DE1617881A1 - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums

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DE1617881A1
DE1617881A1 DE19661617881 DE1617881A DE1617881A1 DE 1617881 A1 DE1617881 A1 DE 1617881A1 DE 19661617881 DE19661617881 DE 19661617881 DE 1617881 A DE1617881 A DE 1617881A DE 1617881 A1 DE1617881 A1 DE 1617881A1
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enduracidin
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Description

Pafenlnnwä'»» ■
Dr.-Ing. von KraMer Dr.-Ing. Schonwt Dr.-Ing. Th. Meyer Dr. Fues I.
■ Κδίη, {Mchmannhaus .
3O0 September 1966 Fu/Ax
Takeda Chemical Industries.,Ltd»
27^ ."Doshcmachi 2-chome., Higashi-ku, Osaka (Japan)»
Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums,,
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums durch Züchtung von Mikroorganismen.
Im Laufe ihrer Untersuchungen hat die Anmelderin gefunden:
1) Es gibt Mikroorganismen* die das neue Antibiotikum zu bilden vermögen.
2) Die .Mikroorganismen., die das Antibiotikum zu bilden "vermögen,, gehören zur Gattung "Streptomyees'O
3) Das Antibiotikum wird angereichert, wenn die Mikroorganismen gezüchtet werden,'
Ψ) Das angereicherte Antibiotikum kann in der gewünschten Reinheit aus der Kulturlösung unter Ausnutzung der physi-
3ξ kalisch-ehemischen Eigenschaften des Antibiotikums isoliert werden.
5) Das Antibiotikum ist sehr wirksam, gegen gram-positive und ■ säurefeste Bakterien. ·
Das neue Antibiotikum wurde als "Enduracidin" bezeichnet.
Nach dem Verfahren·gemäss der Erfindung werden Mikroorganismen, die zur Gattung Streptomyces gehören und Enduracidin zu bilden vermögen., verwendet. Zu diesen Mikroorganismen gehört beispielsweise ein Variant von Streptomyees fungicidicus-, Streptomyces fungicidicus Nr, B 52t77IFO-l'2439
Λ "'"I ·
'V' ■■ ·-:·■ -^jL/:*v
(ATCC-2'CT13.J·.- der vom Eoden bei llishinoniya, Japan* isoliert wurde und von. den Erfindern die vorstehende Bezeichnung erhielt?
Die mikrobischen Eigenschaften von Streptoinyces fungieidicus Nr,B 5477 (ATCC-21013} sind nachstehend aufgeführt. Hierbei basieren die mit "Rdgc" gekennzeichneten Farbbeseichnuiigen auf Ridg\vayrs Color Standard and nomenclature^
Die Sporophoren bilden Spiralen« Die Sporen sind oval?
0=9 x 1,6 bis 1.1 ;λο Die Oberfläche der Sporen ist stachelig,,
l,i Czapek-Agar;
Vegetatives llycel (nachstehend als VM bezeichnet)'. Reichlich- sich ausbreitend; dringt in das Medium ein;. • farblos ο
Luftmycel (nachstehend als LM bezeichnet;; Reichlich, pulverförmig; graubraun (Rdg= LI, 1 ; -" ' ' '■ ) Rückseite (nachstehend als R bezeichnet^: Lebhaft braungelb (Rdg, XV, 17 χ-ύ)-.
lösliches Pigment (nachstehend als LP abgekürzt)? Kicht vorhandene
2)· Glucose-Czapek-Agar: ;
VM: Reichlich» sich.ausbreitend, farblos-
LM; Reichlich, pulverförmig, blass graubraun \
(HdcXI, i;"*'-d) .
Rs Lebhaft braun-gelb,
LP: Nicht vorhanden oder schwach gelb
3) Glycerin~Czapek#-Agar;
VM: Reichlich; faltig3 farblos ■
LM; Reichlich, tief olivgrau (Edg0LI5 23'"")? wird hell mausgrau (Rdg.LIj 15! " 'J-^)bis hell graubraun (Rdgc LI5 1f3"<-b)o
Rs Lebhaft braungelb .
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LP; Sicht vorlianden oder schwach gelb.
4-) Glucose-Asparagin-AgaiB:
VM; Reichlich, sich ausbreitend5 farblos,; LM; Reichlich;,, hell olivgrau (RdgoLl 23IMfl~d) bis bleß -graubraun (RdgtLI- 1r!i;:5-d) oder zuweilen schmutzig weiße
.R; Crenefarbig (Rdgc XVlr 19E~f) oder farblos, Nicht vorhanden
5) Pouillon:
VM; Reichlich; schwimmt auf der Oberfläche des Mediums;
ein geringer Teil des Mycels sinkt zu Bodem ILI; Reichlich, weiß ο
!Durchsichtiges Medium, kein lösliches Pigment*
6. !Bouillon-Agar s
VIIs Reichlich, sich ausbreitend= farblos^ LLI; Mäßig, weiß bis blass graubraun-S; Lebhaft braungeib (Rdgc X.T, 17n-d) LPs Mehl vorhanden
• .- Gluccseccxiillon-Agars
VMj Reichliche faltig- sich ausbreitend; farblosβ LK? Reichlichs tief graubraun (Edg; LI 1:ftl--i)c R; Gelb-ccker (Rag, XV5, "IV") LP? Scliv/aohbraun oder nicht vorhanden=
8; Griyserinljcuillon-Agarg
?M; Reiohlich5 sich au s"b reit end; farblos,. LMs Reichlich,- pulverförmig.- graubraun bis" tief graubraun .
Hs Isabella-Farbe (Rüg, XXX. 19i;-.1) LP? Eicht vorhanden oä,er schwach braun*
9} Stärke-Agar:
¥13; Reichliche sich ausbreitend; farblose EJs Heiehlich,. hell graubraun (RdgtLIs "! — '-'«-b^ wird graubraun=
Es Hell braungerb (Rägo Xv. l7:-f)
Seil 12/ 1197
LP? Nicht vorhandene
10) Eis
VIl; Reichlich, sich ausbreitend; faltig ο LLI: Mäßig« weiß, bis weiß mit gelblichem Stich und zuweilen schmutzig weiß. Die Farbe des Mediums wechselt nach gräulieh-weiß bis braunc
11) Hefeextrakt-Agar:
VIIs Reichlich, faltig, sich ausbreitend, farblos« LlIs Reichlich, pulverförmig« hell mausgrau '
(Rdgc LI, I5tf'"-b) bis graubraun» R: Isabella-Farbe
LPj Nicht vorhanden*
12) Kartoffel:
VLIs Reichlich, sich ausbreitend« erhöhtp farblosc LlI? Reichlich, graubraun.
Die Farbe des Mediums wird nach 3 Wochen dunkelbraun C
13) Milchj
VIIs Reichlich, faltig, schwimmt auf der Oberfläche des Mediums; farblos*
LMs Reichlich- weiß bis perlgrau (RdgoLIIj 35!i"'-f) Starke Peptonisierung ohne Koagulierungo
14) Möhrenbreis
VHs Heiohlich; sich ausbreitend* erhöht s farbloso LMs Heiciilichj graubraun (Rdgclil, 1 "——)«■ Die Farbe des Breies ivird Euchthorü-braiin (Rdg«lY9i7"~£ )«
15) Gelatine?
