JP2020500509A - 改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株およびその使用 - Google Patents
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- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Abstract
Description
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2016年12月6日に出願された米国特許仮出願第62/430455号の米国特許法第119(c)条に基づく優先権を主張する。
開示される実施形態を実施するための適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、当業者に周知の任意の適切な方法または技術を開示される実施形態の実行に使用することができる。本開示に適用可能ないくつかの従来の方法および技術は、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989;Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001;Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2000);Ausubelら,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley & Sons,1999;Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990;Harlow and Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999;およびKieser,T.,Bibb,M.J.,Buttner,M.J.,Chater,K.F.,and Hopwood,D.A.:Practical Streptomyces genetics,John Innes Centre,Norwich Research Park,Colney,Norwich NR4 &UH,England,2000に記載されている。
本開示によって提供されるストレプトマイセス・フンジシディカスの組換え株は、増強されたレベルのエンデュラシジンを製造する方法を提供する。当技術分野におけるこの技術的進歩により、エンデュラシジンの製造に関連する大幅なコスト削減が可能になる。一定の実施形態では、エンデュラシジンを製造する方法は、開示されるストレプトマイセス・フンジシディカスの組換え株を、エンデュラシジンを産生するのに十分な条件下で培養するステップを含む。他の実施形態では、本方法は、培養後に培養培地からエンデュラシジンを単離するステップをさらに含む。さらに他の実施形態では、本方法は、指示微生物として黄色ブドウ球菌ATCC29213または枯草菌(Bacillis subtilis)ATCC6633を使用する、例えばHPLC分析またはバイオアッセイによって、産生されたエンデュラシジンの抗菌活性を決定するステップをさらに含む。
以下の生物学的材料の培養物は、ブダペスト条約の要件を満たす条件下で、以下の国際寄託機関に寄託されている:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)10801ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア州20110−2209、米国。
ストレプトマイセス・フンジシディカス PTA−122342 2015年8月5日
(BM38−2)
[実施例1]
改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株
エンデュラシジン生合成に使用するためのストレプトマイセス・フンジシディカスバイオマスの製造
ストレプトマイセス・フンジシディカスの発酵は、pH、温度、酸素、曝気および撹拌を監視および制御するための系を備えた深槽型衛生設計工業用発酵槽で完了することができる。ストレプトマイセス・フンジシディカスの各発酵バッチを、安全な場所に貯蔵され低温環境に保持された産生種の、特徴付けられ管理された作業原種から開始する。発酵工程は3段階で行われ、引き続いて下流で処理する:
107〜1010個胞子/mLを含有する作業種培養物を使用して発酵バッチを開始することができる。凍結種の1〜5本のバイアルを低温貯蔵庫から回収し、ベンチトップで自然に解凍するか、または内容物が解凍されるまで28〜32℃の水浴に入れる。解凍した培養物(類)を室温に保たれた800〜1000mLの滅菌水に無菌的に移し、穏やかに混合して培養物を再懸濁する。
再懸濁培養物を種培地に無菌的に移す。種培地は、グルコース(0.5g/L)、デキストリン(2.5g/L)、コーンスティープリカー(1.0〜4.0mL/L)、大豆粉末(3.0g/L)、硫酸アンモニウム(0.25g/L)、リン酸一カリウム(0.13〜0.54g/L)、硫酸第一鉄(0.00〜0.5g/L)、水酸化カリウム(0.13mL/L)、沈降炭酸カルシウム(1.5g/L)、シリコーン系消泡剤(0.1mL/L)、および水、適量で構成される。培地を125℃で45分間滅菌し、次いで、28℃に冷却する。培地の量を、滅菌水を用いて所望の作業量に調整する。pHを6.6〜6.8に調整する。種スケールアップサイクルの操作パラメータには以下が含まれる:容器のサイズおよび形状に応じて、インキュベーション温度28℃±2℃、内圧0.5〜1.5kg/cm2、曝気速度2〜4Nm3/分、および撹拌速度およそ80rpm。pH、酸素消費量および粘度を監視するが、制御はしない。培養物を主生産発酵槽に移す前に50〜60時間増殖させる。移動時の粘度は350〜600cpsであるはずであり、pHは6.0以下であるはずであり、酸素消費量が増加するはずである。種培養物を主発酵培地に無菌的に移して発酵サイクルを完了させる。
主生産発酵槽培地組成物は以下を含む:コーンフラワー(13.0〜15.0w/v%)、コーングルテンミール(3.0〜6.0w/v%)、綿実粉(0.3w/v%)、コーンスティープリカー(0〜0.6v/v%)、塩化ナトリウム(0.3w/v%)、硫酸アンモニウム(0.25〜0.6w/v%)、乳酸(0〜0.5v/v%)、塩化亜鉛(0.01w/v%)、硫酸第一鉄(0.0〜0.02w/v%)、水酸化カリウム(0.20〜0.5v/v%)、硫酸カルシウム(0.0〜0.5w/v%)、沈降炭酸カルシウム(0.5w/v%)、αアミラーゼ(0.056w/v%)、水酸化カリウム(0.05v/v%)、大豆油(0.5〜2.0v/v%)、消泡剤、および水、適量。成分を列挙されている順序に従って添加する。αアミラーゼを通すように水を成分に添加し、次いで、得られた組成物を15分間80℃に加熱して酵素が複合炭水化物を分解するのを可能にする。次いで、残りの成分を添加し、pHをpH6.6〜6.8に調整し、水を適量添加する。培地を125℃で45分間滅菌し、28℃に冷却し、水を適量まで添加して所望の作業体積にする。
水をバイオマスから除去し、バイオマスを乾燥させ、次いで、プレミックスに配合する。
ストレプトマイセス・フンジシディカスのエンデュラシジン産生の最適化の効果
