DE1492111C - Verfahren zur Herstellung von Poly oxm A und B - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Poly oxm A und BInfo
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Description
durch Züchten eines Bakterienstamms in einem Kulturmedium bei einer Temperatur von 25 bis
35° C, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterienstamm den Stamm ATCC Nr. 19093
oder 19094 verwendet und das Reaktionsgemisch in an sich bekannter Weise aufarbeitet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur 30 durch Züchten eines Bakterienstamms in einem KuI-Herstellung
der Antibiotika Polyoxin A und Poly- turmedium bei-einer Temperatur von 25 bis 35° C,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterienstamm den Stamm ATCC Nr. 19 093 oder 19 094
verwendet und das Reaktionsgemisch in an sich be-35 kannter Weise aufarbeitet.
CH2OH Die Eigenschaften der Stämme ATCC 19 093 und
CH2OH Die Eigenschaften der Stämme ATCC 19 093 und
oxin B mit den folgenden Formeln:
CH,-CH
CH7OH
ATCC 19 094, die die Polyoxine A und B erzeugen, sind folgende:
1. Mikroskopische Untersuchung
Das Wachstum ist gut von 20 bis 32° C.
Das Luftmycel ist monopodisch verzweigt auf synthetischem Agar und proteinhaltigen Agarmedien.
Die Sporophoren bilden offene Spiralen und keine Quirle. Form und Größe der Sporen sind asymmetrisch
stabähnlich (1,5 bis 1,8 μ χ 0,5 bis 0,7 μ) und oval (1,2 bis 1,0 μ χ 1,0 bis 0,7 μ), und die
Oberfläche ist glatt.
2. Kultureigenschaften
1. Czapek-Agar27°C,ATCC19 093:
Gutes Wachstum in farblos oder Weißbraun, Bildung von reichlichem Luftmycel, das pulvrig
ist und sich von Weiß bis Rauchgrau ändert.
Die Rückseite ist blaßolivgrau ohne lösliches
Pigment. ATCC 19 094:
bildet Luftmycel, das pulvrig ist und sich von Weiß bis Erdbraun ändert. Die Rückseite ist gelbstichigblaßbraun.
bildet Luftmycel, das pulvrig ist und sich von Weiß bis Erdbraun ändert. Die Rückseite ist gelbstichigblaßbraun.
2. Glycerin-Czapek-Agar 27° C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum, blaßolivbraun. Es wird keines oder spärliches dünnweißes Luftmycel gebildet.
Gutes Wachstum, blaßolivbraun. Es wird keines oder spärliches dünnweißes Luftmycel gebildet.
Die Rückseite ist blaßolivbraun oder cremefarbig ohne lösliches Pigment.
ATCC 19 094:
ATCC 19 094:
Es wird kein Luftmycel gebildet, im übrigen gleich ATCC 19 093.
3. Nähragar 27° C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum, gewinkelt, rauchgrau, spärliches Luftmycel mit Änderung von Weiß zu
Blaßgrau; die Rückseite hat schwachbraungelbliche Farbe und ergibt ein braunes lösliches Pigment.
ATCC 19 094:
Wachstum wie ATCC 19 093, Bildung von sehr w
spärlichem Luftmycel mit Weiß bis Weißlichgrau, lösliches Pigment geringer als bei ATCC 19 093.
4. Glukose-Pepton-Agar 270C1ATCC 19 093:
Wachstum cremefarbig bis blaßgräulicholiv, keines oder spärliches weißgraues Luftmycel wird gebildet. Die Rückseite ist blaßbraun und bildet ein hellbraunes lösliches Pigment.
Wachstum cremefarbig bis blaßgräulicholiv, keines oder spärliches weißgraues Luftmycel wird gebildet. Die Rückseite ist blaßbraun und bildet ein hellbraunes lösliches Pigment.
ATCC 19 094:
Wachstum spärlich und schwache Bildung von weißem oder blaßgrauem Luftmycel im späteren
Zeitraum der Kultur. Die Rückseite ist olivbraun.