VHo Spärlich'
ϊίΐι 3^iIx=XiCh5 ϊ?«1Α; laiigfiaae Ί'&τϊIussigung«
Π I / 1 I ά 1
' 17) Nitratreduktion in Czapek-Losung (enthaltend 0,1 i* NaITO,)
18)' Celluloses
VKs Reichlich, sich ausbreitend, farblos, IMs Reichlich, graubraun(Rdgο IjI, 1 f f r' f).» Keine Zersetzungο
19) Calciummaleat-Agar:
Viii Reichlich, sich ausbr e its ad, ^ünn*; SCnJTb LM? Mäßig* blass graubraun/bis blass mausgrau
R: Fahlgelb (Rdgo XVI, t9r"~ä). LP: Nicht vorhanden-oder blassgelb
20) QIyro3in-Agar:
VM: Spärlich} dünn? sich ausbreitend? farblos«, LM:' Nicht vorhanden ·
R: Parblos
LPj Nicht vorhanden
" 21) Peptoh-Agar:
VlI: Reichlich, sich ausbreitend? flach, farblos.. LM: Spärlich, schmutzig grau* (Rdg.XLVI517':!T-b) R: Schwach cremefarbig (Rdgo XVI, 1-9.'-f) LP: Nicht vorhanden
22) Stärke-Casein-Agar:
VH: Reichlich, sich ausbreitend, flach., farblos,, LM: Reichliehj samtartig, "tief mausgrau
(Rdgo LI, I5ri:f:-i) -
Rj Hell olivgrau (Rdg«, LI, 23MflI-d) LBs Nicht vorhanden
23) Kaltose-Irypton-Agar:
VMi Reichliohj sich ausbreitendj flach, farbloS0 >* LMr Reichlieh, mausgrau/Bisg|raubraun (Rdg0LI., 1-»"*) Hi HeI^. Uraungelb (Rdg, XV, 17t:-f) ItBt Nicht vorhanden oder schwach gelb
24J Eennett-Agar;
VLI; Reichlich, sich ausbreitend- flach; dünn, farblos
LIIj Reichlich, graubraun bis tief graubraun (Rdg. LI. H '" *-i)
Rs Farblos bis lebhaft braungelb (Rdg,XV- I7:~ä) LP; Nicht vorhanden
25) Hydrolyse von Stärke: Hydrolyse^
Encymatische Zone/ V/achstuiaszone= 3 J mm/10 mm oder
28 mm/1 J mm
Ο, Ausnutzung der Kohlenstoffquellen; ermittelt nach der
jrridham-Gottlieb-IIethode:
Erythrit j_ Melibiose ++
Adonit _h Maltose
S-Sorbit + Saccharose
L-Inosit +++ Lactose
D-Mannit +++ Raffinose
DuIcit + Trehalose
D-XyIose +++ Salicin
L-Araoinose +++ Aesculin
L-Sorbose + Inulin
D-Galaetose +++ Dextran
D-Grlucose ++ Katriuraacetat
D-Fructose +++ Katriumsuccinat
D-Mannose ++ Katriuncitrat
Rhamnose +++ * Kontrolle
Zeichenerklärung: +++ = starkes Wachstum; ++ = gutes Wachstum;
+ = mäßiges Wachstum; + = sehwaches Vfachs-
tum
Ein Vergleich der vorstehend hesehriebenen morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften mit den Beschreibungen in- »The Actinomyces» Band II, von SoA- Waksraattj, Herausgeber The Williams and Wilikins Company, 1961, zeigt, daß der für. die Zwecke der Erfindung geeignete Stamm insofern
' liehe morphologische Eigenschaften v/ie Streptomyces fungicidicus hat. als die Sporophoren Spiralen bilden, die Oberfläche der Sporen stachelig ist, das Luftnycel =sd=£^i grau fswi, kein lösliches Pigment gebildet wird und der Stamm ein nicht-chrcmogener Typ ist.«,- Es sind jedoch einige Unterschiede in den Kultureigenschaften zwischen dem Stamm und Streptomyces fungicidicus vorhandene Der letztere bildet nämlich ein rosafarbenes lösliches Pigment, wenn er auf Calciummaleat-Agai· gezüchtet wird und bewirkt schwache Koagulierung und Peptonisierung von Milch auf einem Llilchniediunu Jm. Gegensatz hierzu bildet der erfindungsgemäß verwendete Stamm dieses lösliche Pigment nicht. Wenn er lösliches Pigment bildet, ist dieses blassgelb und koaguliert die Milch auf Milchmediun nicht, sondern peptonisiert die lull eh so stark, daß die Peptonisierung innerhalb 1 Woche abgeschlossen ist.-. Ferner verwertet der erfindungsgemäß verwendete Stamm Fructose und Salicin. die von Streptoiayces fungicidicus nicht verwertet wordene
Darüber hinaus bildet Streptomyces fungicidicus Fungicidin, eine fungicide Substanz5 während der erfindungsgemäß verwendete Stamm diese fungicide Substanz weder in der Kulturflüssigkeit noch im Myeel bildet«
liach äsn vorstehend genannten Eigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten Stammes wurde er von den Erfindern als S+amm von Streptomyces fungicidicus eingestuft und als Streptomyces fungicidicus Hr*B 5477 "bezeichnet«,
Im Verlaufe der hochwirksamen Isolierung des Stammes wurde ein Mutant durch UV-Bestrahlung, Einwirkung von Ύ-Strahlen und MonoSporenkultur erhaltene Der Mutant bildet spiralförmige Spprophorens unä die Oberfläche der Sporen ist stachelig, v/ie dies beim Originalstamm der Fall ist* "Die KuItürmeiicmale des Mutasten sind nachstehend angegeben=
Kulturmerkmale vcn Streptcmyces fungicidicus Nr0 B 5477 Mutant.
Eine Frcte von Streptomyces fungicidicus Nr. B 5^77 wurde bei der American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A., unter der Nr. ATCC-21O3J5 und beim Instritue for Fermentation, Csaka. unter der Nr. IFO 112439 hinterlegt.
Cas nach der Strichmethede ermittelte antibakterielle Spektrum von Streptcmyces fungicidicus Nr. B 54-77 auf Eouillon-Agar und Glycerin-Bouillon-Agar ist in Tabelle 1 genannt. Streptomyces fungicidicus Nr. B 5477 wurde strichförmig auf ■Agarplatten geimpft und 4 Tage bei 280C bebrütet. Die Platten wurden dann senkrecht zum Strich ebenfalls strichförmig mit Testorganismen beimpft, die in Tabelle 1 genannt sind, worauf die Bebrütung bei J57°C 20 Stunden für gram-positive und gram-negative bzw. 40 Stunden für säurefeste Bakterien fortgesetzt wurde. Abschliessend wurde die Länge der Hemmzone für Jeden TestOrganismus gemessen.
Tabelle^
Antibiotisches Spektrum von Streptomyces fungicidicus Nr, B-5477 nach der Strichmethode
Hemmzone, mm
Bouillon- ■Agar Glycerin-Bouillon- 0 0
Agar 0 0
Escherichia coli 0 0 12 12
Proteus vulgaris 0 0 12 12
Staphylococcus aureus 0 0 0 O
Bacillus subtillus 0 0 0 0
Bacillus cereus 0 0 0 0
Bacillus brevis 0 0 0 O
Saccharomyces lutea 0 0 0 0
JMicrococcus flavus 0 0'
Mycobacterium avium 0 0
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass Streptomyces fungicidicus Nr, B-5477 antibiotische Substanzen bildet, die hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien wirksam sind.