収量の改善は、親株の処理によって何年にもわたって行った(表3に列挙される)。菌株BM38−2(PTA−122342)が最も高いエンデュラシジン収量をもたらす。一連の培養および物理的処理を用いて、GAB−453(ATCC 31729)を処理することによって菌株を最適化した。
2.ATCC 21014:武田により寄託された、B−5477mとして示される菌株であるB−5477のγ線照射によって誘導された突然変異株
3.ATCC 31729:武田により寄託された、GAB−453として示される菌株であるB−5477のUV照射によって誘導された突然変異株
4.ATCC 31730:武田により寄託された、Emt−36−3として示される突然変異株である、m−フルオロ−DL−チロシン(MFT)を含む寒天プレート上でB−5477を増殖させることによって得られた突然変異株
5.ATCC 31731:武田により寄託された、GAB−453を最初にN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソクアニジン(nitrosoquanidine)、次いで、m−フルオロ−DL−チロシン(MFT)に供して、Emt2−140として示される突然変異株を得ることによって得られた二重突然変異株
6.ATCC 21388:Squibb and Sonsにより寄託された、ストレプトマイセス・フンジシディカス(ストレプトマイセス・マクロスポレウス(S.macrosporeus))に密接に関連する菌株。
ATCC番号PTA−122342>ATCC 31731>ATCC 31730>ATCC 31729>ATCC 21013およびATCC 21014。
ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株のゲノム分析
ストレプトマイセス・フンジシディカス野生型菌株、ATCC21013(B−5477)と、エンデュラシジン(エンラマイシン)生合成遺伝子クラスターの周りの領域を含む本発明の誘導株、BM38−2との間で比較ゲノム分析を行った。
ストレプトマイセス・フンジシディカスBM38−2における選択された突然変異の分析
ストレプトマイセス・フンジシディカスATCC番号PTA−122342工業菌株を、反復したラウンドの突然変異誘発、引き続く高エンラマイシン産生突然変異株の選択を通して開発した。ATCC番号PTA−122342に導入された、エンラマイシンの高収量に寄与し得る突然変異についての洞察を得るために、ATCC番号PTA−122342の全ゲノム配列を決定し、その野生型ストレプトマイセス・フンジシディカス先祖の全ゲノム配列と比較した。この比較分析により、2つのゲノム間で少なくとも77の多型または突然変異の差異が同定された。驚くべきことに、エンラマイシン生合成遺伝子クラスターを保有する染色体の領域においてただ1つの差異が検出された。この差異はendC遺伝子の一塩基変化であった。endC遺伝子におけるCからTへのヌクレオチド6260317の突然変異は、CTCコドンからCTTコドンへの変化をもたらすが、これは共にロイシンのコドンであるので、サイレント突然変異である。したがって、この突然変異がBM38−2で観察されたエンラマイシン収量の増加に重要な役割を果たす可能性は低い。エンラマイシン遺伝子クラスター内に他の突然変異が存在しないことは、BM38−2におけるエンラマイシンの収量の増加の原因となる染色体変化は、多面発現性(非経路特異的)調節エレメントまたはゲノムの他の場所に位置する全体的調節遺伝子に存在し得ることを示す。
orf682:ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)DNA結合ドメインを含むTetRファミリーの調節タンパク質をコードすると予測される。追加のGをホモポリマートラックに挿入してフレームシフトを引き起こす。
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BM38.2_682 GGACGGCGGCCCCTCGTTATGCTGCGGGGGGGGGGCAGAGGACGGGGACGGTGGAGCGAG WT_682 GGACGGCGGCCCCTCGTTATGCTGCGGGGGGG−GGCAGAGGACGGGGACGGTGGAGCGAG
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BM38.2_682 CGTGCGCCAGACGCCGGTTGAGGCACTGCGGCAGGGGACGACGGGGGCCGGGGGCCTGTC WT_682 CGTGCGCCAGACGCCGGTTGAGGCACTGCGGCAGGGGACGACGGGGGCCGGGGGCCTGTC
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BM38.2_682 CCTCGTCGAGCGCCGCAAGGCGGCACTGCGCTTCGAGATCGCCTGCGCGGCGGTGCACTT WT_682 CCTCGTCGAGCGCCGCAAGGCGGCACTGCGCTTCGAGATCGCCTGCGCGGCGGTGCACTT
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BM38.2_682 GTTCACCTCGCAGGGGGTCGCCGCCACGACGGGCGAACAGATCGCGCAGTCCGTGGGGAT WT_682 GTTCACCTCGCAGGGGGTCGCCGCCACGACGGGCGAACAGATCGCGCAGTCCGTGGGGAT
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BM38.2_682 CTCCTCCCGCACCCTGTGGCGCCATTTCCCCACGAAGGAGAGCTGCGTCCTTCCCCTGCT WT_682 CTCCTCCCGCACCCTGTGGCGCCATTTCCCCACGAAGGAGAGCTGCGTCCTTCCCCTGCT
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BM38.2_682 GACGGCGGCGCTCGACTTCGCCGTGGACCGCCTGCGTCACTGGCCGGCGGAGACGAGCCT WT_682 GACGGCGGCGCTCGACTTCGCCGTGGACCGCCTGCGTCACTGGCCGGCGGAGACGAGCCT
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BM38.2_682 GCTGGACTTCTTCGCCGAGACCTGCCGCAAGGGTGACCTGCCCGCCGCCACCCCGGAGAT WT_682 GCTGGACTTCTTCGCCGAGACCTGCCGCAAGGGTGACCTGCCCGCCGCCACCCCGGAGAT
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BM38.2_682 CCTCGACCTGATCCGCATGACCTCCACCGAACCGGCCCTGCGCGCCGTGTGGCTCCAGGC WT_682 CCTCGACCTGATCCGCATGACCTCCACCGAACCGGCCCTGCGCGCCGTGTGGCTCCAGGC
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BM38.2_682 CCACGACGACGCGCTTCCCGTCCTCGGCGGGCTTCTCGCGCGGCGCTCCGGCGCCGATGC WT_682 CCACGACGACGCGCTTCCCGTCCTCGGCGGGCTTCTCGCGCGGCGCTCCGGCGCCGATGC
