassen sich durch geeignete Säure-, Alkalioder Salzlösungen eluieren. Beispielsweise wird das angesäuerte Kulturfiltrat durch eine Kolonne mit stark saurem Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps mit 8% Vernetzung gegeben, und die adsorbierten Polyoxine können durch eine wäßrige Lösung mit 5% Natriumchlorid oder mit einem Phosphatpuffer von pH 4,3 eluiert werden. Das Rohpulver des auf diese Weise erhaltenen Polyoxinkomplexes kann durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschern, beispielsweise Ionenaustauscher eines sulfoäthylierten vernetzten Dextrans, Sulfoäthylcellulose oder Sulfomethylcellulose, isoliert werden oder durch Verfahren, der Zonenelektrophorese.

Die vollständige Trennung der Polyoxine A und B wird durch Verteilungschromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver oder Silikatgel durchgeführt. Es kann durch ein geeignetes Lösungsmittel, beispielsweise das Lösungssystem aus Butanol, Essigsäure und Wasser, entwickelt werden. Polyoxin A wird zuerst eluiert, worauf dann Polyoxin B eluiert wird. Bequemer ist die Trennung von A und B auch möglich durch wiederholte Umkristallisation aus einem wäßrigen Lösungsmittel unter Anwendung von fraktionierten Kristallisationsverfahren.

Durch Umkristallisation aus wäßrigem Alkohol wird Polyoxin A als farblose Nadeln und Polyoxin B als kristallines Pulver erhalten. Die physikalischchemischen Eigenschaften der Polyoxine A und B sind wie folgt:

1. Zersetzungspunkte

Weder Polyoxin A, das nachfolgend als A bezeichnet wird, noch Polyoxin B, das nachfolgend als B bezeichnet wird, zeigen klare Zersetzungspunkte; A zersetzt sich allmählich ohne Schmelzen oberhalb 180° C, während B sich oberhalb 16O⁰C zersetzt.

60

2. Analytische Elementarwerte

Sowohl A als auch B enthalten Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff.

A: C 44,42, H 5,10, N 13,81;
B: C 40,18, H 4,87, N 13,50.

3. Molekulargewicht

Da A und B amphotere Verbindungen sind, wurden die Äquivalentgewichte nach dem Titrierverfahren bestimmt:

A: 623, B: 507.

Die Molekulargewichtsbestimmung nach der Methode B a r y e r ergab die Werte von 560 bis 770 für A und von 420 bis 560 für B.

4. Molekularformeln

A: C₂₃H₃₂N₆O₁₄;
B: C₁₇H₂₅N₅O₁₃.

5. Molekularformeln und berechnete Werte für Molekulargewichte und -elemente

A: berechnet für C₂₃H₃₂N₆O₁₄. Molekulargewicht 616,53:

C 44,80, H 5,19, N 13,63.

B: berechnet für C₁₇H₂₅N₅O₁₃. Molekulargewicht 507,31:

C 40,25, H 4,97, N 13,80.

6. Chemische Strukturen A und B haben folgende Strukturen:

COOH

A.
CH₃-CH

CH, OH

HOCH

CH₇OCONH,

HOOC O
HN CH /O

CH₂OH

HOCH

OH

CH₂OCONH₂

Wie in den obigen Strukturen gezeigt, wird beobachtet, daß sowohl A als auch B eine große Ähnlichkeit in ihren chemischen Strukturen aufweisen.

7. Spezifische Drehungen

A: [α]? = -32°, (C = 1, in Wasser);
B: [a]₀ ² = +34°, (C = 1, in Wasser).

8. Ultraviolett-Absorptionsspektren

Die Spektren für A sind in F i g. 1, für B in F i g. 2 gezeigt. Die Maxima liegen wie folgt:

0,05n-HCl

max

0,05n-NaOH

max

0,05n-HCl

= 262 πΐμ (EJi 142),
= 264πΐμ(Ε1* 103),
= 262 ηΐμ (Ε}£ 172),
= 264 πΐμ (EJ *_m 130).