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pie mikrobisehen Eigenschaften von Actinonyces, insbesondere der Gattung Streptoinyces. liegen nicht allgemein fest, und dies gilt auch für die Eigenschaften der Stämme, die Enduracidin bilden. Es gibt somit zahlreiche Ilutanten und Varianten von Streptomyces fungicidicus Nr. E-5477- Von den Mutanten und Varianten von Streptoinyces fungicidicus können ohne Rücksicht darauf, ob die Variation oder nutation natürlich oder künstlich beispielsweise durch Behandlung mit Röntgenstrahlen. Ultraviolettlioht cder durch Einwirkung chemischer Reagentien hervorgebracht wurde, alle diejenigen, die Enduracidin bilden, fürdas. Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden»
Beispielsweise kann der von Streptomyces fungicidicus Nr, E-5477 abgeleitete Mutant (A2GC-21Ol4)sder durch Behandlung mit Ultraviolettlicht, Y-Strahlung oder durch Monosporenisolierung des Y/ildstammes erhalten werden kamv für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, Eer Mutant (ISO-I2440) (ATCC-21OH) von Streptomyces fungicidicus Nr. E-5477 hat die folgenden mikrobischen Eigenschaften;
Ac Morphologische Eigenschaften: Gleiche Eigenschaften wie der \7ildstammo
jBe_ Merkmale. deivKulturgn
Der Mutant bildet farbloses oder gelbes vegetati:/es Mycel. bei den verschiedenen Kulturen und ein Luftmycel mit der gelben Farbe von Eleimonoxyd (Rdgr XVl?2C*-f) oder Senf (BdgtXVI, I9s-b)o Er bildet auf den meisten Kulturmedien kein lösliches Pigment und gelegentlich ein blassgelbes lösliches Pigmente
1) Ozapek-Agar: Vegetatives Mycel reichlich, sich ausbreitend; dringt in das Medium ein. blassgelb: Luftnycel reichlich, pulverförmig, cremefarben (Rdg, XVI "i9'-f/ bis Pale Cchraceous Buff (Rüg.-XV, 15^f)5 Rückseite cremefarben; lösliches Pigment nicht vorhanden oder blassgelb= *°
2) G-luoose-Czapek-Agar: VM reichlich, sich ausbreit end} farblo:.' bis i>iassge}6 LM mäßig, OUlverförmig, weiß bis
8-12/^9 7 BADQRiGINAL
Naple.3-gelb (,Rdg.XVI.-d} R= cremefarben bis senfgelb ;Rdg.XVl, "'9'-b;; LP: nicht vorhanden.
Glyoerin-Ozapek-Agar; VLI - reichlich, sich ausbreitend, faltig, .senf gelb; LLI - reichlich pulverförmig crer.e farben bis IT-ales-gelb; R - Light lichracecus Suff • Rag XV, 15 -d bis ^hraceous-Euff (Edg. XV : 15 !-b ■: LP - biassgeib.·
■'r GIu2cse-Asparagin-Agar: VLI - farblos bis senfgelb, sich ausbreitend; LLI = mäßig, samtartig- gelb wie Bleimon oxyd .Rdg.XVi. 2Λ '-f; bis senfgelb; R = gelb; LP = nicht . vorhanden
Bouillon-Agar: VLI - mäßig, sich ausbreitend, farblos; LLI - mäßig, pulverfünaig, weiß: R -- farblos; LP = nicht vorhanden.
Giucose-Iouillon-Agar: Vegetatives Liycei - reichlich, sich ausbreitend, farblos, faltig; LLI = mäßig, pulverförmig, weiß bis cremefarben: R = blassbraun; LP - nicht vorhanden-
'< ζ Glyjerinbcuillon-Agar: VLI = reichlich, sich ausbreitend, farblos, faltig: LLI - mäßig, pulverförnig- weiß: R = blassbraun; LP = nicht vorhanden.;
8. Stärke-lgar: VLI - reichlich, sich ausbreitend, 3enfgelbf dringt in das Medium ein; LLI = reichlich, pulverförmig Pale Ochraceous Euff {Rdg. XV, i5'-f) bis cremefarbene R = Eaples-geib bis Light Ochraceous-Salmon fRäg„7.V? "3 -dy. LP = nicht vorhanden oder schwachgeibs
Ganzes Ei; VLI = mäßig,- sich ausbreitend, Hapies-gelbj LLi -- nicht vorhanden oder sehr spärlich? v/eiß bis cremefarben. Farbe des LIediums ändert sich nicht-
10, Löffler-LIedium: VLI= reichlich, farblos, faltig; LLI = nicht .'ürhanden; LP = nicht vorhanden, starke Verflüssigung,
1"= Hefeextrakt-Agar: VLI= reichlich, sich ausbreitend» faltig, farblos bis schwachbraun: LM = reichlich= pulverförnig, cremefarben bis Naples-gelb; R = Antimongelb (Rdg,XV,
009812/1897 bad or,ginal
i./'-'b) bis Light» O^hraceous-Salmon; LP - nicht- vorhanden-. 12,Kartoff el: VLI- reichliche sich .ausbreitend- faltig.
antimongelb (Rdg-XV. IT-I);; LLl=- reichlich, pulverig.
weiß bis Light Oehraceous-Euff- las Medium färbt sich braun.
'.3ci,:öhrenbrei: VII = reichlich, faltig, Ochraceous-Iufft. J.V: -zuerst weiß, später Pale öchraceous-Euff bis Light Ochraceous-Salmon» Die Farbe des Mediums ändeit si ch nicht
14cBouillon; VH = spärlich, sinkt zu Boden, reichliches Wachstum, schwimmt an der Ouerfläche des Mediums; farblos bis blassbraun; LM = mäßig, pulverig; weiß; LP-nicht vorhanden.
15. Giueosebcuillon. Glycerlnbouillon:Ebenso wie auf Bouillon, Wachstum jedoch reichlicher und faltige
'.6 c Lacknusailchs "VLI = reichliches Wachstum, senfgelb schwimmt an der Oberfläche des Mediums5 ringförniges Wachstum, faltig; LLI = spärlichj v/eißj starke Peptonisiexung ohne Koagulierungc
Vic Kährgelatine: VLI = reichlich., ringförmig am Rand des Rohres, faltig, Ochraceous-Euff; LLI = mäßig., weiß bis cremefarben; kein lösliches Pigment; starke Verflüssigungc
'8. Ozapeklösung mit O72<fo NaITOTi ViI = mäßig, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, farblos; LM = mäßig, pulverig., weiß; LP = nicht vorhanden. Schwache ITitratreduktionc ^
19c Oellulose: 7I.I = mäßig., farblos bis cremefarben sich ausDi-eitend: LLl = mäßig, pulverigs weiß bis blass Oohraecous-Salmon«
20p Galciummaleat-Agar; VM = mäßig, farblos bis cremefarben bis O^hraceous-Buff j sich ausbx-eitend; LM = mäßig, pulverig: weiß bis blass Oohraceous-Salmon: R = cremefarben bis hell Ochraceous-Salmon? LP = nicht
0 0 9 812/1897 Bm
21.' Tyrcsin-Agar: VM = spärlich, dünn, farblos; LM = nicht . vorhanden! R = farblos, LP nicht vorhanden.
22. Pepton-Agar; VM = mäßig, sich ausbreitend, farblos; LM mäßig, pulverig, weiß bis blass Ochraceous-Buff (Rdg. XV, 15f-f)jR = farblos bis cremefarben; LP nicht vorhanden; nicht-ehromogener Typ»
2J. Hydrolyse von Stärke: Enzymatische Zone/Wachstumszone = 22 tr,m/ll mm oder 26 mm/lj5 mm.
C. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Gottlieb:
Erythrit Adonit D-Sorbit i-Inosit D-Mannit Dulcit D-Xylose L-Arabinose L-Sorbose D-Galactose D-Glucose D-Mannose Glycerin D-Fruetose
•H-i
++
Rhamnose Melibiose D-Maltose Saccharose Lactose Raffinose Salicin Aefsculin Inulin
Natriumacetat Natriumsucc inat:. Natriumcitrat Stärke Kontrolle -
+ = schwaches Wachstums + - Wachstum; ++ = mäßiges Wachstum; +++ = reichliches Wachstum
.".-■■ <■$-'■ ■ ■ Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird ein utaaKh, der Fndtiracidin bildet und zur Gattung Streptomyces gehört, in einem Medium gezüchtet, das assimilierbare Köfoienstoffquelleni verwertbare Stickstoffquellen und andere notwendige Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquellen eignen sieh beispielsweise Stärke, Glucose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Dextrin, Glycerin oder Hirsebrei: Als Stiek-
009812/189?
st äff quell en eignen sich beispielsweise Pentose, Sojabohnenmehl5 Maisquellwasser, Fleischextrakt, Aimsoniumsalze, organische oder anorganische StickstofVerbindungen« lerner kann eine geringe Menge anorganischer Salze,- z.«B. Äsrfe*fe*aChlorid, Phosphate. Salze von Metallen, wie Calcium,· Zinkj Mangan und Eisen» dom Medium zugesetzt werden.» Palis erforderlich, können übliche Nährelemente oder ein Antischaummittel, ZoB. tierisches Gl5 Wachs, pflanzliches öl oder Mineralöl; zugesetzt werden»
Pur die Züchtung des Enduracidin, bildenden Stammes ist die
oder die
submerse Schüttelkultur ss-ws* Verwendung eines flüssigen Kediums vorzuziehen» Gegebenenfalls kann jedoch auch die Züchtung in der stationären Kultur erfolgen. Die Züchtungsbedingungen, z„B» Temperatur, Fermentationsdauer und Pjr-Wert des Mediums, sind so zu wählen, daß die Bildung von Enduracidin maximal ist. In der Submerskultur ist die Bildung von Enduracidin im allgemeinen bei 25-450Cj etwa neutralem p„-\7ert und bei einer Dauer von etwa 3-10 Tagen maximale
Das hierbei gebildete Enduracidin ist zum größten Teil im Kycel, jedoch auch im flüssigen Teil der Kulturlösung enthalt enP Das in der Kulturbrühe angereicherte Enduracidin wird isoliert und in ge\/ünschter Reinheit nach Methoden hergestellt, bei denen die Eigenschaften von Enduracidin S0Bo Unterschiede zwischen Enduracidin und den Verunreinigungen hinsichtlich der löslichkeit, im Verteilungsverhältnis zwischen zwei Flüssigphasen, in der Adsorptionsfähigkeit oder in der lonenkohärenz ausgenutzt v/erden» Da Enduracidin nicht nur im Kyeel, sondern auch im flüss.i- " gen Teil der Kulturbrühe vorhanden ist, ist es für seine Isolierung zweckmäßig, zuerst das Mycel von der KuItürlösung abzutrennen und dann das Mycel und den flüssigen Teil der Kulturlösung, einem Trenn- bz\7„ Reinigungsverfahren zu unterwerfen« In der Praxis wird die Abtrennung bzw» Reinigung von Enduracidin vorteilhaft durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel vorgenommen» Die besten
Ergebnisse werden erhalten, wenn die Extraktion von Endura- eidin mit n-Eutanol unter basischen Bedingungen erfolgt • und anschliessend eine erneute Extraktion mit einer */ässrigen sauren Lösung vorgenommen wird.
Die Abtrennung oder Reinigung von Enduracidin kann unter Ausnutzung beispielsweise der folgenden Eigenschaften erfolgen: Es wird an Aktivkohle unter alkalischen Bedingungen (pH nicht unter etwa 8,0) adsorbiert: es kann mit organischen Lösungsmitteln (z.B. angesäuertem wässrigen Aceton und wässrigem Methanol) extrahiert werden und wird an Kationen öder Anionenaustauschharzen (z.B. Amberlite IR-120 und Amberlite IR-45) nicht adsorbiert. Beispielsweise kann Enduracidin im allgemeinen nach dem folgenden bevorzugten Verfahren extrahiert werden:
Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird mit Wasser gewaschen und zweimal unter neutralen oder sauren Bedingungen mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. 50-7C#igem wässerigem Aceton in der 5- bis 4-fachen Volum-Menge des Mycels, 50-70#iges Methanol usw.) 3 Stunden bei Raumtemperatur axerahiert. Das so erhaltene Filtrat enthält eine reichliche Menge Enduracidin, das eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegen gram-positive Bakterien hat. Nach Einstellung auf pH 5-6 wird das Filtrat im Vakuum durch Abdestillieren des Acetons eingeengt, worauf es mit Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt wird. Nach Zugabe von Äthylacetat in einer Volum-ffenge von einem Drittel des Konzentrats wurd das ganze Gemisch geschüttelt, um den löslichen Teil in die Äthylacetatsehieht zu überführen. Die wässrige Schicht (die eine gewisse Fällungsmenge enthält), die sich von der Kthylacetatschicht abscheidet, wird mit Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat oder Katriumbicarbonat auf pH 8 eingestellt und anschliessend mit n-Butanol in einer Menge von einem Drittel des Gesanit-'volumens extrahiert. Nach Wiederholung der Extraktion mit n-Butanol wird die n-Eutanolschicht mit Wasser in einer Menge von 1/2 des Gesamtvolumens gewaschen und dann mit einer wässrigen Säürelösung (z.B. pH 2., n/2C0 HCi oder n/200 HgSO^) gewaschen, wobei eine wässrige saure
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Lösung erhalten wird, die den Wirkstoff enthält»
Die wässrige Läsung wird der vorstehend beschriebenen Extraktion mit n-Butanol unterworfen. Die hierbei erhaltene n-Eutanolschieht enthält das im Mycel gebildete Enduracidin in hoher .Ausbeute, Die Extraktion mit wässriger Salzsäurelösung und mit n-Eutanol wird erneut wiederholt, wobei eine n-Eutanolschicht erhalten wird, die den Wirkstoff in einer viel höheren Konzentration enthält. Die so erhaltene n-Eutanolschicht wird einer gewissen Einengung unterworfen,, mit Wasser gewaschen und weiter unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt, wobei das n-Eutanol afcdestilliert, bis nur noch eine seht geringe Menge n-Eutanol im System vorhanden ist.
Zum kondensierten n-Eutanol wird Äther in einer Menge gegeben, die \/IO Volumen des n-Eutanols entspricht, vrobei eine gelblich-braune Fällung gebildet wird, die abfiltriert wird. Die Fällung wird mit Äther gewaschen, wobei der rohe Wirkstoff erhalten wird, der einen grösseren Teil des angereicherten Enduraeidins darstellt.
Die rohe Substanz zeigt eine antimikrobe Wirksamkeit von 5COO-IOOOO Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus und von 5000 bis 10000 Einheiten/mg gegen Bacillus subtilis.
Die Reinigung der rohen Substanz kann vorzugsweise wie folgt vorgenommen werden: Die in einer wässrigen Säureiösung gelöste rohe Substanz wird durch eine Säule geleitet, die mit Aktivkohle, die einer Vorbehandlung mit Säure unterworfen worden ist, gefüllt ist, und dann mit einem sehwach basischen Ionenaustauschharz (z.B. Amberlite IR-2Jb, IR-2IS usw., Hersteller Rohm & Haas Co,, U*S.A.) zur Entfernung der Säure behandelt. Die so behandelte Säure wird eingeengt oder gefriergetrocknet, wobei der reine Wirkstoff erhalten wird.
Der Wirkstoff kann einer weiteren Reinigung unterworfen oder beispielsweise wie folgt in sein Hydrochlorid überführt
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werdens -Der in methaneIischer Salzsäure gelöste Wirkstoff wird durch eine Säule geleitet, die mit Aktivkohle, die einer Vorbehandlung mit Säure unterworfen werden ist, gefüllt ist- .Die so behandelte Lösung wird bei Raumtemperatur eingeengt- .Das Konzentrat wird mit Aceton-Äther versetzt und a η sehlies send- stehen gelassen.. v;otei ein farbloses kristallines Pulver von Enduracldinhydrochlorid gebildet wird .Dieses Fulver ist in Wasser und Methanol löslich und zeigt eine antibiotische Wirksamkeit von 3COCO bis 2.50C0 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus und von "COCO bis 15CC0 Einheiten/mg gegen Hacillus subtilis.