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BM38.2_682 CGGCGACCTGAGGGTGACGGTGCACGCGGCGACGCTGAACGGCGCCCTGCGGGCGGCGGT WT_682 CGGCGACCTGAGGGTGACGGTGCACGCGGCGACGCTGAACGGCGCCCTGCGGGCGGCGGT
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BM38.2_682 GGAGGACTTCGCCCGGCGGTACGCGGACCGGCCGGACGCCGCGGACGCCGAACTCGCCCG WT_682 GGAGGACTTCGCCCGGCGGTACGCGGACCGGCCGGACGCCGCGGACGCCGAACTCGCCCG
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BM38.2_682 CTGTCTCGACGCCGCCCTGCGCGCGGCCTCGGAGGGACTCCCCTACTGA[配列番号11]
WT_682 CTGTCTCGACGCCGCCCTGCGCGCGGCCTCGGAGGGACTCCCCTACTGA[配列番号25]
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>WT_682翻訳された遺伝子産物
VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGAEDGDGGASVRQTPVEALRQGTTGAGGLSLVERRKAALRFEIACAAVHLFTSQGVAATTGEQIAQSVGISSRTLWRHFPTKESCVLPLLTAALDFAVDRLRHWPAETSLLDFFAETCRKGDLPAATPEILDLIRMTSTEPALRAVWLQAHDDALPVLGGLLARRSGADAGDLRVTVHAATLNGALRAAVEDFARRYADRPDAADAELARCLDAALRAASEGLPY[配列番号26]
>BM38.2_682翻訳された遺伝子産物
VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGGRGRGRWSERAPDAG[配列番号12]
BM38.2_2798 ATGAGCGGCACCGGGAGCCCTGCGGCGCGCCTGCAGGCGCTCTTCGAGGGGCATCGGCTG WT_2798 ATGGGCGGCACCGGGAGCCCTGCGGCGCGCCTGCAGGCGCTCTTCGAGGGGCATCGGCTG
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BM38.2_2798 ACGCCGACCCAGCGGCGCATCGCGCACAGCATGGTCCGGCGCGCCGCCGACGTGCCGTTC WT_2798 ACGCCGACCCAGCGGCGCATCGCGCACAGCATGGTCCGGCGCGCCGCCGACGTGCCGTTC
************************************************************
BM38.2_2798 CTGTCCAGCGTGGAGCTGGCCGAGCTGGCCGGGGTCAGCCAGCCGTCGGTGACCCGGTTC WT_2798 CTGTCCAGCGTGGAGCTGGCCGAGCTGGCCGGGGTCAGCCAGCCGTCGGTGACCCGGTTC
************************************************************ BM38.2_2798 GCCGTCGCCCTCGGCTTCGACGGCTATCCGGCGCTGCGCCGGCACCTGCGCGAGGTCGCG WT_2798 GCCGTCGCCCTCGGCTTCGACGGCTATCCGGCGCTGCGCCGGCACCTGCGCGAGGTCGCG
************************************************************
BM38.2_2798 CCCGCCGAACCGGCGCCGGAGACCGGCTCCTCCAACGAGTACCAGCAGGCCGTCGAGGCC WT_2798 CCCGCCGAACCGGCGCCGGAGACCGGCTCCTCCAACGAGTACCAGCAGGCCGTCGAGGCC
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BM38.2_2798 GAGATCGAGAACCTGCGGCATCTGGCGGAGGTGCTGGCCGACCCCCGGCCGGTGCGGCAG WT_2798 GAGATCGAGAACCTGCGGCATCTGGCGGAGGTGCTGGCCGACCCCCGGCCGGTGCGGCAG
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BM38.2_2798 GCCGGGCGCATGCTGGCGGGGAGCCGGCCGCTGCCCGTGCTGGGACTGCGGGCGGCGGCG WT_2798 GCCGGGCGCATGCTGGCGGGGAGCCGGCCGCTGCCCGTGCTGGGACTGCGGGCGGCGGCG
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BM38.2_2798 GCCCAGGCGCACGGCTTCGCGTACTTCGCCGCCAAGGTCCATCCCGACGTACGGCTGCTC WT_2798 GCCCAGGCGCACGGCTTCGCGTACTTCGCCGCCAAGGTCCATCCCGACGTACGGCTGCTC
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BM38.2_2798 AACGAGGGCGGCACCATGCTCCACGACCGGATCGACGCCGCCGCGCGGGCCGGGGCGAGC WT_2798 AACGAGGGCGGCACCATGCTCCACGACCGGATCGACGCCGCCGCGCGGGCCGGGGCGAGC
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BM38.2_2798 GCCCTGCTGTGCTTCGCGCTGCCCCGCCATCCCCGGGAGGTCGTCGACGCCCTCATCCAC WT_2798 GCCCTGCTGTGCTTCGCGCTGCCCCGCCATCCCCGGGAGGTCGTCGACGCCCTCATCCAC
************************************************************
BM38.2_2798 GCCAAGGAGACGGGGCTGACCGTGGTCACCGTCGCCGACTCGCCGTTCGCGCCGGTCGCC WT_2798 GCCAAGGAGACGGGGCTGACCGTGGTCACCGTCGCCGACTCGCCGTTCGCGCCGGTCGCC