5. Glukose-Asparagm-Agar27°C,ATCC 19 093:
Wachstum gewinkelt und Änderung von Weiß bis Kupferbraun, Bildung von Luftmycel mit Weiß bis Blaßgrau oder Grau. Die Rückseite ist kupferbraun und ergibt kein lösliches Pigment. ATCC 19 094:
Wachstum gewinkelt und Änderung von Weiß bis Kupferbraun, Bildung von Luftmycel mit Weiß bis Blaßgrau oder Grau. Die Rückseite ist kupferbraun und ergibt kein lösliches Pigment. ATCC 19 094:
Sehr wenig Luftmycel, bisweilen wird weißgraues Luftmycel gebildet.
6. Stärke-Agar 27° C, ATCC 19 093: Gutes Wachstum, farblos oder olivbraun, Bildung
von reichlich pulvrigem, blaßmausgrauem Luftmycel. Die Rückseite ist olivgelb und ergibt
kein lösliches Pigment. Die Hydrolysierungsaktivität für Stärke ist wie üblich. ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
7. Calcium-Malat-Agar 27° C, ATCC 19 093:
Wachstum farblos oder blaßbraun und gelb, Bildung von reichlich mausgrauem Luftmycel. Die Rückseite ist cremegelb und bildet bisweilen schwachgelblichbraunes lösliches Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
Wachstum farblos oder blaßbraun und gelb, Bildung von reichlich mausgrauem Luftmycel. Die Rückseite ist cremegelb und bildet bisweilen schwachgelblichbraunes lösliches Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
8. Tyrosin-Agar 27° C, ATCC 19 093:
Spärliches Wachstum, braun, keine Bildung von Luftmycel. Die. Rückseite ist cremefarbig und gibt kein lösliches Pigment.
Spärliches Wachstum, braun, keine Bildung von Luftmycel. Die. Rückseite ist cremefarbig und gibt kein lösliches Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
9. Ei-Albumin-Agar 270C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum, farblos bis Weiß, keine Bildung von Luftmycel, bisweilen jedoch sehr wenig
weißes Luftmycel im späteren Zeitraum der Kultur. Die Rückseite ist weiß, ergibt kein lösliches
Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
10. Hafermehl-Agar-Kulturmedium 27°C, ATCC
19 093:
Wachstum olivbraun, Bildung von etwas blaßgrauem Luftmycel, bisweilen keine Bildung desselben.
Die Rückseite ist farblos und ergibt kein lösliches Pigment.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
11. Kartoffelschnitt 270C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum, dunkelolivbraun, Bildung von blaßgrauem Luftmycel. Das Medium ändert sich
zu Blaßrauchgrau.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
12. Gelatinestab 180C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum, geringfügige Gelatineverflüssigung, Erzeugung eines geringfügig dunkelbraunen
löslichen Pigmentes.
ATCC 19 094: gibt kaum Gelatineverflüssigung.
ATCC 19 094: gibt kaum Gelatineverflüssigung.
13. Glukosebrühe 270C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum auf der Oberfläche und innerhalb der Lösung, Erzeugung eines löslichen
braunen Pigments.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
ATCC 19 094 wie ATCC 19 093.
14. Czapek-Lösung 27° C, ATCC 19 093:
Gutes Wachstum auf der Oberfläche und am Boden der Lösung, Bildung einer dünrten Membran
auf der Oberfläche und etwas weißen Luftmycels. Keine Erzeugung löslichen Pigmentes.
ATCC 19 094: bildet keine Membran an der Oberfläche.
ATCC 19 094: bildet keine Membran an der Oberfläche.
15. Melaninbildung:
Sowohl ATCC 19 093 als auch ATCC 19 094 sind negativ.
16. Nitratreduktion:
Sowohl ATCC 19 093 als auch ATCC 19 094 sind schwach positiv.
17. Cellulose-Kulturmedium:
Kein Wachstum in einer synthetischen Kulturlösung, die Cellulose als einzige Kohlenstoffquelle
enthält.
