DE1617881C2 - Antibiotikum Enduracidin und seine Herstellung - Google Patents

Antibiotikum Enduracidin und seine Herstellung

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DE1617881C2
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Mitsuko Takatsuki Osaka Asai
Kazunori Hatano
Eiji Kawamo Takarazuka Hyogo Higashide
Komei Suita Osaka Mizuno
Masayuki Suita Osaka Muroi
Motoo Toyonaka Osaka Shibata
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Description

\
Die Erfindung betrifft das Antibiotikum Enduracidin, wie es durch den Anspruch 1 definiert ist, und seine Herstellung gemäß den Angaben des Anspruchs 2.
Im Laufe ihrer Untersuchungen hat die Anmelderin gefunden:
1. Es gibt bestimmte Mikroorganismenstämme, die das neue Antibiotikum zu bilden vermögen,
w 2. Die Mikroorganismen, die das Antibiotikum zu bilden vermögen, gehören zur Gattung »Streptomyces«.
3. Das Antibiotikum wird angereichert, wenn die Mikroorganismen gezüchtet werden.
4. Das angereicherte Antibiotikum kann in der gewünschten Reinheit aus der Kulturlösung unter Ausnutzung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums isoliert werden.
5. Das Antibiotikum ist sehr wirksam gegen gram-positive und säurefeste Bakterien.
35
Das neue Antibiotikum wurde als »Enduracidin« bezeichnet.
Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung wird Streptomyces fungicidicus IFO-12439, der vom Boden bei Nishinomiya, Japan, isoliert wurde, oder Streptomyces fungicidicus IFO 12440, gezüchtet.
Die Eigenschaften von Streptomyces fungicidicus IFO 12439 sind nachstehend aufgeführt. Hierbei basieren die mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf Ridgway's Color Standard and Nomenclature.
A. Morphologische Eigenschaften
Die Sporophoren bilden Spiralen. Die Sporen sind oval, 0,9 x 1,6 bis 1,1 μητι. Die Oberfläche der Sporen ist stachelig.
B. Merkmale der Kulturen
so 1) Czapek-Agar:
Vergetatives Mycel (nachstehend als VM bezeichnet): reichlich sich ausbreitend, dringt in das Medium ein, farblos
Luftmycel (nachstehend als LM bezeichnet): Reichlich, pulverförmig, graubraun (Rdg. LI, 1'"")
Rückseite (nachstehend als R bezeichnet): Lebhaft braungelb (Rdg. XV, 17'-d)
Lösliches Pigment (nachstehend als LP abgekürzt): Nicht vorhanden.
2) Glucose-Czapek-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, pulverförmig, blaß graubraun (Rdg. XI, l'""-d)
R: Lebhaft braungelb
LP: Nicht vorhanden oder schwach gelb.
3) Glycerin-Czapek-Agar:
VM: Reichlich, faltig, farblos
LM: Reichlich, tief olivgrau (Rdg. LI, 23'""), wird hell mausgrau (RcIg. Ll, l5'""-b) bis hell graubraun (Rdg. LI, l'""-b)
R: Lebhaft braungelb
LP: Nicht vorhanden oder schwach gelb.
•1) (iliin»se-As|iiini|iin-Annr:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, hell olivgrau (Rdg. Ll, 23"'"-d) bis blaß graubraun (Rdg. LI, l'""-d) oder zuweilen schmutzig weiß
R: Cremefarbig (Rdg. LI, 19'-f) oder farblos
LP: nicht vorhanden.
5) Bouillon: 5 VM: Reichlich, schwimmt auf der Oberfläche des Mediums; ein geringer Teil des Mycels sinkt zu Boden LM: Reichlich, weiß. Durchsichtiges Medium, kein lösliches Pigment.
6) Bouillon-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, farblos
LM: Mäßig, weiß bis blaß graubraun io
R: Lebhaft braungelb (Rdg. XV, 17'-d)
LP: Nicht vorhanden.
7) Glucosebouillon-Agar:
VM: Reichlich, faltig, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, tief graubraun (Rdg. Ll, 1""') 15
R: Gelb-ocker (Rdg. XV, 17')
LP: Schwachbraun oder nicht vorhanden.
8) Glycerinbouillon-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, pulverförmig, graubraun bis tief graubraun 20
R: Isabella-Farbe (Rdg. XXX, 19"-i)
LP: Nicht vorhanden oder schwach braun.
9) Stärke-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, hell graubraun (Rdg. LI, l'""-b), wird graubraun 25
R: Hell braungelb (Rdg. XV, 17'-f)
LP: Nicht vorhanden.
VM: Reichlich, sich ausbreitend, faltig
LM: Mäßig, weiß bis weiß mit gelblichem Stich und zuweilen schmutzig weiß. Die Färbe des Mediums 30 wechselt nach gräulich-weiß bis braun.
11) IIcieextrakt-Agar:
VM: Reichlich, fallig, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, pulverförmig, hell mausgrau (Rdg. LI, 15""'-b) bis graubraun
R: lsabella-Farbe 35
LP: Nicht vorhanden.
12) Kartoffel:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, erhöhl, farblos
LM: Reichlich, graubraun.
Die Farbe des Mediums wird nach 3 Wochen dunkelbräun. 40
13) Milch:
VM: Reichlich, faltig, schwimmt auf der Oberfläche des Mediums, farblos LM: Reichlich, weiß bis perlgrau (Rdg. LII, 35""'-f),
Starke Peptonisierung ohne Koagulierung.
14) Möhrenbrei: . 45 VM: Reichlich, sich ausbreitend, erhöht, farblos
LM: Reichlich, graubraun (Rdg. LI, 1'""). Die Farbe des Breies wird Buchthorn-brauri (Rdg. XV, 17'-f).
15) Gelatine:
VM: Spärlich
LM: Spärlich, weiß, langsame Verflüssigung. 50
16) Nährgelatinc:
VM: Reichlich
LM: Reichlich, weiß, schnelle Verflüssigung
LP: Nicht vorhanden.
17) Nitratreduktion in Czapek-Lösung (enthaltend 0,1% NaHo.i): Positiv 55
18) Cellulose:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, farblos
LM: Reichlich, graubraun (Rdg. LI, Γ""). Keine Zersetzung.
19) Calciummaleat-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, dünn, farblos 60
LM: Mäßig, blaß graubraun (Rdg. LI, l'""-d) bis blaß mausgrau (Rdg. LI, 15""'-Q
R: Fahlgelb (Rdg. XVI, 19'-d) :
LP: Nicht vorhanden oder blaßgelb
20) Tyrosin-Agar:
VM: Spärlich, dünn, sich ausbreitend, farblos 65
LM: Nichl vorhanden
R: Farblos
LP: Nicht vorhanden.
21) Pepton-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, flach, farblos
LM: Spärlich, schmutzig grau, (Rdg. XLVI, 17""-b)
R: Schwach cremefarbig (Rdg. XVI, 19'-f)
LP: Nicht vorhanden.
22) Stärke-Casein-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, flach, farblos
LM: Reichlich, samtartig, tief mausgrau (Rdg. LI, 15"'"-i)
R: Hell olivgrau (Rdg. LI, 23""'-d)
LP: Nicht vorhanden.
23) Maltose-Trypton-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, flach ,farblos
LM: Reichlich, mausgrau (Rdg. LI, 15'"") bis graubraun (Rdg. LI, 1""')
R: Hell braungelb (Rdg. XV 17'-f)
LP: Nicht vorhanden oder schwach gelb.