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BM38.2_2798 GGGCTGTCCGACCTGCTGCTGCCCGCGGCCGTCGGGACCGGCCTCGCCTTCGACACGGCG WT_2798 GGGCTGTCCGACCTGCTGCTGCCCGCGGCCGTCGGGACCGGCCTCGCCTTCGACACGGCG
************************************************************
BM38.2_2798 TGCGCGCCGATGCTGCTGGGCCGGGTGCTGCTGGAGGCGATGTGCGACGACCTGCCCGAC WT_2798 TGCGCGCCGATGCTGCTGGGCCGGGTGCTGCTGGAGGCGATGTGCGACGACCTGCCCGAC
************************************************************
BM38.2_2798 GCGCAGGCACGGCTGGAGGAGTTCGACGTGAGGGCGGCGGCGCGCGGACTGTTCGTGGAC WT_2798 GCGCAGGCACGGCTGGAGGAGTTCGACGTGAGGGCGGCGGCGCGCGGACTGTTCGTGGAC
************************************************************
BM38.2_2798 TGA[配列番号1]
WT_2798 TGA[配列番号15]
***
>WT_2798翻訳された遺伝子産物
MGGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVTRFAVALGFDGYPALRRHLREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQAHGFAYFAAKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTVADSPFAPVAGLSDLLLPAAVGTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD[配列番号16]
>BM38.2_2798翻訳された遺伝子産物
MSGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVTRFAVALGFDGYPALRRHLREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQAHGFAYFAAKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTVADSPFAPVAGLSDLLLPAAVGTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD[配列番号2]
BM38.2_3866 TTGCCGGCCCGCCAGGCGCAGGCGCGCACCGACCGAGAGCACACGAGGACTGAGAGCACC WT_3866 TTGCCGGCCCGCCAGGCGCAGGCGCGCACCGACCGAGAGCACACGAGGACTGAGAGCACC
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BM38.2_3866 GGGATGGCAGACCAGACCCACGTCCTGTTCGTCGAGGACGACGACGTCATCCGCGAGGCC WT_3866 GGGATGGCAGACCAGACCCACGTCCTGTTCGTCGAGGACGACGACGTCATCCGCGAGGCC
************************************************************
BM38.2_3866 ACCCAGCTGGCCCTGGAGCGGGACGGCTTCGCGGTCACCGCGAAGCCCGACGGGCTGTCG WT_3866 ACCCAGCTGGCCCTGGAGCGGGACGGCTTCGCGGTCACCGCGAAGCCCGACGGGCTGTCG
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BM38.2_3866 GGCCTGGAGGCGTTCCACACCGACCGTCCCGACATCGCGCTGCTGGACGTCATGGTCCCC WT_3866 GGCCTGGAGGCGTTCCACACCGACCGTCCCGACATCGCGCTGCTGGACGTCATGGTCCCC
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BM38.2_3866 GGTCTGGACGGGGTGAGCCTGTGCCGGCGCATACGGGACGAGTCGATGGTGCCGGTGATC WT_3866 GGTCTGGACGGGGTGAGCCTGTGCCGGCGCATACGGGACGAGTCGATGGTGCCGGTGATC
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BM38.2_3866 ATGCTGTCGGCGCGGGCCGACGCCATCGACGTGGTGCTGGGCCTGGAGGCGGGCGCCGAC WT_3866 ATGCTGTCGGCGCGGGCCGACGCCATCGACGTGGTGCTGGGCCTGGAGGCGGGCGCCGAC
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BM38.2_3866 GACTATGTGACCAAGCCGTTCGACGGCGCCGTGCTGGTGGCCCGGATCCGCGCGGTGCTG WT_3866 GACTATGTGGCCAAGCCGTTCGACGGCGCCGTGCTGGTGGCCCGGATCCGCGCGGTGCTG
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BM38.2_3866 CGCCGCTTCGGGCGGGCGAACGGCGGCCGGGAGGAACCGGCGGCGGACGCCGGGGGTGTG WT_3866 CGCCGCTTCGGGCGGGCGAACGGCGGCCGGGAGGAACCGGCGGCGGACGCCGGGGGTGTG
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BM38.2_3866 CTGGCGTTCGGCGAACTGGAGATCGACACCGGGGGCATGGAGGTGCGCCGGGCGGGGCAG WT_3866 CTGGCGTTCGGCGAACTGGAGATCGACACCGGGGGCATGGAGGTGCGCCGGGCGGGGCAG
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BM38.2_3866 CCGGTGGCGCTGACGCCGACCGAGATGCGGCTGCTGCTGGAGTTCTCGGCGGCGCCGGGC WT_3866 CCGGTGGCGCTGACGCCGACCGAGATGCGGCTGCTGCTGGAGTTCTCGGCGGCGCCGGGC
************************************************************
BM38.2_3866 ACGGTGCTCTCCCGCGACAAGCTGCTCGAACGGGTGTGGGAGTACGGCTGGGGCGGTGAC WT_3866 ACGGTGCTCTCCCGCGACAAGCTGCTCGAACGGGTGTGGGAGTACGGCTGGGGCGGTGAC