Die 20-5C#ige Methanollösung dieses Pulvers wird durch ein schwach basisches Ionenaustauschharz geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit \:ird mit n-Eutanol versetzt, worauf das V'asser und Methanol abdestilliert werden und ein Konzentrat erhalten wird. Es ist auch möglich,, die wässrige Lösung dieses Pulvers auf pH 8-8,5 einzustellen, die Lösung mit n-Eutanol zu extrahieren und anschliessend die Konzentration vorzunehmen. Das hierbei erhaltene Konzentrat wird mit Sther versetzt,., wobei Enduracidin :'.n seiner freien Form erhalten wird.
Das so gereinigte Enduracidin hat die folgenden physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften:
I_L ?l§JP§?i ar ana lyse_ '·
Enduracidin besteht aus C-, H-, N-, P- und Cl-Atcmen.
0,% H, % N, % Cl, %
Freie Form :-: 53,2+0,5 6,54+0,3 14,45+0,5 3,36+0,5 Hydrochlorid :-::-: 49,7+0,5 6,29+0,3 13,51+0,5 9,-42+0,5
Die freie Form wird nachstehend als (A) und das Hydrochlorid als (B) bezeichnete
η Die freie Form enthält noch 3,36 + 0,5$ Chlor in ihrem Molekül.
BAD ORIGINAL
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Es wird angenommen., dass der Chlorgehalt vcn etv:a 3,j6 + auf starke lonenbindung oder kovalente Bindung zurückzuführen ist. obwohl dies noch nicht bestätigt ist,
:-ik Das Hydrochlorid enthält im Vergleich zur fröien Form weitere 2 Mol Chlor,
2Λ j_Molekularg.ewicht_und_Struktureinheit_c
Wenn Enduracidin mit 6n-SaIzsäurelösung 6-48 Stunden bei 13 00C hydrolysiert wird., werden ein Gemisch von Threonin, Serin., Glycin, Alanin und Asparaginsäure, eine gewisse Menge Substanzen., die in der Ninhydrin-Reakticn positiv sind, und unbestimmte Substanzen gebildet, die sich mit dem Sakaguchi-Reagenz blau und violettblau färben= Zu diesen unbestimmten Substanzen gehören solche., die bei der Ninbydr in-Reaktion zunächst geblich-braun, gelb cder violett sind, sich aber violett färben,, wenn sie bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Ihre Mengen sind verschieden je nach dem Grad der Hydrolyse. Auf Grund dieser Eigenschaften wird Enduracidin als neues Antibiotikum vom Typ des basischen Peptids angesehen.
Andererseits ist einer Neutralisationstitraticnskurve, die auf der Grundlage der Titration von Enduracidin in 5 CfSi ge in Methanol mit einer n/10 Salzsäurelösung gezeichnet, wurde, zu entnehmen, dass Enduracidin einige basische Gruppen enthält, die in seinem Molekül zu dissoziieren vermögen» Aus der nachgewiesenen Chlormenge kann das Mindestmolekulargewicht von Enduracidin mit.etwa 1C55 berechnet werden, so dass das Molekulargewicht von Enduracidin mit (etwa ICCO bis 11.CO)n, wobei η eine ganze Zahl ist, angegeben werden kann»
3Li_J3p£zif igche Drehung;
A: /~α_7 |p = + 85° + 10° (C=O,5, in Dimethylformamid)
„23°
B: L a_7 D = + 70° + 10° (C = 0,5, in Wasser), + 80° +
(C=0,5 in Methanol)
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Das Ultrav:.clett-Aboorptions3pektrum von Enduracidin "ist in Pig:' (.freie Form) und Fig. 4 (Kydroehiorid: dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden v/esentlijhen-Abcorp ■ tionsmaxiina:
Λ .Β
23C9u;e'^ = 220 j_ -.,J1 2i:mu,E/'S ·- S'?. ;l Ό)
max / --π / -cm
23Crau'ν E " = ' ?-j + ' Ο;
' ' cm
η/ O HCI 272 ma {Ε J* =1:2 + I
Λ η/Ό KaOH 25Oma (E;^ =;3^ ^- Ό;
max '
Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Enduracidin, gemessen nach der Kaliumbromid-Uethode. ist in Fig.2 (freie Form, Or-IJetho.de) und 3 (ireie Form. Nujol-Hethode) , 5 (Hydroohlorid, Or-Methods; und 6 (Hydrochlorid. IJujcI-LIethode) dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in ?x ,'KBr-Me t ho de,;
A B
3;05 (stark) 3.05 (stark;
3?25 (Schulter) 3,25 (Schulter.)
3338 (Schulter; 3,38 ',Schulter;
5,75 (Schulter; 5,77 iSchulter)
5,95 (Schulter) 5,95 (Schulter;
6,09 ?stark) 6.09 (stark;
6,24 (.SchulterJ 6,23 (Schulter)
C = 47 (Schulter) 6,47- (Schulter)
6,55 (Schulter) . 6,55 (Schulten
6,61 (stark) 6,61 (stark) BAD OfiiäiNAL
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„ -g -
L-. i j mitte". ' • .23 ι mitte j. V1D^. ν mitt el, 8,".υ .brei-;, »stark) 8.5> -mittel? J.9O nittel· .•■.νΛ·'.ι ν schwach) „V2 'mittel1
-2 Γ5 ', sehr s
6.3p unittel)
7,25 '. mitt el";
7.48 .; Schulter)
8.''. C {"br e it. st ark j
80' v^ittel;
9"89 (mittel?
11J»-''- O ν s chv/a ch "·
12.50 'schwach)
Λί Partieses Pulver "B; Farbloses kristallines Pulver
c '. Par br eakt ic η
Endura2jdija
ICinhydrin-Eeagens
Parteiisches Reagens .Gertisch aus gleichen Räumte ilen ''tigern wässrigem Εχεεη(Ιϊϊ)-chlorid und in gern v/ässrigem Kaliumf erricyanat
Alkalisches Kaliumperir.anga.nat
Λ: 205-225°G(Sinterung) B; 215-220°0(Sinterung)
(B) positiv»,"blass bräunlich.-violett';
dto5 posit.iT ^tlassh
ürageiidorffsches Reagens (A)
(B)
(A) dtOc
positi" (,crange-gelb) dto.,
Yeriärhung tritt ein (Reduktion)
dto<
225-24O0C (Zers„) -2450O (Zerso)
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8j^ Tjp_slichkerb ■ .
(A) ist leicht löslich in ^y rid in ? N; N-Dimethylformamid,, wässriger 5^iger ITIKKQL HOC-50-Lösung (NIKKO-SHOKAl-KAHJSlIIKI-KAlSItA, Japan'/; verdünnter Saure, wässriger alkalischer Lösung · {unter Zersetzung) und löslich in . wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol« wässrigem Aceton und wässrigem .Butanole, ,jedoch unlöslich oder schwerlöslich in Wasser, absolutem Äthanol, reinem Butanol, roinera Aceton und anderen neutralen organischen Lösungsmitteln;
;B, ist leicht löslich in Wasser» Methanol und löslich in Äthanol,jedoch unlöslich in Aceton, Äther und anderen' neutralen organischen Lösungsmitteln = ;<
3l. ρ£σ)·£JA. J
Bei der PapierverteilungsChromatographie unter Anwendung' der· aufsteigenden Llethode auf Ühatman-Filterpapier NrO1 'B and H1.EaIs"tcn" Ltd.", England) wurden folgende Ergebnisse ■erliaiteiii
Lösungsmittel Hf--Wert {A-Bi'^ ■/ -
Essigsäure-n-Eutancl-WaöserH :4:5) ' ' 0> 45 J; 0?^** n-Butanolo mit Wasser gesättigt O7O ..---
P.yridin-n--Eutanol--V.rasser(3:4;7; .-,-0,8Or ^
'*'" Für A und B wird der gleiche Rf-Wert festgestellte **- Die Substanz wird unter neutralen Bedingungen leicht an Filterpapier adsorbiert..