9. Infrarot-Absorptionsspektren

naria kikuchiana, Alternaria mali, Diaporthe citri, Gloeosporium laeticolor, Glomerella cingulata, Colletorichum lagenasium, Cladosporium cucumerinum, Cladosporium fulvum, Fusarium oxysporum, Cercoopora biticola, Cuignardia laricina, Corticium rolfsii u. dgl.

Die Polyoxine A und B ergaben beträchtliche Vorbeugungs- und Heilwirkungen in Gewächshausversuchen, so daß sie eine erhebliche Bedeutung in der praktischen Verwendung besitzen.

Die Infrarot-Absorptionsspektren für A und B sind in den F i g. 3 bzw. 4 gezeigt, die in Kaliumbromidtabletten bestimmt wurden. Die Hauptabsorption tritt bei folgenden Wellenlängen auf:

A: 3400, 1677, 1623, 1459, 1366, 1280, 1250, 1115, 1046,773 cm-¹;

B: 3365, 1675, 1601, 1465, 1390, 1338, 1277, 1130, 1050,784 cm-¹.

10. Rf-Werte

Die Rf-Werte des Lösungsmittelsystems, die durch Entwicklung mit Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2) unter Verwendung des Filterpapiers Nr. 51 (Toyo Roshi Co.) bestimmt wurden, sind wie folgt:

A: 0,28, B: 0,15.

30

11. Löslichkeiten

35

Sowohl A als auch B sind in Wasser leicht löslich, jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Benzol und Äther.

12. Farbreaktionen

Sowohl A als auch B geben positive Ninhydrin-,

Diazo- und Tollenreaktionen, sind jedoch negativ bei den Fehling-, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-, Molish-, Ferrichlorid-, Natriumnitroprussid- und Sakaguchi-• Versuchen.

13. pka-Werte

Sowohl A als auch B sind amphotere Verbindungen und haben drei titrierbare Gruppen. Die pka-Werte sind wie folgt:

A: 3,0, 7,3, 9,6;
B: 3,0, 6,9, 9,4.

14. Stabilitäten

Sowohl A als auch B sind in alkalischer Lösung etwas unstabil, jedoch äußerst stabil in saurer oder neutraler Lösung. Es tritt keine Zersetzung beim Erhitzen auf 100⁰C während 15 Minuten innerhalb eines pH-Bereiches von 1,0 bis 8,0 auf. Sowohl A als auch B sind gegenüber Bestrahlung mit Ultraviolettlicht beständig. Sie behalten ihre Aktivitäten bei, falls die Lösungen 30 cm unter 20-W-Lampen gestellt werden und 24 Stunden bestrahlt werden.

Die biologischen Aktivitäten der Polyoxine A und B sind wie folgt:

1. Antimikrobielle Werte

Wie in der folgenden Tabelle gezeigt, zeigen sowohl A als auch B spezifische Aktivitäten gegenüber phytopathogenen Fungi, nämlich Pellicularia sasakii, Chochliobolus miyabeanus, Pellicularia oryzae, Alter-

	Minimale	A	B
	Hemmkonzentration	1,56	1,56
Untersuchte Organismen	Mcg/ml	1,56	6,25
	12,5	0,2
Alternaria kikuchiana	3,12	6,25
Cochliobolus miyabeanus ..	1	1
Pellicularia sasakii	10	10
Piricularia oryzae	100 <	10
Alternaria mali	10	10
Diaporthe citri	100 <	10
Gloeosporium laeticolor....	1	0,1
Glomerella cingulata	1	0,1
Colletorichum lagenarium ..	100 <	100 <
Cladosporium cucumerinum	10	10
Cladosporium fulvum	0,1	0,1
Fusarium oxysporum	10	10
Cercospora beticola	>50	>50
Cuignaria laricina	>50	>50
Corticium rolfsii	>50	>50
Trichophyton asteroides....	>50	>50
Trichophyton interdigitalis .	>50	>50
Trichophyton rubrum	>50	>50
Candida albicans	>50	>50
Candida tropicalis	>50	>50
Candida crusei	>50	>50
Cryptococcus neoformans ..	>50	>50
Aspergillus fumigatus	>50	>50
Aspergillus terreus	>50	>50
Mucor racemosus	>50	>50
Nocardia asteroides	>50	>50
Trichomonas vaginalis	>50	>50
Staphylococcus aureus 209 ρ	>50	>50
Micrococcus luteus	>50	>50
Bacillus subtilis	>50	>50
Mycobacterium smegmatis .	>50	>50
Mycobacterium 607	>50	>50
Mycobacterium phlei	>50	>50
Mycobacterium BCG	>50	>50
Escherichia coli	>50	>50
Pseudomonas aeruginosa ...	>50	>50
Serratia marscens
Proteus vulgaris
Xanthomonas cryzae