18. Verwertung von Kohlenstoffquellen:
Nach der Metholde von A. G. B1 i d u m unter Verwendung der folgenden Kohlenstoffquellen:
ATCC 19 093
ATCC 19 094
Glukose + + + + + +
Rohrzucker + + + + + +
Stärke '. + + + + + +
Lactose ++ + + +
Fructose 4- + +
Maltose + + + + + +
Inulin + + + + + +
Inosit ' ++ + + +
Raffinose + + + + + +
Arabinose + +
Galactose + + +
Xylose + +
+ + + Gutes Wachstum.
+ + Mittleres Wachstum.
+ Spärliches Wachstum.
+ + Mittleres Wachstum.
+ Spärliches Wachstum.
Im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten verschiedenen Eigenschaften der Mikroorganismen
ATCC 19 093 und 19 094 dürfte angenommen werden, daß sie zur Gruppe Streptomyces griseus gehören.
Gemäß der Erfindung kann die Fermentierung gemäß den üblichen Fermentierungsverfahren für
übliche Actinomyceten ausgeführt werden. Allgemein ausgedrückt, werden Stärke, Dextrin, Glukose, Glycerin,
Maltose und Fructose als Kohlenstoffquelle verwendet. Fleischextrakte, Pepton; Maisquellflüssigkeit,
Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl und Hefe werden als Stickstoffquelle verwendet.
Anorganische Stoffe, beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und andere Phosphate,
werden zu dem nahezu neutralen flüssigen Kulturmedium zugegeben. Das Medium wird mit
dem Stamme inokuliert und unter Rühren bei 25 bis 35° C kultiviert. Im allgemeinen erreicht die Konzentration
der erzeugten Antibiotika das Maximum zwischen 40- und lOOstündiger Kultivierung. Da diese
Zeit entsprechend der Belüftung und den Rührbedingungen trotz Anwendung der gleichen Temperatur
und eines Kulturmediums aus den selben Bestandteilen variieren kann, ist es ratsam sie durch Ermittlung
der Wirksamkeit in jedem Fall zu bestimmen.
Allgemein bekannte physikalisch-chemische Verfahren können angewandt werden, um die Antibiotika
aus der Kulturbrühe zu isolieren. Beispielsweise wird zuerst das Mycel durch Filtration unter
Zugabe von Filterhilfe, beispielsweise saurer oder neutraler Diatomeenerde, entfernt, und das Filtrat
wird auf Aktivkohle bei saurem oder neutralem pH-Wert adsorbiert. Die Antibiotika können durch
geeignete Lösungsmittel, beispielsweise wäßriges Methanol oder wäßriges Aceton, eluiert werden. Da die
Polyoxine amphotere Verbindungen sind, werden sie auf Kationen- oder Anionenaustauschharzen adsorbiert
und lassen sich durch geeignete Säure-, Alkalioder Salzlösungen eluieren. Beispielsweise wird das
angesäuerte Kulturfiltrat durch eine Kolonne mit stark saurem Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps
mit 8% Vernetzung gegeben, und die adsorbierten Polyoxine können durch eine wäßrige Lösung
mit 5% Natriumchlorid oder mit einem Phosphatpuffer von pH 4,3 eluiert werden. Das Rohpulver des
auf diese Weise erhaltenen Polyoxinkomplexes kann durch Säulenchromatographie unter Verwendung von
Ionenaustauschern, beispielsweise Ionenaustauscher eines sulfoäthylierten vernetzten Dextrans, Sulfoäthylcellulose
oder Sulfomethylcellulose, isoliert werden oder durch Verfahren, der Zonenelektrophorese.
Die vollständige Trennung der Polyoxine A und B wird durch Verteilungschromatographie unter Verwendung
von Cellulosepulver oder Silikatgel durchgeführt. Es kann durch ein geeignetes Lösungsmittel,
beispielsweise das Lösungssystem aus Butanol, Essigsäure und Wasser, entwickelt werden. Polyoxin A
wird zuerst eluiert, worauf dann Polyoxin B eluiert wird. Bequemer ist die Trennung von A und B auch
möglich durch wiederholte Umkristallisation aus einem wäßrigen Lösungsmittel unter Anwendung von
fraktionierten Kristallisationsverfahren.