24) Bennett-Agar:
VM: Reichlich, sich ausbreitend, flach, dünn, farblos
LM: Reichlich, graubraun bis tief graubraun (Rdg. LI, l'""-i)
R: Farblos bis lebhaft braungelb (Rdg. XV, 17'-d)
LP: Nicht vorhanden.
25) Hydrolyse von Stärke:
Enzymatische Zone/Wachstumszone = Hydrolyse
30 mm/10 mm oder
28 mm/10 mm
C. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Pridham-Gottlieb-Methode:
Erythrit Adonit S-Sorbit L-Inosit D-Mannit Dulcit
D-Xylose L-Arabinose L-Sorbose D-Galactose D-Glucose D-Fructose D-Mannose Rhamnose
Melibose
Maltose
Saccharose
Lactose
Raffinose
Trehalose
Salicin
Aesculin
Inulin
Dextran
Natriumacetat + Natriumsuccinat + Natriumcitrat +
Kontrolle ±
Zeichenerklärung:
+ + + -■ starkes Wachstum;
+ + - gutes Wachstum;
+ - mäßiges Wachstum;
± = schwaches Wachstum
Ein Vergleich der vorstehend beschriebenen morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften mit den Beschreibungen in »The Actinomyces« Band II, von S.A. Waksman, Herausgeber The Williams and Wilikins Company, 1961, zeigt, daß der Stamm IFO 12439 insofern ähnliche morphologische Eigenschaften wie Streptomyces fungicidicus hat, als die Sporophoren Spiralen bilden, die Oberfläche der Sporen stachelig ist, das Luftmycel grau ist, kein lösliches Pigment gebildet wird und der Stamm ein nicht-chromogener Typ ist. Es sind jedoch einige Unterschiede in den Kultureigenschaften zwischen dem Stamm und Streptomyces fungicidicus vorhanden. Der letztere bildet nämlich ein rosafarbenes lösliches Pigment, wenn er auf Calciummaleat-Agar gezüchtet wird und bewirkt schwache Koagulierung und Peptonisierung von Milch auf einem Milchmedium. Im Gegensatz hierzu bildet der erfindungsgemäß verwendete Stamm dieses lösliches Pigment nicht. Wenn er lösliche Pigment bildet, ist dieses blaßgelb und koaguliert die Milch auf Milchmedium nicht, sondern peptonisiert die Milch so stark, daß die Peptonisierung innerhalb 1 Woche abgeschlossen ist. Ferner verwertet der erfindungsgemäß verwendete Stamm IFO 12439 Fructose und Salicin, die sonst von Streptomyces fungicidicus nicht verwertet werden.
Darüber hinaus bildet der bisher bekannte Streptomyces furigicidicüs Fungicidin, eine fungicide Substanz, während der erfindungsgemäß verwendete Stamm IFO 12 439 diese fungicide Substanz weder in der Kulturflüssigkeit noch im Mycel bildet.
Nach den vorstehend genannten Eigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten Stammes wurde er von den Erfindern als Stamm von Streptomyces fungicidicus eingestuft und als Streptomyces fundicidicus IFO 12439 bezeichnet.
Im Verlaufe der hochwirksamen Isolierung des Stammes wurde ein Mutant durch UV-Bestrahlung, Einwirkung von y-Strahlen und Monosporenkultur erhalten. Der Mutant bildet spiralförmige Sporophoren, und die Oberfläche der Sporen ist stachelig, wie dies beim Originalstamm der Fäll ist. Die Kulturmerkmale des Mutanten sind nachstehend angegeben.
Kulturmerkmale von Streptomyces fungicidicus IFO 12439
Das nach der Strichmethode ermittelte antibakterielle Spektrum von Streptomyces fungicidicus IFO 12439 auf Bouillon-Agar und Glycerin-Bouillon-Agar ist in Tabelle 1 genannt. Streptomyces fungicidicus IFO 12439 wurde strichförmig auf Agarplatten geimpft und 4 Tage bei 28°C bebrütet. Die Platten wurden dann senkrecht zum Strich ebenfalls strichförmig mit Testorganismen beimpft, die in Tabelle 1 genannt sind, worauf die Bebrütung bei 37° C 20 Stunden für gram-positive und gram-negative bzw. 40 Stunden für säurefeste Bakterien fortgesetzt wurde. Abschließend wurde die Länge der Hemmzone für jeden Testorganismus gemessen.
Tabelle 1
Antibiotisches Spektrum von Streptomyces
fungicidicus IFO 12 439 nach der Strichmethode
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß Streptomyces fungicidicus IFO 12439 aritibiotische Substanzen bildet, die hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien wirksam sind.
Der von Streptomyces fungicidicus IFO 12 439 abgeleitete Mutant Streptomyces fungicidicus IFO 12440 hat die folgenden Eigenschaften:
Gleiche Eigenschaften wie der Ausgangsstamm
Farbloses oder gelbes vegetatives Mycel bei den verschiedenen Kulturen und ein Luftmycel mit der gelben Farbe von Bleimonoxyd (Rdg. XVI 21'-f) oder Senf (Rdg. XVI, 19'-b). Er bildet auf den meisten Kulturmedien kein lösliches Pigment und gelegentlich ein blaßgelbes lösliches Pigment.
1. Czapek-Agar: Vegetatives Mycel reichlich, sich ausbreitend, dringt in das Medium ein, blaßgelb; Luftmyeel reichlich, pulverförmig, cremefarben (Rdg. XVI 19'-f) bis Pale Öchraceous Buff (Rdg. XV, 15'-f), Rückseite cremefarben; lösliches Pigment nicht vorhanden oder blaßgelb.
2. Glucose-Czapek-Agar: VM = reichlich, sich ausbreitend, farblos bis blaßgelb; LM = mäßig, pulverförmig, weiß bis Naples-gelb (Rdg. XVI 19'-d); R = cremefarben bis senfgelb (Rdg. XVI, 19'-b); LP= nicht vorhanden.
3. Glycerin-Czapek-Agar: VM = reichlich, sich ausbreitend, faltig, senfgelb; LM = reichlich, pulverförmig, cremefarben bis Naples-gelb; R = Light Öchraceous Buff (Rdg. XV, 15'-d bis Ochfaceous-Büff (Rdg. 15'-b);
P = blaßgelb. . . . .
4. Glucose-Asparagin-Agar: VM = farblos bis senfgelb, sich ausbreitend; LM = Mäßig, samtartig, gelb wie Bleimonoxyd (Rdg. XVI, 2Γ-0 bis senfgelb; R = gelb; LP = nicht vorhanden.
5. Bouillon-Agar: VM = mäßig, sich ausbreitend, farblos; LM = mäßig pulverförmig, weiß; R - farblos; LP = nicht vorhanden. .
6. Glucose-Bouillon-Agar: Vegetatives Mycel = reichlich, sich ausbreitend, farblos faltig; LM = mäßig, pulverförmig, weiß bis cremefarben: R = blaßbraun; LP = nicht vorhanden.
Hemmzdne, mrh O Agar O
O O O
Bouillon-Agar Olycerin-Bouillon- O O 12
Escherichia coli O 12 12
Proteus vulgaris O O 12 O
Staphylococcus aureus O O O O
Bacillus subtilus O O O O
Bacillus cereus O O O O
Bacillus brevis O O O O
Saccharomyces lutea O O
Micrococcus flavus O
Mvcobacterium avium O
O
7. Glycerinbouillon-Agar: VM = reichlich, sich ausbreitend, farblos, faltig; LM = mäßig, pulverförmig, weiß; R = blaßbraun; LP = nicht vorhanden.