(A) und (3) sind ziemlich stabil in Methanol und saurer . Lo sung j aber die antibi^otische V/irksamkeit veruchlechtert sich auf 1/5 bis 1/10 bei 42-stünäiger Lagerung in alkalischer Lösung bei 4O0Cc . ;
Hie raittlere lethale L-osis (EDeg) von (A) im tegensate akuten Toxizität betragt bei Mäusen v/enig0ttns 880 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Benändlung und wenig-' stcns 66 mg/kg Körpergewicht bei intravenöser VerabXoIgung*
009812/1897 , SAD
Eei Ratten beträgt die mittlere lethale Cosis (LD-«) von (A) im Gegensatz zur akuten Tcxizität wenigstens JCO mg. kg
• Körpergewicht bei intravenöser Verabfolgung =
IgJ Antibiotischej Sf§ktrum.
Die antibiotische Wirkung von Enduracidin gegen die verschiedenen Mikroorganismen wurde nach der Agar-Verdünnurigsmethcde geraessen. Die als Te stOrganismen verwendeten grampositiven oder gram-negativen Bakterien wurden auf Bcuillcn-Agar 20 Stunden bei 37°C gezüchtet. Bei säurefesten Bakterien wurde Glycerinbouillon-Agar verwendet. Die Eebrütung wurde 40 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Im Falle von Pilzen oder Hefe wurde Glucosebcuillcn-Agar als Nährmedium verwendet. Die Esbrütung wurde 40 Stunden bei 28°C durchgeführt.
Das antimikrobische Spektrum von Enduracidin ist nachstehend in Tabelle 2 in der hemmenden Mindestkonzentration angegefcen.Wie Tabelle 2 zeigt, besitzt Enduracidin starke antimikrobe Wirkungen gegen gram-positive und säurefeste Eakterien,
Die hemmende Mindestkonzentration gegen Bakterien, bestimmt bei 370C auf TSA-Kultur, die Einderblutserum enthält, bei einer Bsbrütungsdauer von 20 Stunden ist in Tabelle I angegeben. -
Tabelle 1
Testbakterien ' Hemmende Mindestkcnzen-
tratiori
(Mikrogramm/ml)
\ " < Staphylococcus aureus 2G9 ρ
Streptococcus pyogenes E-I4 StreptGeoceus pyQgenes Dick Streptococcus pyogenes S-8 Streptococcus pyogenes Ni-5 Streptoeoccüs*viriäans sp. "©iplococcus pneumohiae- I
* DiplocQccus pneumoniae-II Biplocöccus pnsumoniae-lll Corynebacteriunt aiphtheriae
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(A) ■- (B)
2,5 0,78
1,25 0,78
1,25 0,78
1,25 0,78
2,5 1,56
1,25 1,56
1,25 0,78
0,625 0,78
1,25 . 0,78
0,625 /0,78
Tabelle_2_
iestbakterien Hemmende !linde stlconze nt rfe-
tion
Ilikrogramri/nl
Esch'erichia coli >100
Proteus vulgaris >1OO
Staphylococcus aureus O7''
Bacillus subtilis Q,''
Bacillus cereus 0; 5
Bacillus brevis 1,0
Sarcina lutea 0,2
Iilicrococcus flavus 0,05
Fycobacteriun avium 5-.O
Kycobacterium avium 5-.0-
iJycobacterium avium 5,0
LIycccacterium sp = A!I!CC 607 5,0
J.Iycocacterium phlei 5;0
lly co bacterium smegmatis 2
Piricularia cryzae >"00
Aspergillus niger >'.C0
Peniciilium notatum . >100
Candida, albicansi.? >^00
Saecharamyces cerevisiae ^"100
Die physiologische Acidität oder Basizität von Encluracidin wurde nach der Strichmethode in einer Agarschale genessen» Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführte Wie aus diesen Werten ersichtlich ist,, zeigt Enduracidin auf basischen Sestmedien eine viel stärkere Wirksamkeit als auf neutralen oder sauren Medien,, Dies bedeutet^ daß Enduracidin zu den ■ söge physiologisch- basischen Substanzen gehört»
Einfluß von p^-Änderungen auf die antibiotische Y/irksankeit von Enduracidin
■ Testbakterien p„ Hemmungs zone s 11, - ,5
Bacillus subtilis 6 11 12
8 13 O
Mycobacterium avium 6 0 0
' - - 8 0
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mm
BAD
In dar, folgenden Beispielen sind die' z„Ztc "bevorzugten i.usführuh£sforr;:en der Erfindung beschrieben..- Die Prosentsätze ■beziehen sich auf.-Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben. '
Streptorayces fungicidicus Hr- Ε-ο4-ϊγ wird mit einer Plsvtinöse von Glucose-.'sparagin-Schrägagar auf je 500-ml "von · wässrigen Kulturmedien überimpft, die in 2 1-Kolben gehalten werden. Die wässrigen Iledien enthalten 2fo Glucose, y/s Stärke. 1^- ilaisquellwasser. "\c,% Sojatohnenniehl. Q5 5^ Peytonw 0.3/- Natriumchlorid und 0?5'^ Calciumcarbonate Sie sind vorher auf p„ 7 eingestellt und 20 Hinuten bei "2jc'C ιαίτ liochdruckdampf sterilisiert wordene Die Kulturmedien werden unter Schütteln O20 Zyklen/Uin . IQ era: 24 Stunden bei 280C bebrütet.
Von der erhaltenen Kulturbrühe wird 1 1 der Torf err.enla ti cn in 30 -- Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung in eineniO !--Tank 2Λ Stunden bei 280C unter Rühren ^28O UpIl) und Belüftung i/o 1/IIin.-} unterworfen. Die so erhaltene Vor. ■--kuitur wird weiterhin 96 Stunden bei 280C in 500 1 eines wässrigen Kulturniediumss das 1^ Glucose,, 2fc Stärke- 15-S-Llaisquellwasser- X^ So^abohnenmehl- 0-5/= Peptoiij O.-3/J Xa.triumchjorid und 0.-5/5 CalciuKcarbonat, .enthältf. in.einem 1000 1-Tank aus^Jtiichtrostendem Stahl unter Rühren?·, (/ι 60 UpII) und Belüftung bei einer luftzufuhr von 750 l/IIia* -v/ährend ., dei· ersten Hälfte der Eermentationsdauex1 und 500 l/LIiiu während der letzten. Hälfte der Fermentation bebrütet,wobei etwa 1a5T.kg.. Silic.onöl-als Antiscnuiimiittel verwendet v/erdeno
Änderungen des Pjj-Vrerteb und der antibiotischen iJrtivität sind als Agar-Verdünnungseinheit nach verschiedenen Bebrütungszeiten in der folgenden tabelle angegebena
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Bebrütungs^eit 6,15 Kulturfiitxat
(!Einheit)
St* B**		 — t"ye el
(Einheit)
δ** ' B**		 —
Sakaguchi-Kolben
(impfmaterial'		 75O5 - —
Vorkultur (30 7,05 - - — —
0 β, 28 - — — —
18 6,70 ... — -
24 7,05 — — — —
Haupt-
Kultur (5CD I)		 7,05 — ~ — —
·.) 6:.75 - 1O> - — ...