Durch Umkristallisation aus wäßrigem Alkohol wird Polyoxin A als farblose Nadeln und Polyoxin B
als kristallines Pulver erhalten. Die physikalischchemischen Eigenschaften der Polyoxine A und B
sind wie folgt:
1. Zersetzungspunkte
Weder Polyoxin A, das nachfolgend als A bezeichnet wird, noch Polyoxin B, das nachfolgend als B
bezeichnet wird, zeigen klare Zersetzungspunkte; A zersetzt sich allmählich ohne Schmelzen oberhalb
180° C, während B sich oberhalb 16O0C zersetzt.
60
2. Analytische Elementarwerte
Sowohl A als auch B enthalten Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff.
A: C 44,42, H 5,10, N 13,81;
B: C 40,18, H 4,87, N 13,50.
B: C 40,18, H 4,87, N 13,50.
3. Molekulargewicht
Da A und B amphotere Verbindungen sind, wurden die Äquivalentgewichte nach dem Titrierverfahren
bestimmt:
A: 623, B: 507.
Die Molekulargewichtsbestimmung nach der Methode B a r y e r ergab die Werte von 560 bis 770 für A
und von 420 bis 560 für B.
4. Molekularformeln
A: C23H32N6O14;
B: C17H25N5O13.
B: C17H25N5O13.
5. Molekularformeln und berechnete Werte für Molekulargewichte und -elemente
A: berechnet für C23H32N6O14. Molekulargewicht
616,53:
C 44,80, H 5,19, N 13,63.
B: berechnet für C17H25N5O13. Molekulargewicht
507,31:
C 40,25, H 4,97, N 13,80.
6. Chemische Strukturen A und B haben folgende Strukturen:
COOH
A.
CH3-CH
CH3-CH
CH, OH
HOCH
CH7OCONH,
HOOC O
HN CH /O
HN CH /O
CH2OH
HOCH
OH
CH2OCONH2
Wie in den obigen Strukturen gezeigt, wird beobachtet, daß sowohl A als auch B eine große Ähnlichkeit
in ihren chemischen Strukturen aufweisen.
7. Spezifische Drehungen
A: [α]? = -32°, (C = 1, in Wasser);
B: [a]0 2 = +34°, (C = 1, in Wasser).
B: [a]0 2 = +34°, (C = 1, in Wasser).
8. Ultraviolett-Absorptionsspektren
Die Spektren für A sind in F i g. 1, für B in F i g. 2 gezeigt. Die Maxima liegen wie folgt:
0,05n-HCl
max
0,05n-NaOH
max
0,05n-HCl
= 262 πΐμ (EJi 142),
= 264πΐμ(Ε1* 103),
= 262 ηΐμ (Ε}£ 172),
= 264 πΐμ (EJ *m 130).
= 264πΐμ(Ε1* 103),
= 262 ηΐμ (Ε}£ 172),
= 264 πΐμ (EJ *m 130).
9. Infrarot-Absorptionsspektren
naria kikuchiana, Alternaria mali, Diaporthe citri, Gloeosporium laeticolor, Glomerella cingulata, Colletorichum
lagenasium, Cladosporium cucumerinum, Cladosporium fulvum, Fusarium oxysporum, Cercoopora
biticola, Cuignardia laricina, Corticium rolfsii u. dgl.
Die Polyoxine A und B ergaben beträchtliche Vorbeugungs- und Heilwirkungen in Gewächshausversuchen,
so daß sie eine erhebliche Bedeutung in der praktischen Verwendung besitzen.
Die Infrarot-Absorptionsspektren für A und B sind in den F i g. 3 bzw. 4 gezeigt, die in Kaliumbromidtabletten
bestimmt wurden. Die Hauptabsorption tritt bei folgenden Wellenlängen auf:
A: 3400, 1677, 1623, 1459, 1366, 1280, 1250, 1115, 1046,773 cm-1;
B: 3365, 1675, 1601, 1465, 1390, 1338, 1277, 1130, 1050,784 cm-1.
10. Rf-Werte
Die Rf-Werte des Lösungsmittelsystems, die durch Entwicklung mit Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2)
unter Verwendung des Filterpapiers Nr. 51 (Toyo Roshi Co.) bestimmt wurden, sind wie folgt:
A: 0,28, B: 0,15.