8. Stärke-Agar: VM = reichlich, sich ausbreitend, senfgelb, dringt in das Medium ein; LM = reichlich, pulverförmig, Pale Ochraceous Buff (Rdg. XV, 15'-f) bis cremefarben; R = Naples-gelb bis Ligth Ochraceous-Salmon (Rdg. XV, 13'-d); LP = nicht vorhanden oder schwachgelb.
9. Ganzes Ei: VM = mäßig, sich ausbreitend, Naples-gelb; LM = nicht vorhanden oder sehr spärlich, weiß bis cremefarben. Farbe des Mediums ändert sich nicht.
10. Löffler-Medium: VM = reichlich, farblos, faltig; LM = nicht vorhanden; LP = nicht vorhanden, starke Verflüssigung.
11. Hefeextrakt-Agar: VM = reichlich, sich ausbreitend, faltig, farblos bis schwachbraun; LM = reichlich, pulverförmig, cremefarben bis Naples-gelb; R = Antimongelb (Rdg. XV, 17'-b) bis Light Ochraceous-Salmon;
LP = nicht vorhanden.
12. Kartoffel: VM = reichlich, sich ausbreitend, faltig, antimongelb (Rdg. XV, 17'-b);LM = reichlich, pulverig
weiß bis Light Ochraceous-Buff. Das Medium färbt sich braun.
13. Möhrenbrei: VM = reichlich, faltig, Ochraceous-Buff; LM = zuerst weiß, später Pale Ochraceous-BufTbis Light Ochraceous-Salmon. Die Farbe des Mediums ändert sich nicht.
14. Bouillon: VM = spärlich, sinkt zu Boden, reichliches Wachstum, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, farblos bis blaßbraun; LM = mäßig, pulverig, weiß; LP = nicht vorhanden.
15. Glucosebouillon, Glycerinbouillon: Ebenso wie auf Bouillon, Wachstum jedoch reichlicher und faltig. 16. Lackmusmilch: VM = reichliches Wachstum, senfgelb, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, ringförmiges Wachstum, faltig; LM = spärlich, weiß, starke Peptonisierung ohne Koagulierung.
17. Nährgelatine: VM = reichlich, ringförmig am Rand des Rohres, faltig, Ochraceous-BulT; LM = mäßig, weiß bis cremefarben; kein lösliches Pigment; starke Verflüssigung.
18. Czapeklösung mit 0,2% NaNO.i: VM = mäßig, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, farblos; LM = mäßig, pulverig, weiß; LP = nicht vorhanden. Schwache Nitratreduktion.
19. Cellulose: VM = mäßig, farblos bis cremefarben, sich ausbreitend; LM = mäßig, pulverig, weiß bis blaß Ochraceous-Salmon.
20. Calciummaleat-Agar: VM = mäßig, farblos bis cremefarben bis Ochraceous-Buff, sich ausbreitend; LM = mäßig, pulverig, weiß bis blaßOchraceous-Salmon; R = cremefarben bis hell Ochraceous-Salmon; LP = nicht vorhanden.
21. Tyrosin-Agar: VM = spärlich, dünn, farblos; LM = nicht vorhanden; R = farblos; LP nichl vorhanden.
22. Pepton-Agar: VM = mäßig, sich ausbreitend, farblos; LM = mäßig, pulverig, weiß bis blaß Ochraceous-BuIT (Rdg. XV, 15' -Γ); R = farblos bis cremefarben; LP = nicht vorhanden; nicht-chromogener Typ.
23. Hydrolyse von Stärke: Enzymatische Zone/Wachstumszone 22 mm/11 mm oder 26 mm/13 mm.
C. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Gottlieb:
Erythrit + Rhamnose +++
Adonit ± Melibiose +
D-Sorbit ± D-Maltose +++
i-Inosit +++ Saccharose ±
D-Mannit +++ Lactose +++
Dulcit ± Raffinose +
D-Xylose +++ Salicin +++
L-Arabinose +++ Aesculin +
L-Sorbose + Inulin +
D-Galactose +++ Natriumacetat ++
D-Glucose ++ Natriumsuccinat ++
D-Mannosc +++ Natriumeitrat ++
Glycerin +++ Stärke +++
D-Fructose +++ Kontrolle +
± = schwaches Wachstum;
+ - Wachstum; '
++ = mäßiges Wachstum;
+++ = reichliches Wachstum.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird der entsprechende Stamm in einem Medium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Stickstoffquellen und andere notwendige Nährstoffe enthält. Als ;>5 Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Stärke, Glucose, Lactose, Mallose, Galactose, Saccharose, Dextrin, Glycerin oder Hirsebrei. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Sojabohnenmehl, Maisquellwasscr, Fleischextrakt, Ammoniumsalze, organische oder anorganische Stickstoffverbindungen. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, z. B. Chlorid, Phosphate, Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan
und Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Falls erforderlich, können übliche Nährelemente oder ein Antischaummittel, z.B. tierisches Öl, Wachs, pflanzliches Öl oder Mineralöl, zugesetzt werden.
Für die Züchtung ist die submerse Schüttelkultur unter Verwendung eines flüssigen Mediums vorzuziehen. Gegebenenfalls kann jedoch auch die Züchtung in der stationären Kultur erfolgen. Die Züchtungsbedingungen, z.B. Temperatur, Fermentationsdauer und pH-Wert des Mediums, sind so zu wählen, daß die Bildung von Enduracidin maximal ist. In der Submerskultur ist die Bildung von Enduracidin im allgemeinen bei 25 bis 45°C, etwa neutralem pH-Wert und bei einer Dauer von etwa 3 bis 10 Tagen maximal.
Das hierbei gebildete Enduracidin ist zum größten Teil im Mycel, jedoch auch im flüssigen Teil der Kulturlösung enthalten. Das in der Kulturbrühe angereicherte Enduracidin wird isoliert und in gewünschter Reinheit nach Methoden hergestellt, bei denen die Eigenschaften von Enduracidin, z. B. Unterschiede zwischen Enduraeidin und den Verunreinigungen hinsichtlich der Löslichkeit, im Verteilungsverhältnis zwischen zwei Flüssigphasen, in der Adsorptionsfahigkeit oder in der Ionenkohärenz ausgenutzt werden. Da Enduracidin nicht nur im Mycel, sondern auch im flüssigen Teil der Kulturbrühe vorhanden ist, ist es für seine Isolierung zweckmäßig, zuerst das Mycel von der Kulturlösung abzutrennen und dann das Mycel und den flüssigen Teil der Kulturlösung einem Trenn- bzw. Reinigungsverfahren zu unterwerfen. In der Praxis wird die Abtrennung bzw. Reinigung von Eduracidin vorteilhaft durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel vorgenommen. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Extraktion von Enduracidin mit n-Butanol unter basischen Bedingungen erfolgt und anschließend eine erneute Extraktion mit einer wäßrigen sauren Lösung vorgenommen wird.