2. Toxizitäten ·

Jeweils 800 mg/kg von Polyoxinen A und B wurden intravenös an Mäusen injiziert. Es ergab sich kein

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Anzeichen der Toxizität. Wenn die physikalischchemischen und biologischen Eigenschaften von PoIyoxinenA und B mit anderen bisher beschriebenen Antibiotika verglichen werden, zeigt sich, daß sie neue Antibiotika sind.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung.

Beispiel 1

Fermentierungsverfahren
Zusammensetzung des Kulturmediums

Glukose 15g

Glycerin 10 g

Sojabohnenmehl 15g

Ammoniumsulfat 5 g

Getrocknete Hefe 5 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 4 g

Wasser 1000 ml

Der pH-Wert wurde auf 7,6 eingestellt und die Sterilisierung bei 120⁰C während 20 Minuten ausgeführt.

ATCC 19 093 wurde darin inokuliert und bei 27⁰C unter Rühren so lange fermentiert, bis maximale Aktivität erhalten wurde. Die Versuche wurden unter Verwendung von Alternaria kikuchiana und Cochliobulus miyabeanus als Testorganismen ausgeführt. Wenn der Stamm ATCC 19 093 in einem 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Inhalt von 70 mm Medium einer Schüttelkultur unterworfen wurde, erreichte die Aktivität das Maximum nach 72 bis 96 Stunden. Wenn die 48 Stunden alte Schüttelkultur-Brühe in einen Fermentierungstank mit einem Inhalt von 4001 desselben Mediums inokuliert wurde und die Fermentierung unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdrehungen je Minute und einer Belüftung mit 4001 Luft je Minute ausgeführt wurde, erreicht die Erzeugung des Antibiotikas ihr Maximum nach 72stündiger Fermentierung.

Isolierung und Reinigung

4301 der fertigen Brühe wurden auf pH 2,0 mit 10%iger Salzsäure angesäuert und auf 70° C erhitzt, worauf 9 kg Diatomeenerde zugegeben wurden und durch eine Filterpresse filtriert wurde. Das Filtrat wurde mit 8 kg Aktivkohle und 8 kg Diatomeenerde versetzt, gerührt und filtriert. Die Aktivkohle wurde mit 3501 Wasser gewaschen. Die aktiven Bestandteile wurden zweimal mit 1001 eines 60%igen Acetons eluiert. Die eluierte Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Dabei wurden 41 der aktiven Substanz enthaltendes Wasser erhalten.

501 Aceton wurden hierzu zugefügt und der erhaltene Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 644 g eines braunen Rohpulvers erhalten wurden. 370 g dieses Pulvers wurden in Wasser gelöst und auf pH 2,0 angesäuert. Die Lösung wurde durch eine mit 4,5 1 stark saurem Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps mit 8% Vernetzung (50 bis 100 Maschen, H-Form) gepackten Kolonne gegeben. Nach Waschen mit Wasser wurden die Antibiotika mit 5%iger wäßriger Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Eluate wurden gesammelt und mit Kohlenstoff behandelt, um anorganische Salze zu entfernen.

Durch Einengen der Eluate aus dem Kohlenstoff wurden 60 g eines blaßbraunen Pulvers erhalten.