30
11. Löslichkeiten
35
Sowohl A als auch B sind in Wasser leicht löslich, jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Aceton,
Chloroform, Benzol und Äther.
12. Farbreaktionen
Sowohl A als auch B geben positive Ninhydrin-,
Diazo- und Tollenreaktionen, sind jedoch negativ bei den Fehling-, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-, Molish-,
Ferrichlorid-, Natriumnitroprussid- und Sakaguchi-• Versuchen.
13. pka-Werte
Sowohl A als auch B sind amphotere Verbindungen und haben drei titrierbare Gruppen. Die pka-Werte
sind wie folgt:
A: 3,0, 7,3, 9,6;
B: 3,0, 6,9, 9,4.
B: 3,0, 6,9, 9,4.
14. Stabilitäten
Sowohl A als auch B sind in alkalischer Lösung etwas unstabil, jedoch äußerst stabil in saurer oder
neutraler Lösung. Es tritt keine Zersetzung beim Erhitzen auf 1000C während 15 Minuten innerhalb
eines pH-Bereiches von 1,0 bis 8,0 auf. Sowohl A als auch B sind gegenüber Bestrahlung mit Ultraviolettlicht
beständig. Sie behalten ihre Aktivitäten bei, falls die Lösungen 30 cm unter 20-W-Lampen gestellt
werden und 24 Stunden bestrahlt werden.
Die biologischen Aktivitäten der Polyoxine A und B sind wie folgt:
1. Antimikrobielle Werte
Wie in der folgenden Tabelle gezeigt, zeigen sowohl A als auch B spezifische Aktivitäten gegenüber
phytopathogenen Fungi, nämlich Pellicularia sasakii, Chochliobolus miyabeanus, Pellicularia oryzae, Alter-
Minimale | A | B | |
Hemmkonzentration | 1,56 | 1,56 | |
Untersuchte Organismen | Mcg/ml | 1,56 | 6,25 |
12,5 | 0,2 | ||
Alternaria kikuchiana | 3,12 | 6,25 | |
Cochliobolus miyabeanus .. | 1 | 1 | |
Pellicularia sasakii | 10 | 10 | |
Piricularia oryzae | 100 < | 10 | |
Alternaria mali | 10 | 10 | |
Diaporthe citri | 100 < | 10 | |
Gloeosporium laeticolor.... | 1 | 0,1 | |
Glomerella cingulata | 1 | 0,1 | |
Colletorichum lagenarium .. | 100 < | 100 < | |
Cladosporium cucumerinum | 10 | 10 | |
Cladosporium fulvum | 0,1 | 0,1 | |
Fusarium oxysporum | 10 | 10 | |
Cercospora beticola | >50 | >50 | |
Cuignaria laricina | >50 | >50 | |
Corticium rolfsii | >50 | >50 | |
Trichophyton asteroides.... | >50 | >50 | |
Trichophyton interdigitalis . | >50 | >50 | |
Trichophyton rubrum | >50 | >50 | |
Candida albicans | >50 | >50 | |
Candida tropicalis | >50 | >50 | |
Candida crusei | >50 | >50 | |
Cryptococcus neoformans .. | >50 | >50 | |
Aspergillus fumigatus | >50 | >50 | |
Aspergillus terreus | >50 | >50 | |
Mucor racemosus | >50 | >50 | |
Nocardia asteroides | >50 | >50 | |
Trichomonas vaginalis | >50 | >50 | |
Staphylococcus aureus 209 ρ | >50 | >50 | |
Micrococcus luteus | >50 | >50 | |
Bacillus subtilis | >50 | >50 | |
Mycobacterium smegmatis . | >50 | >50 | |
Mycobacterium 607 | >50 | >50 | |
Mycobacterium phlei | >50 | >50 | |
Mycobacterium BCG | >50 | >50 | |
Escherichia coli | >50 | >50 | |
Pseudomonas aeruginosa ... | >50 | >50 | |
Serratia marscens | |||
Proteus vulgaris | |||
Xanthomonas cryzae |
2. Toxizitäten ·
Jeweils 800 mg/kg von Polyoxinen A und B wurden intravenös an Mäusen injiziert. Es ergab sich kein
209 581/473
Anzeichen der Toxizität. Wenn die physikalischchemischen und biologischen Eigenschaften von PoIyoxinenA
und B mit anderen bisher beschriebenen Antibiotika verglichen werden, zeigt sich, daß sie neue
Antibiotika sind.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung.