Die Abtrennung oder Reinigung von Enduracidin kann unter Ausnutzung beispielsweise der folgenden Eigenschaften erfolgen: Es wird an Aktivkohle unter alkalischen Bedingungen (pH nicht unter 8,0) absorbiert; es kann mit organischen Lösungsmitteln (z. B. angesäuertem wäßrigem Aceton und wäßrigem Methanol) extrahiert werden und wird an Kationen oder Anionenaustauscherharzen ( z.B. Amberlite IR-120 und Amberlite IR-45) nicht adsorbiert. Erfindungsgemäß wird Enduracidin nach dem folgenden Verfahren extrahiert:
Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird mit Wasser gewaschen und zweimal unter neutralen oder sauren Bedingungen mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. 50- bis 70%igem wäßrigem Aceton in der 3-bis 4fachen Volumen-Menge des Mycels, 50- bis 70%iges Methanol usw.) 3 Stunden bei Raumtemperatur extrahiert. Das so erhaltene Filtrat enthält eine reichliche Menge Enduracidin, das eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegen gram-positive Bakterien hat. Nach Einstellung auf pH 5 bis 6 wird das Filtrat im Vakuum durch Abdestillieren des Acetons eingeengt, worauf es mit Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt wird. Nach Zugabe von Ethylacetat in einer Volumen-Menge von einem Drittel des Konzentrats wurde das ganze Gemisch geschüttelt, um den löslichen Teil in die Ethylacetatschicht zu überführen. Die wäßrige Schicht (die eine gewisse Fällungsmenge enthält), die sich von der Ethylacetatschicht abscheidet, wird mit Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat öder Natriumbicarbonat auf pl 1 8 eingestellt und anschließend mit n-Butanol in einer Menge von einem Drittel des Gesamtvolumens extrahiert. Nach Wiederholung der Extraktion mit n-Butanol wird die n-Butanolschicht mit Wasser in einer Menge von 1Z? des Gesamtvolumens gewaschen und dann mit einer wäßrigen Säurelösung (z.B. pH 2, n/200 HCL oder n/200 IhSO^) gewaschen, wobei eine wäßrige saure Lösung erhalten wird, die den Wirkstoff enthält.
Die wäßrige Lösung wird der vorstehend beschriebenen Extraktion mit n-Butanol unterworfen. Die hierbei erhaltene n-Butanolschicht enthält das im Mycel gebildete Enduracidin in hoher Ausbeute. Die Extraktion mit wäßriger Salzsäurelösung und mit n-Butanol wird erneut wiederholt, wobei eine n-Butanolschicht erhalten wird, die den Wirkstoff in einer viel höheren Konzentration enthält. Die so erhaltene n-Butanolschicht wird einer gewissen Einengung unterworfen, mit Wasser gewaschen und weiter unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt, wobei das n-Butanol abdestilliert, bis nur noch eine sehr geringe Menge n-Butanol im System vorhanden ist.
Zum Konzentrat wird Ether in einer Menge gegeben, die '/10 Volumen des n-Butanols entspricht, wobei eine gelblich-braune Fällung gebildet wird, die abfiltriert wird. Die Fällung wird mit Ether gewaschen, wobei der rohe Wirkstoff erhalten wird, der einen größeren Teil des angereicherten Enduracidins darstellt.
Die rohe Substanz zeigt eine Wirksamkeit von 5000 bis 10000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus und 5000 bis 10000 Einheiten/mg gegen Bacillus subtilis.
Die (selbstverständliche) Reinigung der rohen Substanz kann vorzugsweise wie folgt vorgenommen werden: Die in einer wäßrigen Säurelösung gelöste rohe Substanz wird durch eine Säule geleitet, die mit Aktivkohle, die einer Vorbehandlung mit Säure unterworfen worden ist, gefüllt ist, und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauschharz (z.B. Amberlite IR-4b, IR-45) zur Entfernung der Säure behandelt. Die so behandelte Säure wird eingeengt oder gefriergetrocknet, wobei der reine Wirkstoff erhalten wird. , .
Der Wirkstoff kann einer weiteren Reinigung unterworfen oder beispielsweise wie folgt in sein Hydrochlorid überführt werden: Der in methanolischer Salzsäure gelöste Wirkstoff wird durch eine Säule geleitet, die mit Aktivkohle, die einer Vorbehandlung mit Säure unterworfen worden ist, gefüllt ist. Die so behandelte Lösung wird bei Raumtemperatur eingeengt. Das Konzentrat wird mit Aceton-Ether versetzt und anschließend stehen gelassen, wobei ein farbloses kristallines Pulver von Enduracidinhydrochlorid gebildet wird. Dieses Pulver ist in Wasser und Methanol löslich und zeigt eine antibiotische Wirksamkeit von 10000 bis 15000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus und von 10000 bis 15000 Einheiten/mg gegen Bacillus subtilis.
Die 20- bis 50%ige Methanollösung dieses Pulvers wird durch ein schwach basisches Ionenaustauschharz geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird mit n-Butanol versetzt, woraufdas Wasser und Methanol abdestilliert werden und ein Konzentrat erhalten wird. Es ist auch möglich, die wäßrige Lösung dieses Pulvers auf pH 8 bis 8,5 einzustellen, die Lösung mit n-Butanol zu extrahieren und anschließend die Konzentration vorzunehmen. Das hierbei erhaltene Konzentrat wird mit Ether versetzt, wobei Enduracidin in seiner freien Form erhalten wird.
Das so gereinigte Enduracidin hat die folgenden physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften:
1) Elementaranalyse:
Enduracidin besteht aus C-, H-, N-, O- und Cl-Atomen.
C, % H, % N, % Cl, %
Freie Form*) 53,2 + 0,5 6,45 ±0,3 14,45 ±0,5 3,36 ±0,5
Hydrochlorid **) 49,7 + 0,5 6,29 ±0,3 13,51+0,5 9,42 ±0,5
Die freie Form wird nachstehend als (a) und das Hydrochlorid als (B) bezeichnet.
*) Die freie lOrm enthält noch .VU) ± 0,5% Chlor in ihrem Molekül.
Hs wird angenommen, dall der Chlorgehalt von elwa j,.W> :fc 0,5% iuil'slarku lonenbindiini; otler kovalenle Bindung /urück/uluhrcn isl, obwohl· dies noch nicht bestätigt ist,
15 **) Das Hydrochlorid enthält im Vergleich zur freien l'orm weitere 2 Mol Chlor.
2) Molekulargewicht und Struktureinheit
Wenn Enduracidin mit 6n-Salzsäurelösung 6 bis 48 Stunden bei 110° C hydrolysiert wird, werden ein Gemisch
20 von Threonin, Serin, Glycin, Alanin und Asparaginsäure, eine gewisse Menge Substanzen, die in der Ninhydrin-Reaktion positiv sind, und unbestimmte Substanzen gebildet, die sich mit dem Sakaguchi-Reagenz blau und violettblau färben. Zu diesen unbestimmten Substanzen gehören solche, die bei der Ninhydrin-Reaktion zunächst gelblich-braun, gelb oder violett sind, sich aber violett färben, wenn sie bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Ihre Mengen sind verschieden je nach dem Grad der Hydrolyse. Auf Grund dieser Eigenschaf-
25 ten wird Enduracidin als neues Antibiotikum vom Typ des basischen Peptids angesehen.
Andererseits ist einer Neutralisationstitrationskurve, die auf der Grundlage der Titration von Enduracidin in 50%igem Methanol mit einer n/10-Salzsäurelösung gezeichnet wurde, zu entnehmen, daß Enduracidin einige basische Gruppen enthält, die in seinem Molekül zu dissoziieren vermögen. Aus der nachgewiesenen Chlormenge kann das Mindestmolekulargewicht von Enduracidin mit elwa 1055 berechnet werden, so daß das MoIe-30 kulargewicht von Enduracidin mit (etwa 1000 bis 1100),,, wobei //eine ganze Zahl isl, angegeben werden kann.