************************************************************
BM38.2_3866 ACCCGGGTCGTCGACGTCCATGTGCAGCGGCTGCGCACGAAGATCGGCCAGGACCGCATC WT_3866 ACCCGGGTCGTCGACGTCCATGTGCAGCGGCTGCGCACGAAGATCGGCCAGGACCGCATC
************************************************************
BM38.2_3866 GAGACGGTCCGCGGTTTCGGTTACAAGCTGAAGGCCTGA[配列番号3]
WT_3866 GAGACGGTCCGCGGTTTCGGTTACAAGCTGAAGGCCTGA[配列番号17]
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>WT_3866翻訳された遺伝子産物
LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPDGLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGADDYVAKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQPVALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETVRGFGYKLKA[配列番号18]
>BM38.2_3866翻訳された遺伝子産物
LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPDGLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGADDYVTKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQPVALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETVRGFGYKLKA[配列番号4]
BM38.2_4755 TTGCACGGGAAGACCGAGACACCGGTGGAGGGCATGACCGAGGAAGAGTTCGACGCTTTC WT_4755 TTGCACGGGAAGACCGAGACACCGGTGGAGGGCATGACCGAGGAAGAGTTCGACGCTTTC
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BM38.2_4755 TACGCGGCCGCGTTCCCCCGCCTGACCGGACAGTTGTACGTCTTCACCGGTGACCTCGGC WT_4755 TACGCGGCCGCGTTCCCCCGCCTGACCGGACAGTTGTACGTCTTCACCGGTGACCTCGGC
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BM38.2_4755 GAGGCCCAGGACGTCGTCCAGGAGGCGTTCGTACGGGCCTGGGACCGGCGCGGGAGGCTG WT_4755 GAGGCCCAGGACGTCGTCCAGGAGGCGTTCGTACGGGCCTGGGACCGGCGCGGGAGGCTG
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BM38.2_4755 ATCGCCGACGAGGCGCCCGAGGCGTGGGTGCGCACCGTCGCCATGCGGCTCGCGGTGAGC WT_4755 ATCGCCGACGAGGCGCCCGAGGCGTGGGTGCGCACCGTCGCCATGCGGCTCGCGGTGAGC
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BM38.2_4755 CGCTGGCGCCGCGCGAAACGCTGGCTGGAACTCGTACGGCACTCCCCGCCCCCGGAGACG WT_4755 CGCTGGCGCCGCGCGAAACGCTGGCTGGAACTCGTACGGCACTCCCCGCCCCCGGAGACG
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BM38.2_4755 ACCCCCGGCCCGGGCCCCGACCGCACCGCCCTGGTCGCCGCGCTGCGCCAACTGCCCGAG WT_4755 ACCCCCGGCCCGGGCCCCGACCGCACCGCCCTGGTCGCCGCGCTGCGCCAACTGCCCGAG
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BM38.2_4755 CACCAGCGCATGGCCGTCGTCCTCCATCACCTGTGCGACCTCAGCGTCGAACAGGTAGCC WT_4755 CACCAGCGCATGGCCGTCGTCCTCCATCACCTGTGCGACCTCAGCGTCGAACAGGTAGCC
************************************************************
BM38.2_4755 TCCGAGACCGGCGCACCCGTGGGCACGGTCAAGGCCAGGCTCTCCCGCGGACGGGCGGCA WT_4755 TCCGAGACCGGCGCACCCGTGGGCACGGTCAAGGCCAGGCTCTCCCGCGGACGGGCGGCA
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BM38.2_4755 CTGGCCAGACATCTGGCGGTGGACGAGGCCGACGAGTCGGCCTGGAGGGAGGGCGGCCGG WT_4755 CTGGCCAGACATCTGGCGGTGGACGAGGCCGACGAGTCGGCCTGGAGGGAGGGCGGCCGT
***********************************************************
BM38.2_4755 GTCGGATGA[配列番号9]
WT_4755 GTCGGATGA[配列番号23]
*********
>WT_4755翻訳された遺伝子産物
LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDRRGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQLPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWREGGRVG[配列番号24]
>BM38.2_4755翻訳された遺伝子産物
LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDRRGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQLPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWREGGRVG[配列番号10]