Fermentierungsverfahren
Zusammensetzung des Kulturmediums
Zusammensetzung des Kulturmediums
Glukose 15g
Glycerin 10 g
Sojabohnenmehl 15g
Ammoniumsulfat 5 g
Getrocknete Hefe 5 g
Natriumchlorid 5 g
Calciumcarbonat 4 g
Wasser 1000 ml
Der pH-Wert wurde auf 7,6 eingestellt und die Sterilisierung bei 1200C während 20 Minuten ausgeführt.
ATCC 19 093 wurde darin inokuliert und bei 270C
unter Rühren so lange fermentiert, bis maximale Aktivität erhalten wurde. Die Versuche wurden unter
Verwendung von Alternaria kikuchiana und Cochliobulus miyabeanus als Testorganismen ausgeführt.
Wenn der Stamm ATCC 19 093 in einem 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Inhalt von 70 mm
Medium einer Schüttelkultur unterworfen wurde, erreichte die Aktivität das Maximum nach 72 bis
96 Stunden. Wenn die 48 Stunden alte Schüttelkultur-Brühe in einen Fermentierungstank mit einem
Inhalt von 4001 desselben Mediums inokuliert wurde und die Fermentierung unter Rühren mit einer
Geschwindigkeit von 220 Umdrehungen je Minute und einer Belüftung mit 4001 Luft je Minute ausgeführt
wurde, erreicht die Erzeugung des Antibiotikas ihr Maximum nach 72stündiger Fermentierung.
Isolierung und Reinigung
4301 der fertigen Brühe wurden auf pH 2,0 mit 10%iger Salzsäure angesäuert und auf 70° C erhitzt,
worauf 9 kg Diatomeenerde zugegeben wurden und durch eine Filterpresse filtriert wurde. Das Filtrat
wurde mit 8 kg Aktivkohle und 8 kg Diatomeenerde versetzt, gerührt und filtriert. Die Aktivkohle wurde
mit 3501 Wasser gewaschen. Die aktiven Bestandteile wurden zweimal mit 1001 eines 60%igen Acetons
eluiert. Die eluierte Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Dabei wurden 41 der aktiven Substanz enthaltendes
Wasser erhalten.
501 Aceton wurden hierzu zugefügt und der erhaltene
Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 644 g eines braunen Rohpulvers erhalten wurden.
370 g dieses Pulvers wurden in Wasser gelöst und auf pH 2,0 angesäuert. Die Lösung wurde durch eine
mit 4,5 1 stark saurem Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps mit 8% Vernetzung (50 bis 100 Maschen,
H-Form) gepackten Kolonne gegeben. Nach Waschen mit Wasser wurden die Antibiotika mit
5%iger wäßriger Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Eluate wurden gesammelt und mit Kohlenstoff
behandelt, um anorganische Salze zu entfernen.
Durch Einengen der Eluate aus dem Kohlenstoff wurden 60 g eines blaßbraunen Pulvers erhalten.
Dieses Pulver wurde erneut auf stark saures Kationenaustauschharz eines Sulfosäuretyps mit 8%
Vernetzung chromatographiert. Das Pulver wurde in 0,1 m-Phosphatpuffer von einem pH-Wert 2,0 gelöst
und auf einer 2-1-Kolonne aus stark saurem Kationenaustauschharz
eines Sulfosäuretyps mit 8% Vernetzung (100 bis 200 Maschen) adsorbiert, welches mit
einem Phosphatpuffer von pH 2,0 gepuffert war. Die Antibiotika wurden mit 0,1 m-Phosphatpuffer von
pH 4,3 eluiert. Die aktiven Eluate wurden, wie vorstehend geschildert, mit Kohlenstoff zur Entfernung
anorganischer Salze behandelt. Man erhielt eine Ausbeute von 29 g eines blaßgelben Pulvers. Dieses
wurde weiter durch Chromatographie auf einem Ionenaustauscher eines sulfoäthylierten vernetzten
Dextrans gereinigt. Dieses Pulver wurde auf eine Kolonne mit 50 g einem Ionenaustauscher eines
sulfoäthylierten vernetzten Dextrans, das vorhergehend mit 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 2,0) gepuffert
war, aufgegeben. Durch aufeinanderfolgende Steigerung der Konzentration des Puffers bis zu 0,1 m
wurden die Antibiotika eluiert. Dabei wurden 14 g eines gereinigten weißen Pulvers des Polyoxinkomplexes
erhalten.