3) Spezifische Drehung:
23
A: [a]p = + 85° ± 10° (C = 0,5, in Dimethylformamid)
35 B: [a]b = + 70° ± 10° (C = 0,5, in Wasser),
+ 80° + 10° (C = 0,5 in Methanol)
4) Absorptionsspektrum:
40 Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Enduracidin ist und Fig. 1 (freie Form) in Fig. 4 (Hydrochlorid) dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Absorptionsmaxima:
230 ηΐμ (E^1n = 220 ± 15) 230 πιμ (E|*m = 213 ± 10)
AM„95% MeOH 263 πιμ (E|*m = 150 ±10) 263 ιημ (E[*m = 140 ±10)
230 πιμ (E^ .= 195 ± 10)
Λ,,,ίΚ/7/10Ηα272ηιμ(Ε|*η1 = 112 ±10)
60 λ,,βτ/ΐ/ΙΟ NaOH 250 nHi(E|*m = 335 ±10)
Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Enduracidin,gemessen nach derKaliumbromid-Methode, ist in Fig. 2 (freie Form, KBr-Methode) und 3 (freie Form, Nujol-Methode), 5 (Hydrochlorid, KBr-Methode) und 6 65 (Hydrochlorid, Nujol-Methode) dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in μηι (KBr-Methode):
3,05 (stark) 3,25 (Schulter) 3,38 (Schulter) 5,75 (Schulter) 5,95 (Schulter)
6.09 (stark) 6,24 (Schulter) 6,47 (Schulter) 6,55 (Schulter) 6,61 (stark) 6,90 (mittel) 7,23 (mittel) 7,63 (mittel)
8.10 (breit, stark) 8,51 (mittel) 9,90 (mittel)
10,40 (schwach) 11,92 (mittel) 12,30 (schwach) 12,75 (sehr schwach)
A: Farbloses Pulver B: Farbloses kristallines Pulver 3,05 (stark)
3,25 (Schulter)
3,38 (Schulter)
5,77 (Schulter)
5,95 (Schulter)
6,09 (stark)
6,23 (Schulter)
6.47 (Schulter)
6,55 (Schulter)
6,61 (stark)
6,95 (mittel)
7,25 (mittel)
7.48 (Schulter)
8,16 (breit, stark)
8,51 (mittel)
9,89 (mittel)
10,40 (schwach)
11,93 (mittel)
12,30 (schwach)
5) Farbe
6) Farbreaktion
Reagens
Enduracidin
Ergebnis
Ninhydrin-Reagens
Bartonsches Reagens (Gemisch aus gleichen Raumleilen l%igem wäßrigem Eisen(lll)-chlorid und l%igem wäßrigem Kaliumferricyanat
Dragendorffsches Reagens
Alkalisches Kaliumpermanganat
(A) positiv (blaß braunlich-violett)
(B) dto.
(A) positiv (blaßblau)
(B) dto.
(A) positiv (orange-gelb)
(B) dto.
(A) Verfärbung tritt ein (Reduktion)
(B) dto.
7) Schmelzpunkt -· · - - -
A: 205-2250C (Sinterung) 225-24O0C (Zers.) B: 215-2200C (Sinterung) 235-245°C (Zers.)
8) Löslichkeit
(A) ist leicht löslich in Pyridii^N^-DimcthylPormamid,wäßrigerSVoigerNIKKOLHCO-SO-Lösungieinoberliächenaktivcs Agens, bestehend aus »Polyoxyethylen (50 mol) Addukt von hydrogeniertem Rizinusöl«), verdünnter Säure, wäßriger alkalischer Lösung (unter Zersetzung) und löslich in wäßrigem Methanol, wäßrigem Ethanol, wäßrigem Aceton und wäßrigem Butanol, jedoch unlöslich oder schwerlöslich in Wasser, absolutem Ethanol, reinem Butanol, reinem Aceton und anderen neutralen organischen Lösungsmitteln.
(B) ist leicht löslich in Wasser, Methanol und löslich in Ethanol, jedoch unlöslich in Aceton, Ether und anderen neutralen organischen Lösungsmitteln.
9) Rf-Wert (Papierverteilungschromatographie)
Bei der Papierverteilungschromatographie unter Anwendung der aufsteigenden Methode auf Whatman-Filterpapier Nr. 1 wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Lösungsmittel
Rf-Wert (A = B)*)
Essigsäure-n-Butanol-Wasser (1 : 4 : 5) n-Butanol, mit Wasser gesättigt Pyridin-n-Butanol-Wasser (3:4:7)
0,45 ±0,1**)
0,0
0,80 ± 1
*) Für A und B wird der gleiche Rl'-Wert Festgestellt.
**) Die Substanz wird unter neutralen Bedingungen leicht an Filterpapier absorbiert.
10) Stabilität
(A) und (B) sind ziemlich stabil in Methanol und saurer Lösung, aber die antibiotische Wirksamkeit verschlechtert sich auf V5 bis '/|0 bei 42-stündiger Lagerung in alkalischer Lösung bei 400C.
Toxizität
Die mittlere letale Dosis (LF50) von (A) im Gegensatz zur akuten Toxizität beträgt bei Mäusen wenigstens 880 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Behandlung und wenigstens 66 mg/kg Körpergewicht bei intravenöser Verabfolgung.
Bei Ratten beträgt die mittlere letale Dosis (LD50) von (A) im Gegensatz zur akuten Toxizität wenigstens 300 mg/kg Körpergewicht bei intravenöser Verabfolgung.
12) Antibiotisches Spektrum
Die antibiotische Wirkung von Enduracidin gegen die verschiedenen Mikroorganismen wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode gemessen. Die als Testorganismen verwendeten gram-positiven oder gram-negativen Bakterien wurden auf Bouillon-Agar 20 Stunden bei 37° C gezüchtet. Bei säurefesten Bakterien wurde Glycerinbouillon-Agar verwendet. Die Bebrütung wurde 40 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Im Falle von Pilzen oder Hefe wurde Glucosebouillon-Agar als Nährmedium verwendet. Die Bebrütung wurde 40 Stunden bei 28° C durchgeführt.
Das antimikrobische Spektrum von Enduracidin ist nachstehend in Tabelle 2 in der hemmenden Mindestkonzentration angegeben. Wie Tabelle 2 zeigt, besitzt Enduracidin starke antimikrobe Wirkungen gegen grampositive und säurefeste Bakterien.
Die hemmende Mindestkonzentration gegen Bakterien, bestimmt bei 37°C auf TSA-Kultur, die Rinderblutserum enthält, bei einer Bebrütungsdauer von 20 Stunden ist in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Testbakterien
Hemmende Mindestkonzentralion (Mikrogramm/ml)
Staphylococcus· aureus 209 ρ Streptococcus pyogenes E-14 Streptococcus pyogenes Dick Streptococcus pyogenes S-8 Streptococcus pyogenes Ni-5 Streptococcus-viridans sp. Diplococcus pneumoniae-I Diplococcus pneumoniae-ll Diplococcus pneumoniae-lll Corynebacterium diphtheriae
2,5 0,78
1,25 0,78
1,25 0,78
1,25 0,78
2,5 1,56
1,25 1,56
1,25 0,78
0,625 0,78
1,25 0,78
0,625 0,78
Tabelle 2
Testbakterien Hemmende Mindestkonzentration
(J4ikrogramm/ml)
Escherichia coli >100
Proteus vulgaris >10Q
Staphylococcus aureus 0,1
Bacillus subtilis 0,1
Bacillus cereus 0,5
Bacillus brevis 1,0
Sarcina lutea 0,2
Micrococcus llavus 0,05
Mycobacterium avium 5,0
Mycobacterium avium, streptomycinrestistent 5,0
Mycobacterium avium, neomycinrestent 5,0
Mycobacterium sp. ATCC 607 5,0
Mycobacterium phlei 5,0
Mycobacterium smegmatis 2
Piricularia cryzae >100
Aspergillus niger >100
Penicillium notatum >100
Candida albicans >100
Saccharamyces cerevisiae >100
Die physiologische Acidität oder Basizität von Enduracidin wurde nach der Strichmethode in einer Agarschale gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Wie aus diesen Werten ersichtlich ist, zeigt Enduracidin auf basischen Testmedien eine viel stärkere Wirksamkeit als auf neutralen oder sauren Medien. Dies bedeutet, daß Enduracidin zu den sog. physiologisch basischen Substanzen gehört.