Dieses Pulver wurde erneut auf stark saures Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps mit 8% Vernetzung chromatographiert. Das Pulver wurde in 0,1 m-Phosphatpuffer von einem pH-Wert 2,0 gelöst und auf einer 2-1-Kolonne aus stark saurem Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps mit 8% Vernetzung (100 bis 200 Maschen) adsorbiert, welches mit einem Phosphatpuffer von pH 2,0 gepuffert war. Die Antibiotika wurden mit 0,1 m-Phosphatpuffer von pH 4,3 eluiert. Die aktiven Eluate wurden, wie vorstehend geschildert, mit Kohlenstoff zur Entfernung anorganischer Salze behandelt. Man erhielt eine Ausbeute von 29 g eines blaßgelben Pulvers. Dieses wurde weiter durch Chromatographie auf einem Ionenaustauscher eines sulfoäthylierten vernetzten Dextrans gereinigt. Dieses Pulver wurde auf eine Kolonne mit 50 g einem Ionenaustauscher eines sulfoäthylierten vernetzten Dextrans, das vorhergehend mit 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 2,0) gepuffert war, aufgegeben. Durch aufeinanderfolgende Steigerung der Konzentration des Puffers bis zu 0,1 m wurden die Antibiotika eluiert. Dabei wurden 14 g eines gereinigten weißen Pulvers des Polyoxinkomplexes erhalten.

Trennung der Polyoxine A und B

Der erhaltene Polyoxinkomplex bestand aus mindestens vier aktiven Stoffen einschließlich der Polyoxine A und B, die die Hauptbestandteile bildeten. Es wurde eine Chromatographie auf einer Cellulosekolonne durchgeführt, um die Polyoxine A und B in reinem Zustand zu trennen. Die Verteilungschromatographie der Cellulosekolonne (55 χ 1000 mm) wurde unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol—Essigsäure—Wasser (4:1:2) ausgeführt. Zunächst wurde Polyoxin A eluiert und dann B. 2 g A und 0,4 g B wurden aus 5 g des Polyoxinkomplexes erhalten.

Das Verfahren der Zonenelektrophorese wurde angewandt zwecks weiterer Reinigung von A und B. Unter Verwendung von Zeonharz als Träger und 0,1 m-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 4,3 wurde die Elektrophorese bei 150VoIt während 16 Stunden ausgeführt. Eine Wasserextraktion der Hauptfraktion und anschließende Behandlung mit Kohle ergab jeweils die reinen Substanzen der PoIyoxineA und B. Die Ausbeute bei diesem Verfahren

betrug etwa 50%. ,

Schließlich wurde die Kristallisation aus wäßrigem

Äthanol versucht. Polyoxin A wurde in Form von farblosen Nadeln erhalte~nT~Polyoxin B wurde als farbloses amorphes Pulver erhalten.

Beispiel 2

Rohrzucker 60 g

Glukose 15 g

Getrocknete Hefe 35 g

Sojabohnenmehl 15 g

Kaliumphosphat 2 g

Calciumcarbonat 4 g

Wasser 1000 ml

(keine Einstellung
des pH-Wertes)

11 12

Das Fermentieren wurde in ähnlicher Weise wie Calciumcarbonat 4 g

im Beispiel 1 unter Verwendung des vorstehenden Wasser 1000 ml

Mediums durchgeführt, wobei die Konzentration der (pH-Einstellung

Polyoxine 3 mg/ml, errechnet auf der Basis der Akti- auf 7,0)
vität von Polyoxin A, innerhalb von 72 bis 96 Stunden 5
nach der Inokulierung mit ATCC 19 093 erreicht

wurde. Das Fermentierungsverfahren wurde in ähnlicher

B e i s ρ i e 1 3 Weise wie im Beispiel 1 unter Verwendung des vorstehenden Mediums ausgeführt, wobei die Konzen-

Lösliche Stärke 70 g io tration der Polyoxine 7 mg/ml, errechnet auf der

Glukose 5 g Basis der Aktivität von Polyoxin A, innerhalb von

Sojabohnenmehl 15 g 72 bis 96 Stunden nach der Inokulierung mit ATCC

Natriumchlorid 2 g 19 094 erreicht wurde.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung der Antibiotika PoIyoxin A und Polyoxin B mit den folgenden Formeln:

   CH₇OH

   B. HOOC
   HN CH

   CH₉OH