BM38.2_4868 ATGCGCCCGCCCGTCACCCACCACCACCCTGCCGGAGGCGCTGCGCGCCGCCCCTATCGA WT_4868 ATGCGCCCGCCCGTCACCCACCACCACCCTGCCGGAGGCGCTGCGCGCCGCCCCTATCGA
************************************************************
BM38.2_4868 CTCTTGATCGTGGAGGACGAGAAACGCCTCGCTCTCTCCCTCGCCAAGGGACTCACCGCC WT_4868 CTCTTGATCGTGGAGGACGAGAAACGCCTCGCTCTCTCCCTCGCCAAGGGACTCACCGCC
************************************************************
BM38.2_4868 GAGGGCTACGCCGTGGACGTCGTCCACGACGGCCGGGAGGGCCTGCACCGGGCCACGGAG WT_4868 GAGGGCTACGCCGTGGACGTCGTCCACGACGGCCGGGAGGGCCTGCACCGGGCCACGGAG
************************************************************
BM38.2_4868 GGGACGTACGACCTCCTCATCCTGGACATCATGCTGCCCGGTCTCAACGGCTACCGGGTC WT_4868 GGGACGTACGACCTCCTCATCCTGGACATCATGCTGCCCGGTCTCAACGGCTACCGGGTC
************************************************************
BM38.2_4868 TGCGCCGCGCTCCGCGCCGCCGGACACGACGTGCCGATCCTGATGCTCACGGCCAAGGAC WT_4868 TGCGCCGCGCTCCGCGCCGCCGGACACGACGTGCCGATCCTGATGCTCACGGCCAAGGAC
************************************************************
BM38.2_4868 GGCGAGTACGACGAGGCGGAGGGCCTGGACACCGGCGCCGACGACTACCTCACCAAGCCG WT_4868 GGCGAGTACGACGAGGCGGAGGGCCTGGACACCGGCGCCGACGACTACCTCACCAAGCCG
************************************************************
BM38.2_4868 TTCTCGTACGTCGTCCTCGTCGCCAGGATCAAGGCGCTGCTGCGCCGCCGGCCGGCCGGG WT_4868 TTCTCGTACGTCGTCCTCGTCGCCAGGATCAAGGCGCTGCTGCGCCGCCGGCCGGCCGGG
************************************************************
BM38.2_4868 GCCTCCCC−ATCCATGTCCACGGCGACCTCAAGGTGGACACCGCCGCCCGCCGCGTCTTC WT_4868 GCCTCCCCCATCCATGTCCACGGCGACCTCAAGGTGGACACCGCCGCCCGCCGCGTCTTC
******** ***************************************************
BM38.2_4868 CTGGGCGAGGACGAAGTGGCGCTGA[配列番号13]
WT_4868 CTGGGCGAGGACGAAGTGGCGCTGA[配列番号27]
*************************
>WT_4868翻訳された遺伝子産物
MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHRATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTKPFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPIHVHGDLKVDTAARRVFLGEDEVAL[配列番号28]
>BM38.2_4868翻訳された遺伝子産物
MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHRATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTKPFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPSMSTATSRWTPPPAASS WARTKWR[配列番号14]
BM38.2_5175 ATGGTGCAGAAGGCCAAGATCCTCCTGGTCGATGACCGGCCGGAGAATCTGCTCGCGCTG WT_5175 ATGGTGCAGAAGGCCAAGATCCTCCTGGTCGATGACCGGCCGGAGAATCTGCTCGCGCTG
************************************************************
BM38.2_5175 GAGGCGATCCTCTCGGCGCTCGATCAGACGCTGGTGCGGGCATCGTCCGGGGAGGAAGCG WT_5175 GAGGCGATCCTCTCGGCGCTCGATCAGACGCTGGTGCGGGCATCGTCCGGGGAGGAAGCG
************************************************************
BM38.2_5175 CTCAAAGCGCTGCTGACGGACGACTTCGCGGTCATTCTGCTGGACGTCCAGATGCCGGGC WT_5175 CTCAAAGCGCTGCTGACGGACGACTTCGCGGTCATTCTGCTGGACGTCCAGATGCCGGGC
************************************************************
BM38.2_5175 ATGGACGGTTTCGAGACCGCGGCCCACATCAAGCGGCGGGAACGCACCCGGGACATCCCG WT_5175 ATGGACGGTTTCGAGACCGCGGCCCACATCAAGCGGCGGGAACGCACCCGGGACATCCCG
************************************************************
BM38.2_5175 ATCATCTTCCTCACCGCGATCAACCACGGTTCGCACCACACGTTCCGGGGCTACGCGGCG WT_5175 ATCATCTTCCTCACCGCGATCAACCACGGTCCGCACCACACGTTCCGGGGCTACGCGGCG
****************************** *****************************
BM38.2_5175 GGTGCGGTCGACTACATCTCGAAGCCGTTCGACCCGTGGGTGCTGCGCGCGAAGGTCTCG WT_5175 GGTGCGGTCGACTACATCTCGAAGCCGTTCGACCCGTGGGTGCTGCGCGCGAAGGTCTCG