Tabelle 3
Einfluß von pl !-Änderungen auf die antibiotische Wirksamkeit von Enduracidin
Testbakterien pH Hemmungszone, mm
; ■ : —
Bacillus subtilis Mycobacterium avium
In den folgenden Beispielen ist die Erfindung (oder Teile davon) beschrieben. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.
Beispiel 1
■ Streptomyces fungicidicus IFO 12439 wird mit einer Platinöse von Glucose-Asparagin-Schrägagar auf je ml von wäßrigen Kulturmedien übergeimpft, die in 2-1-Kolben gehalten werden. Die wäßrigen Medien enthalten 2% Glucose, 3% Stärke, 1% Maisquellwasser, 1 % Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat. Sie sind vorher auf pH 7 eingestellt und 20 Minuten bei 1200C mit Hochdruckdampf sterilisiert worden. Die Kulturmedien werden unter Schütteln (120 Zyklen/Min., 10 cm) 24 Stunden bei 28°C bebrütet.
Von der erhaltenen Kulturbrühe wird 11 der Vorfermentation in 301 Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung in einem 50-1-Tank 24 Stunden bei 28°C unter Rühren (280 UpM) und Belüftung (45 l/Min.) unterworfen. Die so erhaltene Vorkultur wird weiterhin 96 Stunden bei 28°C in 5001 eines wäßrigen Kulturmediums, das 1% Glucose, 2% Stärke, 1% Maisquellwasser, 1% Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat enthält, in einem 1000-1-Tank aus nichtrostendem Stahl unter Rühren (160 UpM) und Belüftung bei einer Luftzufuhr von 750 l/Min, während der ersten Hälfte der Fermentationsdauer und 500 l/Min, während der letzten Hälfte der Fermentation bebrütet, wobei etwa 1,5 kg Siliconöl als Antischaummittel verwendet werden. .
Änderungen des pH-Wertes und der antibiotischen Aktivität sind als Agar-Verdünnungseinheit nach verschiedenen Bebrütungszeiten in der folgenden Tabelle angegeben.
■ ■ ■ 11 ■..■;.
U 11,5
13 12
0 0
0 0
pH 16 17 881 B**) Mycel
(Einheit)
St*)		 B**)
Bebrütungszeit Kulturfiltrat
(Einheit)
St*)
Sakaguchi-Kolben 6,15 - - -
(Impfmaterial) 7,05 - - - -
Vorkultur (30) 7,05 - - -
0 6,28 - - - -
18 6,70 - - -
24 -
Hauptkultur 7,05 - - -
(5001) * 7,05 - - - -
0 6,75 - - - -
18 7,16 - 10 > 10> 10
30 7,36 10> 10 > 20 20
42 7,55 10 > 35 350 350
54 7,70 35 50 350 350
66 8,05 50 75 750 750
78 7,93 75 100 1000 1000
90 100
*) Staphylococcus aureus
**) Bacillus subtilis
Beispiel 2
Von den in Beispiel 1 genannten Kolben wird nach Belieben 11 einer Impfkultur in 301 eines wäßrigen Kulturmediums überimpft, das 2% Glucose, 3% Stärke, 1% Maisquellwasser, 1% Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton, 0,3% Natriumchlorid, 0,5% Calciumcarbonat und 0,2% Natriumglutamat enthält. Anschließend wird 96 bis 120 Stunden bei 28°C unter Belüftung (45 l/Min.) und Rühren (280 UpM) fermentiert, wobei Siliconöl als Antischaummittel verwendet wird.
Änderungen des pH-Wertes und der antimikrobischen Wirkung sind als Agar-Verdünnungseinheit nach verschiedenen Bebrütungszeiten in der folgenden Tabelle angegeben.
Bebrütungszeit pH Kulturfiltrat
(Einheit)
St*)		 B**) Mycel
(Einheit)
St*)		 B**)
0 7,25 _ — _
18 6,95 - - - -
30 6,81 10 > 10 > 10 > 10 >
42 7,00 10 > 10 > 10> 10 >
54 7,30 35 20 150 150
66 7,52 35 20 150 150
78 7,62 35 35 350 350
90 7,59 500 500 1500 1500
102 7,70 500 500 2000 2000
114 7,90 500 500 2000 2000
*) Staphylococcus aureus
·*) Bacillus sublilis
. - ■■ · · ■ ' Beispiel 3
Durch Filtration von 5001 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe werden 100 kg nasses Mycel von 4001 Kulturfiltrat abgetrennt. Das nasse Mycel wird zweimal mit je 300 1 70%igem wäßrigem Aceton unter Rühren 3 Stunden extrahiert. Die Acetonschichten werden vereinigt. Ihre antibakterielle Wirkung entspricht 200 bis
350 Einheiten/ml gegen St. aureus. Nach Einstellung auf pH 5 bis 6 mit 4n-Schwefelsäure wird das Aceton unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 2001 wäßrige Lösung zurückbleiben. Die wäßrige Lösung wird mit 4n-Schwefelsäure auf pH 3,0 eingestellt. Zur eingestellten sauren Lösung werden 701 Ethylacetat gegeben. Das Gemisch wird gerührt und stehengelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die Ethylacetatschicht wird entfernt und die wäßrige Schicht (die eine gewisse Menge einer Fällung enthält) herausgenommen und mit 4n-Natriumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf zweimal mitje 901 n-Butanol extrahiert. Die n-Butanollösungen, die eine Wirkung von 150 bis 200 Einheiten/ml gegen Staphylococcus aureus zeigen, werden vereinigt und mit 901 destilliertem Wasser gewaschen. Die so behandelte Butanollösung wird zweimal mit je 501 n/200-Salzsäure extrahiert. Die Salzsäurelösungen werden vereinigt und mit 4n-Natriumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf zweimal mitje 501 n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolschichten werden vereinigt, mit 501 destilliertem Wasser gewaschen und zweimal mitje 151 n/200-Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Die salzsauren wäßrigen Schichten werden vereinigt, mit 4n-Natriumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und unmittelbar anschließend zweimal mitje 151 n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolschichten werden vereinigt und zweimal mitje 101 destilliertem Wasser gewaschen. Zur so behandelten n-Butanolschicht wird destilliertes Wasser in einer Menge von 1A des Volumens der Schicht gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 700C eingeengt, bis das verbleibende Butanolvolumen 200 ml beträgt. Während der Einengung wird die Ausfällung des erfindungsgemäßen Produkts festgestellt. Zum Konzentrat werden etwa 21 Ether (peroxydfrei) gegeben. Die sich bildende Fällung wird zusammen mit der bereits vorhandenen Fällung abfiltriert und mit Ether gewaschen, wobei etwa 3,5 g einer rohen pulverförmigen Substanz erhalten werden, die eine antibiotische Wirkung entsprechend 5000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus hat.