Trennung der Polyoxine A und B
Der erhaltene Polyoxinkomplex bestand aus mindestens vier aktiven Stoffen einschließlich der Polyoxine
A und B, die die Hauptbestandteile bildeten. Es wurde eine Chromatographie auf einer Cellulosekolonne
durchgeführt, um die Polyoxine A und B in reinem Zustand zu trennen. Die Verteilungschromatographie
der Cellulosekolonne (55 χ 1000 mm) wurde unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol—Essigsäure—Wasser
(4:1:2) ausgeführt. Zunächst wurde Polyoxin A eluiert und dann B. 2 g A und 0,4 g B wurden aus 5 g des Polyoxinkomplexes
erhalten.
Das Verfahren der Zonenelektrophorese wurde angewandt zwecks weiterer Reinigung von A und B.
Unter Verwendung von Zeonharz als Träger und 0,1 m-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 4,3
wurde die Elektrophorese bei 150VoIt während 16 Stunden ausgeführt. Eine Wasserextraktion der
Hauptfraktion und anschließende Behandlung mit Kohle ergab jeweils die reinen Substanzen der PoIyoxineA
und B. Die Ausbeute bei diesem Verfahren
betrug etwa 50%. ,
Schließlich wurde die Kristallisation aus wäßrigem
Äthanol versucht. Polyoxin A wurde in Form von farblosen Nadeln erhalte~nT~Polyoxin B wurde als
farbloses amorphes Pulver erhalten.
Rohrzucker 60 g
Glukose 15 g
Getrocknete Hefe 35 g
Sojabohnenmehl 15 g
Kaliumphosphat 2 g
Calciumcarbonat 4 g
Wasser 1000 ml
(keine Einstellung
des pH-Wertes)
des pH-Wertes)
11 12
Das Fermentieren wurde in ähnlicher Weise wie Calciumcarbonat 4 g
im Beispiel 1 unter Verwendung des vorstehenden Wasser 1000 ml
Mediums durchgeführt, wobei die Konzentration der (pH-Einstellung
Polyoxine 3 mg/ml, errechnet auf der Basis der Akti- auf 7,0)
vität von Polyoxin A, innerhalb von 72 bis 96 Stunden 5
nach der Inokulierung mit ATCC 19 093 erreicht
vität von Polyoxin A, innerhalb von 72 bis 96 Stunden 5
nach der Inokulierung mit ATCC 19 093 erreicht
wurde. Das Fermentierungsverfahren wurde in ähnlicher
B e i s ρ i e 1 3 Weise wie im Beispiel 1 unter Verwendung des vorstehenden
Mediums ausgeführt, wobei die Konzen-
Lösliche Stärke 70 g io tration der Polyoxine 7 mg/ml, errechnet auf der
Glukose 5 g Basis der Aktivität von Polyoxin A, innerhalb von
Sojabohnenmehl 15 g 72 bis 96 Stunden nach der Inokulierung mit ATCC
Natriumchlorid 2 g 19 094 erreicht wurde.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung der Antibiotika PoIyoxin A und Polyoxin B mit den folgenden Formeln:CH7OHB. HOOC
HN CHCH9OH
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5408864 | 1964-09-24 | ||
JP5408864 | 1964-09-24 | ||
DER0041603 | 1965-09-24 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1492111A1 DE1492111A1 (de) | 1969-05-14 |
DE1492111B2 DE1492111B2 (de) | 1973-01-04 |
DE1492111C true DE1492111C (de) | 1973-07-26 |
Family
ID=
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