18 7,16 — 10> - 10
30 7,36 1Q> 35 1O> 20
42 7,55 1O> 50 20 350
54 7,70 35 15 350 350
66 8,05 50 100 350 750
78 7,93 15 750 IOC
90 100 1000
'■ Staphylococcus aureus
'* Bacillus
Von den in Beispiel 1 genannten Kolben v/ird nach Belieben 1 1 einer Iinpfkultur in 30 1 eines wässrigen Kulturmediums uberimpft. das 20 Glucose; 3/' Stärke, 1^ Maisguellv/asser; 1^ Sojabohnenmehl,. 0,55^ Pepton5 O53/JtHatriuiachlorid? 0,5i' Calciumcarbonat und 0; 2?S liatriumglutamat enthalte /jischliessend wird 96-120 Stunden bei 280C unter Belüftung (45 1/lIin*} und Eühren (280 UpIL) fermentiert, wobei Siliconöl als
Antischaummittel verwendet wird»
Änderungen des pH~\7ertes und der antinikrobischen V/ir^ung sind als Agar-Verdünnungseinheit nach verschiedenen BebrüV-tungszeiten in der folgenden fabeile angegebene
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- - 25 - ■. · ■ ■■™ ■- - - 1617881 —-
Ütungsz eit pH KuIturfiltrat
(Einheit)
St* B**		 — ITy c el
(Einheit)
St* - B**		 - - —
O 7,25 —' ■ 1Q> — > 1O>
18 6,95 1O> > 1O>
30 6,81. 1O> 20 150
42 7,00 1O> 20 10 150
54; 7 ,.30 ■35 35 150 350
66 7?52 35 500 150 1500
78 1,62 35 t 500 350 2000
90 7,59-" 500 500 1500 20C0
1Ö2 - 7?7O 500 2000
114 7,90 500 2000
■»Staphylococcus aui^eus
** Bacillus subtilis
Filtration von 500 1 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe v/erden 100 kg"..nasses Hy eel von 400 1 Kulturfiltrat abgetrennt., Eas nasse ZSyeel wird zweimal mit je 300 1 7Ö$igem wässrigem Aceton unter Bühren 3 Stunden extrahiert« Die Acetous chi eilte« .-.werden vereinigt» Ihre antibakterielle Wirkung entspricht 200 -350 Einheiten/ial gegen St«, aureuSo Kiach Einstellung auf ρ« 5-6 mit 4n-Schwefölsäure Yfirö das Aceton unter vermindertem Druck abgedämpft* wobei 2GC 1 v/ässrige üösung zurüekbleibeno Die wässrige Iiösung wird mit 4n~Sehviefölsäure auf pH 3,0 eingestellt«. Zur eingestellten sauren Lösung werden 70 1 Xthylacetat gegeben« 33as Gemisch wird gerührt und stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die JLthylacetatschicht wird entfernt und die wässrige Schicht (die eine gev/isse llenge .einer Fällung enthält) herausgenommen und mit 4n-17atriunhydro2jyö auf pH 8,0 eingestellt und unmittelbar, darauf
[ zweimal mit Je 90 1 n-Batanol extrahierte Die n-iutanol-
f'"v ' '
lßsungen^ie eine Wirkung von 15G-200 Sinheiten/nl gegen Staphylococcus aureus geigen? v/erden vereinigt und mit *§0 1 destilliertem Wasser gewascheno Die so behandelte
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■%
Salz Butanollösung wird zv/einal rait re 50 1 κ/200 gsls«s£sis
Salz
extrahiert» Die =£d!&4?.i€=£ei.säurelösungen werden vereinigt und mit 4ji-IIatriumhydroxyd auf ρΗ 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf zweimal mit je 50 1 n—Eutanol extrahiert. Die n-lutanoischichten werden vereinigt} mit 50 destilliertem Wasser gewaschen und zweimal mit ze 15 1 ii/2C0 Chlorwasserstoffsäure extrahierte Die salzsauren wässrigen Schichten werden vereinigt, mit 4n.-Natriunhy droxyd auf p„ 8P0 eingestellt und unmittelbar anschließend zweimal mit je 15 1 n-Butanol extrahiert« Die n-Butanol·-· schichten werden vereinigt und zweimal mit je 11) 1 destilliertem Wasser ge\;aecheno Zur so behandelten n-Eutanol·- schicht wird destilliertes Wasser in einer Henge von 1/4 des Volumens der Schicht gegeben,, Eas Gemisch wird unter vermindertem Eruclc bei einer Außentemperatur von nicht mehx' als 7O0C eingeengt, bis das verbleibende Butanolvolumen 200 ml beträgt» Während der Einengung v/ird die Ausfällung des erfindungsgemäßen Produkts festgestellte Zum Konzentrat v#erden et\7a 2 1 Äther (peroxydfrei) gegebene Die sich bildende Fällung wird zusammen mit der bereits vorhandenen Pällung abfiltriert und mit Äther gewaschen, wobei etwa 3,5 g einer rohen pulverfönaigen Substanz erhalten werdeiij die eine antibiotische fTirkung entsprechend 5000 Einheiten/mg gegen Staphylöcoecus aureus hat»
Zu 400 1 des im ersten Absatz dieses Beispiels genannten Kulturfiltrats werden 4n-Sehwefelsäure zur Einstellung des pH-\7ertes auf 3jO und ansehließena 150 1 Äthylacetat gegeben,, Das Gemisch wird gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden,, Die wässrige Schicht v/ird entfernt und mit 4n-Batriui3hydro:iyd auf pH 8jO eingestellt und unmittelbar darauf mit 100 1 •n-Sutanol versetzt,, Das Gemisch wird gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen=; v/obei sich zwei Schichten bilden, Die n-Butanol schicht wird mit etwa 50 1 destilliertem Wasser gewaschen und dann zweimal mit je 15 1 n/200
009812/1837 original inspected
Chlcrwasserstoff säure extrahiert* Bie werden vereinigt5 sit 4a-üatr2.imibyä2?Qsya auf u^ B5O eiiigesteilt und unmittelbar darauf mit 10 1 n-lutanol versetzte Das QeTAxsch wird zur weiteren Extraktion gerührt und dann stehen gelassen,. wobei sich zwei Schichten bilden« Die n- Butanols chi cht wird abgezogen und zweimal mit destillierten Wasser in einer Menge gewaschen., die 1/3 des Volumens der n-Eutanoischicht entsprichtc
Zu der gewaschenen n-Butanolschieht wird destilliertes AVasser in einer Llenge von 1/4 des Volumens der Butanolschicht gegebene Das Gemisch wird unter vermindertem Druck "bei-einer Außentemperatur von nicht mehr als 7O0C eingeengt., Das Konzentrat wird in der gleichen Weise wie das im ersten Absatz dieses Beispiels genannte Ky eel aufgearbeitet, wobei etwa 0.5 g einer rohen puiverförmigen Substanz erhalten werden» die eine antibiotische Wirkung von 5000 bis 75C0 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus hat ο
Durch eine Säule, die mit 1 kg Aktivkohle/gefüllt ist, die einer Vorbehandlung mit Salzsäure unterworfen worden ist? werden 100 1 einer sauren lösung geleitet., die den Wirkstoff enthält.- der durch Extraktion mit n-Butanol gemäß Beispiel 3 erhalten wurde* Hierbei werden 70 1 einer fast farblosen Fi'aktion erhalten, die den Wirkstoff enthält„ Die
2 Fraktion wird ,faireh eine Säule geleitet,, die mit 4#r^ 3. Amberlite IB/bei S„V»5 gefüllt ist3 wobei eine leicht basische wässrige lösung erhalten wirdc Die wässrige lösung v/ird bei verhältnismäßig niedriger iDemperatur unter vermindertem Druck eingeengte Each Zugabe von n-Bitanol zum Konzentrat wird das Gemisch, gerührt5 um den Wirkstoff in die n-Butanolschicht zu überführeno Zur n-Butanolschicht wird ebenso wie in Beispiel 3 peroxydfreier jither gegeben, wo durch der Wirkstoff in freier Form ausgefällt wird, oder zur n~Butanolschicht v/ird i-nomale Salzsäure zur Einstellung des
(Takeda Chemical Industries) für SäulenehromatograEhie
00S812/1$97
BAD ORIGINAL
pH-Wertes auf 4,5 gegeben. Auf diese Weise werden 1,8 g einer pulverförmigen Substanz, deren antibiotische Wirkung 7500 bis ICOOO Einheiten/reg gegen Staphylococcus aureus entspricht, bzw. 1,9 g einer pulverförmigen Substanz mit einer antibiotischen Wirkung entsprechend 75CO-1CCCO Einheiten/rag erhalten.