Zu 4001 des im ersten Absatz dieses Beispiels genannten Kulturfiltrats werden 4n-Schwefelsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 3,0 und anschließend 1501 Ethylacetat gegeben. Das Gemisch wird gerührt und dann einige Zeit stehengelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die wäßrige Schicht wird entfernt und mit 4n-Natriumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf mit 100 1 n-Butanol versetzt. Das Gemisch wird gerührt und dann einige Zeit stehengelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die n-Butanolschicht wird mit etwa 501 destilliertem Wasser gewaschen und dann zweimal mitje 151 n/200-Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Die Salzsäureschichten werden vereinigt, mit 4n-Natriumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf mit 101 n-Butanol versetzt. Das Gemisch wird zur weiteren Extraktion gerührt und dann stehengelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die n-Butanolschicht wird abgezogen und zweimal mit destilliertem Wasser in einer Menge gewaschen, die Va des Volumens der n-Butanolschicht entspricht.
Zu der gewaschenen n-Butanolschicht wird destilliertes Wasser in einer Menge von 1A des Volumens der Butanolschicht gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 700C eingeengt. Das Konzentrat wird in der gleichen Weise wie das im ersten Absatz dieses Beispiels genannte Mycel aufgearbeitet, wobei etwa 0,5 g einer rohen pulverförmigen Substanz erhalten werden, die eine antibiotische Wirkung von 5000 bis 7500 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus hat.
Beispiel 4
Durch eine Säule, die mit 1 kg Aktivkohle für Säulenchromatographie gefüllt ist, die einer Vorbehandlung mit Salzsäure unterworfen worden ist, werden 1001 einer sauren Lösung geleitet, die den Wirkstoff enthält, der durch Extraktion mit n-Butanol gemäß Beispiel 3 erhalten wurde. Hierbei werden 701 einer fast farblosen Fraktion erhalten, die den Wirkstoff enthält. Die Fraktion wird durch eine Säule geleitet, die mit 21 Amberlite IR-45 bei F/V 5 gefüllt ist, wobei eine leicht basische wäßrige Lösung erhalten wird. Die wäßrige Lösung wird bei verhältnismäßig niedriger Temperatur unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Zugabe von n-Butanol zum Konzentrat wird das Gemisch gerührt, um den Wirkstoff in die n-Butanolschicht zu überführen. Zur n-Butanolschicht wird ebenso wie in Beispiel 3 peroxydfreier Ether gegeben, wodurch der Wirkstoff in freier Form ausgefällt wird, oder zur n-Butanolschicht wird 1-normale Salzsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 4,5 gegeben. Auf diese Weise werden 1,8 g einer pulverförmigen Substanz, deren antibiotische Wirkung 7500 bis 10 000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus entspricht, bzw. 1,9 g einer pulverförmigen Substanz mit einer antibiotischen Wirkung entsprechend 7500 bis 10000 Einheiten/mg erhalten.
Beispiel 5
In einem Gemisch von 500 ml Methanol und 1 ml 1-normaler Salzsäure wird 1 g der gemäß Beispiel 3 bzw. Beispiel 4 hergestellten rohen pulverförmigen Substanz gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 10 g Aktivkohle für Säulenchromatographie gefüllt ist. Nach Behandlung mit einem Gemisch von 4 ml n/10-Salzsäure und 100 ml Methanol wird die Säule mit Methanol gewaschen, wobei 1,51 Flüssigkeit ablaufen, die den Wirkstoff enthalten. Die abgelaufene Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit Aceton-Ether bei verhältnismäßig niedriger Temperatur versetzt, wobei eine weiße Fällung gebildet wird. Die Fällung wird abfiltriert und mit Ether gewaschen, wobei 500 mg Produkt (Hydrochlorid) erhalten werden. Die antibiotische Wirkung der Fällung entspricht 15000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus.
In 100 ml 20%igem wäßrigem Methanol werden 100 mg der Fällung (Hydrochlorid) gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von 5 ml Amberlite IR-45 bei F/V 3 geleitet. Die Säule wird mit Methanol gewaschen. Die ablaufende Flüssigkeil wird eingeengt. Der Rückstand wird gefriergetrocknet und anschließend mit Aceton- · Ether gewaschen, wobei 80 mg eines weißen Pulvers (freie Form) erhalten werden. Die Fällung zeigt eine antibiotische Wirkung entsprechend 15000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus.
Beispiel 6
Durch Filtration werden von 161 des gemäß Beispiel 7 erhaltenen Kulturfiltrats etwa 4 kg nasses Mycel abgetrennt. Das Mycel wird mit dem vierfachen Volumen einer 70%igen wäßrigen schwefelsauren Acetonlösung 4 Stunden unter Rühren bei etwa pH 2 extrahiert. Nachdem 161 wäßriger Acetonextrakt (3500 Einheiten/ml gegen Staphylococcus aureus) mit Natriumhydroxyd auf pH 8 bis 8,4 eingestellt worden sind, werden zum wäßrigen Acetonextrakt 160g Aktivkohle und 160g Hyflo Super CeI gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt. Nach Filtration wird die Aktivkohle mit Aceton in einer Menge, die dem lOfachen Volumen des FiI-trats entspricht, und dann mit dem lOfachen Volumen Methanol gewaschen. Die so behandelte Aktivkohle wird
to mit dem 20fachen Volumen einer sauren wäßrigen Acetonlösung 3 Stunden unter Rühren extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und auf pH 5 eingestellt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bleiben 1,51 wäßrige Lösung zurück. Die Lösung wird durch eine Kolonne, die mit 200 ml des Ionenaustauschharzes Amberlite IR-120 (H) gefüllt ist, und dann durch eine Kolonne, die mit 200 ml Amberlite 1R-45 gefüllt ist, geleitet und unter vermindertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Nach Vermischung mit 51 Wasser wird das Gemisch auf pH 8,5 eingestellt und dreimal mit 1A seines Volumens an n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolschicht wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck unter Zugabe von Wasser eingeengt, wobei 500 ml einer wäßrigen n-Butanollösung zurückbleiben. Zur Lösung werden 51 Ether gegeben, wobei eine Fällung abgeschieden wird, die abfiltriert und getrocknet wird. Hierbei werden 4g pulverförmiges rohes Enduracidin erhalten. Dieses Produkt zeigt eine Wirkung entsprechend 10000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus.
Beispiel 7
In zwei 2-1-Kolben werden je 500 ml eines Kulturmediums gegossen, das aus 2% Glucose, 3,5% Maisquellwasser, 1,5% Calciumcarbonat und Wasser besteht. Das Medium wird mit Streptomyces fungicidicus IFO-12 440 geimpft und 2 Tage bei 280C unter Schütteln auf einer Schüttelmaschine bebrütet, wobei ein Vorimpfmedium erhalten wird. In einem 50-1-Tank werden 301 eines wäßrigen Kulturmediums, das aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1% Maisquellwasser, 1% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,5% Pepton, 0,5% Calciumcarbonat und Wasser besteht und auf pH 7,0 eingestellt ist, mit der erhaltenen Vorimpfkultur geimpft. Das geimpfte Medium wird bei 28°C unter Bewegung und Belüftung (30 l/Min.) bebrütet. Der Fortschritt der Fermentation innerhalb von 90 Stunden ergibt sich aus der folgenden Tabelle.