************************************************************
BM38.2_5175 GTCTTCGTCGAGCTGTACATGAAGAACTGCCAGCTGCGGGAGCAGGCGGCGCTGCTGCGG WT_5175 GTCTTCGTCGAGCTGTACATGAAGAACTGCCAGCTGCGGGAGCAGGCGGCGCTGCTGCGG
************************************************************
BM38.2_5175 CTCCAGTTGGACGGCGGCGAGAAGGACGATGCCGAGGCAGGCGACTCGGCGGGGCTGCTC WT_5175 CTCCAGTTGGACGGCGGCGAGAAGGACGATGCCGAGGCAGGCGACTCGGCGGGGCTGCTC
************************************************************
BM38.2_5175 GCCGAGCTGTCGGCGCGGCTCGCGGCCGTCGAGGAGCAGGCCGAGGCGCTGACCAAGCAG WT_5175 GCCGAGCTGTCGGCGCGGCTCGCGGCCGTCGAGGAGCAGGCCGAGGCGCTGACCAAGCAG
************************************************************
BM38.2_5175 CTCAACGACGAGTCGACGGACGCGGCCGCGGTGGCCACGGCGGCTCATCTGGAGCGCAAG WT_5175 CTCAACGACGAGTCGACGGACGCGGCCGCGGTGGCCACGGCGGCTCATCTGGAGCGCAAG
************************************************************
BM38.2_5175 CTCACGGGGTTGCGGCGGGCGCTGGACGCCCTGGAGCCCGGGACCGGCAGCGCGTCGTCG WT_5175 CTCACGGGGTTGCGGCGGGCGCTGGACGCCCTGGAGCCCGGGACCGGCAGCGCGTCGTCG
************************************************************
BM38.2_5175 GTGCCGTCGCAGAACTGA[配列番号5]
WT_5175 GTGCCGTCGCAGAACTGA[配列番号19]
******************
>WT_5175翻訳された遺伝子産物
MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQMPGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGPHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVFVELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLNDESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN[配列番号20]
>BM38.2_5175翻訳された遺伝子産物
MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQMPGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGSHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVFVELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLNDESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN[配列番号6]
BM38.2_5387 ATGGTGCGGGAAGCGCTGGCCGCACTGCTCGAACTCGAGGACGACATCCGGGTGGTGGCA
WT_5387 ATGGTGCGGGAAGCGCTGGCCGCACTGCTCGAACTCGAGGACGACATCCGGGTGGTGGCA
************************************************************
BM38.2_5387 GAAGTCGGCTCCGGTGAGGACGTACTCGACGCGGCCAGGGGAACACGTCCCGACCTCGTG
WT_5387 GAAGTCGGCTCCGGTGAGGACGTACTCGACGCGGCCAGGGGAACACGTCCCGACCTCGTG
************************************************************
BM38.2_5387 ATCGTGGACGTCAACATGCCGGGACTCGACGGGCTCACCGCGGCCGAGCGGCTGCGCGAG
WT_5387 ATCGTGGACGTCAACATGCCGGGACTCGACGGGCTCACCGCGGCCGAGCGGCTGCGCGAG
************************************************************
BM38.2_5387 CAGCTGCCCGACTCCCGCATCCTGGTGCTGACCGTCCTGGACGCGCCCAACGTCCTGCGC
WT_5387 CAGCTGCCCGACTCCCGCATCCTGGTGCTGACCGTCCTGGACGCGCCCAACGTCCTGCGC
************************************************************
BM38.2_5387 CGGGCGCAGGACGTCCGGGTCGACGGCTACCTCGTCAAGAACGCTCCGGTGGAGCACCTC
WT_5387 CGGGCGCAGGACGTCCGGGTCGACGGCTACCTCGTCAAGAACGCTCCGGTGGAGCACCTC
************************************************************
BM38.2_5387 GTCAAGGCCGTGCGCCAGATCATGGCCGGGGAACGCGTCATCTCACCGGAGCTGGCGCTG
WT_5387 GTCAAGGCCGTGCGCCAGATCATGGCCGGGGAACGCGTCATCTCACCGGAGCTGGCGCTG
************************************************************
BM38.2_5387 GCCGCCTGGGAGGGCAAGGCCAGCCCGCTCACCGCGCGGGAGGCCGATGTGCTCCGGATC
WT_5387 GCCGCCTGGGAGGGCAAGGCCAGCCCGCTCACCGCGCGGGAGGCCGATGTGCTCCGGATC
************************************************************
BM38.2_5387 GCGGCGGCCGGCGCGGAGACCGCCGAGATCGCCGAGTACCTGCATCTTTCACCGGGCACG