In einem Gemisch von 500 ml Methanol und 1 ml 1-normaler Salzsäure wird 1 g der gemäss Beispiel j3 bzw. Beispiel 4 hergestellten rohen pulverförmigen Substanz gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 10 g Aktivkohle (Takeda Chemical Industries,Ltd. ) für Säulenchrerratographie gefüllt ist. Mach Behandlung mit einem Gemisch vcn k ml# n/lp Salzsäure und 100 ml Methanol wird die Säule mit Methanol gewaschen, wobei 1,5 1 Flüssigkeit ablaufen, die den Wirkstoff enthält. Die abgelaufene Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit Aceton-Äther bei verhältnismässig niedriger Temperatur versetzt, wobei eine weisse Fällung gebildet wird. Die Fällung wird abfiltriert und mit Äther ge wa sehen, wobei 5CO mg Produkt (Hydrochlorid) erhalten warden. Die antibiotische Wirkung der Fällung entspricht 15OCO Einheiten/mg gegen Stapnylococcus aureus.
In 100 ml 2C$igem wässrigem Methanol werden 100 mg der Fällung (Hydrochlorid) gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von 5 ml Amberlite IR-45 bei S.V.5 geleitet.Die Säule wird mit Methanol gewaschen. Die ablaufende Flüssigkeit wird eingeengt. Der Rückstand wird gefriörgötrocknet und anschliessend mit Aceton-Äther geviaschen, wobei 80 mg eines weissen Pulvers (freie Form) erhalten werden. Die Fällung zeigt eine antibiotische Wirkung entsprechend 15CC0Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus.
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Baispie1 6
Eurch Filtration werden rcrti ΐβ 1 des gemUss Beispiel 7 erhaltenen Kulturfiltrats etwa 4 kg nasses Mycel abgetrennt. •Bas Mycel wird mit dem vierfachen Volumen einer 7C$igen wässrigen schwefelsauren Aeetonlösung 4 Stunden unter Rühren bei etwa pH 2 extrahiert. Nachdem 1-6 1 wässriger Aeetonextrckt (3500 Einheiten/ml gegen Staphylococcus aureus).mit Natriumhydroxyd auf pH 8-8,4 eingestellt worden sind, werden zum wässrigen Acetonextraktl6O g Aktivkohle (SHIRASAGI-A, hergestellt durch die Anmelderin) und l60 g "Hyflo Super Gel" (Johns Manvllle Sales Corp., U.S.A.) gegeben. Das Gemisch wird 1 Stünde gerührt. Nach Filtration wird die Aktivkohle mit Aceton in einer Menge, die dem 10-fachen Volumen des Filtrats entspricht, und dann mit dem 10-fachen Volumen Methanol gewaschen» Die so behandelte Aktivkohle wird mit dem 20-fachen Volumen einer sauren wässrigen Acetonlösung 3 Stunden unter Rühren extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und auf pH 5 eingestellt. Nach dem Abdampfen Öes Lösungsmittels bleiben 1,3 1 wässrige Lösung zurück. Die Lösung wird durch eine Kolonne, die mit 2CO ml des Ionenaustauschharzs Ambarlite IB-ISO (H) gefüllt ist, und dann durch eine Kolonne., die mit 200 ml Amberlite IR-45 gefüllt ist, geleitet und unter vermindertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Nach Vermischung mit 5 1 Wasser wird das Gemisch auf pH 8,5 eingestellt und dreimal mit 1/5 seines Volumens an n-Butanol extrahiert. Die n-Eutanolschicht wird ' mit Kasser gewaschen und unter vermindertem Druck unter Zugabe von Kasser eingeengt, wobei 500 ml einer wässrigen n-Eutanollösung zurückbleiben. 2ur Lösung werden 5 1 Ä'ther gegeben, wobei eine Fällung abgeschieden wird, die abfiltriert und getrocknet wird. Hierbei werden 4 g pulverförmiges rohes Enduracidin erhalten. Dieses Produkt zeigt eine Wirkung entsprechend 10000 Einheiten/iBg gegen Staphylococcus aureus.
in zwei 2 1-Kolben v/erden je 500 ml eines Kulturmediums gegossen., das aus 2c/i Glucose. 3?5fi Maisquellwasser, I15/5 Oaleiumcarbonat und V/asoer besteht» Das Medium wird mit dem Mutanten Streptorayees fungicidicus. NroE-5477 \lFU-i244C) (ATCC-^iQH) geimpft und 2 Tage bei 2O0C unter Schütteln auf einer Schüttelmaschine bebrütet v wobei ein Vorinpfir.edium erhalten wird» In einem 50 i-Tank v/erden 30 1 eines wässrigen Kulturmediums, das aus 2$ Glucose«, yß> löslicher Stär]:e.. IfS Kaisquell\7asser? 1?S Sojabohnenmehl, 0;,3# Natrium chi or id Oj5c/o Pepton, O35^ Calciumcarbonat und Tiascer besteht und auf -pjj 7jO eingestellt ist? mit der erhaltenen Vorinpf-Ivultur geimpft o Das geimpfte Medium wird bei 280C unter Eewegung und Belüftung(30 l/LIiiu) bebrütet» Der Fortschritt der fermentation innerhalb von 90 Stunden ergibt sich aus der folgenden Tabelle*
Bebrütuiigszeit p„~V<'ert der Brühe Wirksamkeit der ganzen
Ά Brühe (Verd.-Einheiten/
ml)
O 7; 05 ' <1O
'!8 7?C0
30 7,10 <1Q
42 ' 7?35 50
54- 7,82 350
66 7,82 1000
78 7,84 1500
90 7,84 15CO
AD ORiGJNAL

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Ι» Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Enduracidin auf mikrobiologischem Wege* dadurch gekennzeichnet, dass man einen Enduracidin liefernden Stamm der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren Stickstoff und andere an sich bekannte Nä'hrbestandteile für das Wachstum des Mikroorganismus enthaltend das dabei gebildete Enduracidin aus der Kulturbrühe gewinnt.
    2„ Verfahren nach Anspruch 1., dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Stamm Streptomyces fungicidicus einsetzt.
    3ο Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2? dadurch gekennzeichnet, dass man mit Streptomyces fungicidicus Nr0 B-5^77 (ATCC-SlOl^) arbeitet«
    4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2., dadurch gekennzeichnet, dass man mit einem Mutanten (ATCC-21O14) von Streptomyces fungicidicus Nr0- B-5^77 arbeitete
    5* Verfahren nach Ansprüchen 1 bis h? dadurch gekennzeichnet., dass man den eingesetzten Mikroorganismus bei Temperaturen von etwa 20 bis 1IJ0C für einen Zeitraum von 40 - l8o Stunden unter aeroben Bedingungen züchtet, bis sich das Enduracidin in erheblichem Ausmass in der Kulturbrühe angereichert hat.
    6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, dass Enduracidin in freier Form oder in Form eines Salzes mit physiologisch verträglichen Säuren, insbesondere als Hydrochloride gewinnt»
    009812/1897
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6038120B2 (ja) * 1980-10-31 1985-08-30 武田薬品工業株式会社 抗生物質エンジユラサイジンの製造法
CN102391363B (zh) * 2011-09-26 2013-11-13 浙江升华拜克生物股份有限公司 一种恩霉素的提取方法
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JP2020500509A (ja) * 2016-12-06 2020-01-16 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株およびその使用
CN109320590B (zh) * 2018-10-31 2021-03-02 清华大学 抗生素teixobactin及其类似物的合成路线
CN111744459A (zh) * 2020-07-22 2020-10-09 安徽农业大学 一种去除水体中四环素的水稻秸秆改性生物炭的制备方法
CN113307855B (zh) 2021-06-25 2023-08-01 厦门大学 拟穴青蟹抗菌多肽Spampcin56-86及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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