0 7,05 < 10
18 7,00 < 10
30 7,10 < 10
42 7,35 50
54 7,82 350
66 7,82 1000
78 7,84 1500
90 7,84 1500
Bebrütungszeit pH-Wert Wirksamkeit der ganzen
•35 der Brühe Brühe (Verd.-Einheiten/ml)
Vergleich der antibakteriellen Aktivität zwischen Enduracidin
und anderen bekannten Antibiotika vom Polypeptid-Typ
Tabelle 1
Testorganismus hemmende Mindestkonz. (mcg/ml) Gramicidin Bacitracin
Enduracidin 3,12-25 12,5 -25
Staphylococcus aureus 0,39-0,78 12,5 0,78
Streptococcus pyogenes <0,19 50 12,5 - 2
Streptococcus mitis 0,78 3,12-12,5 12,5 -25
StreptQCOccus faecalis <0,19 12,5 -25 0,78
Diplococcus pneumoniae <0,19 12,5 0,39- 0,78
Corynebacteriaceae diphtheriae < 0,19-1,56 6,25 100
Bacillus anthracis <0,19 3,12 100
Bacillus subtilis <0,19
Tabelle 1 zeigt, dal-i Enduracidin eine stärker antibiotische Aktivität gegen gramposilive Organismen aufweist als die bekannten Antibiotika vom Polypeptid-Typ.
Vergleich der antibakleriellen Aktivität in vivo /wischen Enduracidin und bekannten handelsüblichen Antibiotika 5
Testmethode: Mäuse weiden mit Staphylococcus aureiis geimpft. Nachdem die Infektion gut fortgeschritten ist, erfolgt die Vergabe der Antibiotika subkutan, intraperitoneal, intravenös oder oral. Die ED50 wird berechnet aus der Überlebensrate nach 7 Tagen. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2.
Tabelle 2 zeigt, daß Enduracidin bei intraperitonealer Vergabe 4- bis 8mal wirksamer als Erythromycin gegen Staphylococcus aureus ist, während es bei intravenöser Vergabe 6mal wirksamer ist als Tetracyclin und lOOmal wirksamer ist als Erythromycin.
Auf die gleiche Weise wie oben beschrieben werden Mäuse mit Streptococcus pyogenes und Diplococcus 30 pneumoniae infiziert. Die ED.su befindet sich in Tabelle 3.
Tabelle 3
Antibiotika Infektion mil Streptococcus pyogenes Infektion mil Diplococeus pneumoniae 35
(intraperiloneal) (intraperitoneal)
1'Dm, mg (l'olen/.)/kg KD-,,, mg (Polenz)/kg '
s. c. i. p. i. v. p. o! s. c. i. p. i. v. p. o.
Tabelle 2 inliaperitoneale Infektion i. v. p. o. intravenöse Infektion i. v. 1,11 p. o.
Antibiotika ED.sii mg (Polcnz)/kg 1,65 > 100 ED50 mg (Poten/.)/kg > 100 > 100
s. c. i. p. 5,0 > 100 s. c. i. p. 17,7 > 100
4,82 0,193 1,1 15,6 1,7 1,25 >100
Enduracidin 21,9 1,53 > 100 > 100
Erythromycin 2,7 0,33 14,7 6,25
Chlortetracyclin
s. c. subkutan
i. p. inlraperitoncal
i. ν. - intravenös
ρ. ο. per os
Enduracidin 0,082 0,022 0,081 100 0,71 0,22 0,65 100
Erythromycin 1,12 0,149 1,4 56,1 100 10,1 100 40,1
Chlortetracyclin 3,1 0,22 1,8 17,4 11,9 37,9 . 77,1 100
Tabelle 3 zeigt, daß Enduracidin 7- bis 35mal stärker gegen Streptococcus pyogenes und sogar mehr als lOOmal stärker gegenüber Diplococcus pneumoniae als Chlortetracyclin und Erythromycin ist.
LD>(i: Die LD50 von Enduracidin (intramuskulär, Maus oder Ratte) ist größer als 5000 mg/kg.
Überkreuzresistcnz:
Die Überkreuzresistenz zwischen Enduracidin und anderen Antibiotika wurde an Staphylococcus aureus 209P untersucht, der gegenüber Enduracidin, Erythromycin, Penicillin G, Cephaloridin bzw. Chlortetracyclin durch Reihenzüchlungen in Trypticase-Soja-Kulturmedium, das steigende Mengen der genannten Antibiotika 55 enthält, resistent gemacht wurde. Die Versuchsdaten der folgenden Tabelle 4 wurden nach der Agar-Verdünnungsmcthode erhallen. ,
Tabelle 4
Organismus hemmende Mindestkon/entraliori in meg/ml
Enduracidin Erythromycin Penicillin G Cephaloridin Chlor- .
tetracyclin
Staphylococcus 0,78 0,39 0,09 0,09 3,12
aureus 209P ·
(Ellern)
1 ς
Tabelle
Organismus
hemmende Mindestkonzentration in mcg/ml Enduracidin Erythromycin Penicillin G
Cephaloridin
Chlortetracyclin
R-Enduracidin 50 0,39 0,09 0,09 3,12
R-Erythromycin 0,39 400 0,09 0,09 3,12
R-Penicillin G 0,78 0,39 100 25 0,78
R-Cephaloridin 0,39 0,39 400 400 0,39
R-Chlortetracyclin 0,78 0,39 0,09 0,09 25
Enduracidin behält seine volle Wirksamkeit gegen Mikroorganismen, die gegenüber den Vergleichsanlibiotika resistent sind. Umgekehrt bleibt der gegenüber Enduracidin resistente Organismus empfindlich gegenüber den anderen Antibiotika.
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen
16

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Antibiotikum Enduracidin, erhältlich dadurch, daß man Streptomyces fungicidicus IFO 12439 oder IFO 12440 in einem Medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Slickstoffquellen und andere notwendige Nährstoffe enthält, das Mycel von der Kulturlösung abtrennt, mit Wasser wäscht, zweimal unter neutralen oder sauren Bedingungen mit 50- bis 70%igem wäßrigem Aceton in der 3- bis 4fachen Volumenmenge des Mycels 3 Stunden bei Raumtemperatur extrahiert, das Filtrat nach Einstellung auf pH 5 bis 6 im Vakuum durch Abdestillieren des Acetons einengt, worauf man es mit Schwefelsäure auf pH 3 einstellt, dann nach Zugabe von Ethylacetat in einer Volumenmenge von einem Drittel des Konzentrats
ίο schüttelt, die wäßrige Schicht, die sich von der Ethylacetatschicht abscheidet, mit Natriumhydroxid,
Natriumcarbonat oder Natriumcarbonat auf pH 8 einstellt, anschließend mit n-Butanol in einer Menge von einem Drittel des Gesamtvolumens extrahiert, nach Wiederholung der Extraktion mit n-Butanol die n-Butanolschicht mit Wasser in einer Menge von '/2 des Gesamtvolumens wäscht, dann mit n/200 HCl wäscht, die wäßrige Lösung der vorstehend beschriebenen Extraktion mit n-Butanol unterwirft, die Extraktion mit wäßriger Salzsäurelösung und mit n-Butanol wiederholt, die n-Butanolschicht einer Einengung unterwirft, mit Wasser wäscht, weiter unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur einengt, wobei das n-Butanol abdestilliert, zum Konzentrat Ether in einer Menge zugibt, die Vio des Butanols entspricht, die dabei gebildete gelblich-braune Fällung abfiltriert und mit Ether wäscht.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Enduracidin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Anspruch 1 angegebenen Maßnahmen in der dort aufgeführten Reihenfolge durchführt.
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