WT_5387 GCGGCGGCCGGCGCGGAGACCGCCGAGATCGCCGAGTACCTGCATCTTTCACCGGGCACG
************************************************************
BM38.2_5387 GTGCGGAACTCCATGACCACCATCATCGCCAAGCTCGACGCGCGCAACCGGCTCGACGCC
WT_5387 GTGCGGAACTACATGACCACCATCATCGCCAAGCTCGACGCGCGCAACCGGCTCGACGCC
********** *************************************************
BM38.2_5387 ATCCGCATCGCACGCGACGCCGGGTGGCTCCTCAACTCCTGA[配列番号7]
WT_5387 ATCCGCATCGCACGCGACGCCGGGTGGCTCCTCAACTCCTGA[配列番号21]
******************************************
>WT_5387翻訳された遺伝子産物
MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAERLREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELALAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNYMTTIIAKLDARNRLDAIRIARDAGWLLNS[配列番号22]
>BM38.2_5387翻訳された遺伝子産物
MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAERLREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELALAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNSMTTIIAKLDARNRLDAIRIARDAGWLLNS[配列番号8]
Claims (15)
- 配列番号2のアミノ酸配列と95%以上のアミノ酸配列同一性を有するOrf2798タンパク質をコードする改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株であって;
前記Orf2798タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸2位にセリン残基を含み;そして
ここで、野生型ストレプトマイセス・フンジシディカス菌株で得られるものと比較して、増強したエンデュラシジンの産生が前記改変ストレプトマイセス・フンジシディカスで得られる、分離株。 - 前記Orf2798タンパク質が配列番号1のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 配列番号4のアミノ酸配列と95%以上のアミノ酸配列同一性を有するOrf3866タンパク質をさらにコードし;ここで、前記Orf3866タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸124位にトレオニン残基を含む、請求項1または2に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 前記Orf3866タンパク質が配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項3に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 配列番号6のアミノ酸配列と95%以上のアミノ酸配列同一性を有するOrf5175タンパク質をさらにコードし;ここで、前記Orf5175タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸91位にセリン残基を含む、請求項1、2、3または4に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 前記Orf5175タンパク質が配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項5に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 配列番号8のアミノ酸配列と95%以上のアミノ酸配列同一性を有するOrf5387タンパク質をさらにコードし;ここで、前記Orf5387タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸164位にセリン残基を含む、請求項1、2、3、4、5または6に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 前記Orf5387タンパク質が配列番号7のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項7に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 配列番号9のヌクレオチド配列をさらに含むが、配列番号23のヌクレオチド配列を含まない、請求項1、2、3、4、5、6、7または8に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 機能的Orf682タンパク質をコードしない、請求項1、2、3、4、5、6、7、8または9に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 機能的Orf682タンパク質の欠如が、前記Orf682タンパク質をコードする遺伝子中にフレームシフト突然変異を含む改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株によるものである、請求項10に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 機能的Orf4868タンパク質をコードしない、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 機能的Orf4868タンパク質の欠如が、前記Orf4868タンパク質をコードする遺伝子中にフレームシフト突然変異を含む改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株によるものである、請求項12に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株。
- 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13に記載の改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株を、エンデュラシジンを産生するのに十分な条件下、培養培地で培養することを含む、エンデュラシジンの産生方法。
- 前記培養培地から前記エンデュラシジンを単離することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
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