RU2773311C2 - Модифицированные изоляты streptomyces fungicidicus и их применение - Google Patents

Модифицированные изоляты streptomyces fungicidicus и их применение Download PDF

Info

Publication number
RU2773311C2
RU2773311C2 RU2019117260A RU2019117260A RU2773311C2 RU 2773311 C2 RU2773311 C2 RU 2773311C2 RU 2019117260 A RU2019117260 A RU 2019117260A RU 2019117260 A RU2019117260 A RU 2019117260A RU 2773311 C2 RU2773311 C2 RU 2773311C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ala
leu
arg
val
gly
Prior art date
Application number
RU2019117260A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019117260A (ru
RU2019117260A3 (ru
Inventor
Т Марк ЗАБРИСКИ
Original Assignee
Интервет Интернэшнл Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Интервет Интернэшнл Б.В. filed Critical Интервет Интернэшнл Б.В.
Priority claimed from PCT/EP2017/073771 external-priority patent/WO2018103905A1/en
Publication of RU2019117260A publication Critical patent/RU2019117260A/ru
Publication of RU2019117260A3 publication Critical patent/RU2019117260A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2773311C2 publication Critical patent/RU2773311C2/ru

Links

Images

Abstract

Группа изобретений относится к штамму Streptomyces fungicidicus для продуцирования эндурацидина и способу получения эндурацидина с использованием указанного штамма. Предложен штамм Streptomyces fungicidicus, продуцирующий эндурацидин и имеющий депозитарный номер ATCC PTA-122342. Также предложен способ получения эндурацидина, включающий культивирование указанного штамма Streptomyces fungicidicus в культуральной среде в условиях, достаточных для получения эндурацидина, и выделение эндурацидина из культуральной среды. Группа изобретений обеспечивает эффективное продуцирование эндурацидина. 2 н.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр., 1 ил.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке в соответствии со ст.35 Кодекса законов США 119(с) испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США рег.№62/430455, поданной 6 декабря 2016 г., содержание которой во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, к композициям, содержащим эти изоляты, и к способам применения таких изолятов и композиций для биологического синтеза эндурацидина (энрамицина). Настоящее изобретение также относится к модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, которые биологически синтезируют эндурацидин и способствуют более эффективному продуцированию энрамицина.
Предпосылки создания изобретения
Эндурацидин, также известный как энрамицин и имеющийся в продаже как Энрадин, в соответствии с программой Охраны здоровья животных MSD, представляет собой природный липодепсипептидный антибиотик из 17 аминокислот, который биологически синтезируется и секретируется бактерией Streptomyces fungicidicus, то есть природным продуцентом эндурацидина.
Эндурацидин представляет собой родовое название аналогов эндурацидина и включает эндурацидины A, B, C и D. Этот пептид может быть выделен из сбраживающего бульона, а в первую очередь, мицелиев в виде смеси эндурацидинов А и В, которые отличаются одним атомом углерода в присоединенной липидной цепи. По своей структуре, эндурацидины отличаются по С12 или С13-2Z,4E- разветвленной молекуле жирной кислоты, связанной амидной связью с остатком аспарагиновой кислоты, и присутствием множества непротеиногенных аминокислотных остатков, таких как эндурацидидин, 4-гидроксифенилглицин, 3,5-дихлор-4-гидроксифенилглицин, цитруллин и орнитин.
Эндурацидин обладает сильной антибактериальной активностью in vitro и in vivo, направленной против грамположительных микроорганизмов широкого спектра, включая Clostridium perfringens, резистентный к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) и резистентный к ванкомицину Enterococcus (VRE). Эндурацидин ингибирует биосинтез пептидогликана бактериальной клеточной стенки посредством образования комплекса с внеклеточным липидом II, то есть предшественником клеточной стенки бактерий. Сайт образования комплекса липида II с эндурацидином отличается тем, что он распознается ванкомицином и ответственен за действие эндурацидина, направленное против микроорганизмов, резистентных к ванкомицину. В настоящее время не существует какого-либо документального подтверждения перекрестной резистентности эндурацидина с любыми применяемыми в клиниках антибиотиками, а также нет никаких данных о эволюционной, приобретенной или передаваемой резистентности. Благодаря отсутствию какой-либо известной формы механизма передачи резистентности, отсутствию биодоступности при пероральном введении, низкой токсичности, а также значительной антибактериальной активности по отношению к Clostridium spp., эндурацидин является ключевым антибиотиком для борьбы с энтеритом, вызываемым клостридиями у домашней птицы.
В соответствии с этим, эндурацидин, при его введении в корм домашней птицы, ингибирует рост бактерий, которые вызывают некротический энтерит и нарушение роста у домашней птицы. Эндурацидин также не имеет синдрома отмены. Кроме того, эндурацидин является стабильным в корме и в гранулах, может быть введен курам в очень низкой дозе и не остается в мясе и яйцах кур, обработанных этим средством.
В последние годы был получен ряд штаммов Streptomyces fungicidicus, которые были модифицированы для повышения эффективности этих эндурацидин-продуцирующих микроорганизмов, например, Streptomyces fungicidicus В-5477 (IFO-12439, АТСС-21013) и Streptomyces fungicidicus В-5477-m (IFO-12440, АТСС-21014) [см., например, патент США 3577530, патент США 3786142 и патент США 4465771]. Однако необходимость дальнейшего улучшения таких модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus для продуцирования еще более эффективных эндурацидин-продуцирующих микроорганизмов остается актуальной.
Любые цитируемые здесь документы не должны рассматриваться как указание на то, что эти документы относятся к «предшествующему уровню техники».
Сущность изобретения
В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к новым модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, которые более эффективно продуцируют эндурацидин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus, кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В других вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В других вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; Orf3866, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; Orf5175, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и Orf5387, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В родственных вариантах осуществления изобретения, модифицированный Streptomyces fungicidicus: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus обладает иммуногенными и/или физическими и/или генетическими свойствами модифицированного изолята Streptomyces fungicidicus, имеющего депозитарный номер ATCC PTA-122342. В более конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus представляет собой изолят, имеющий депозитарный номер ATCC PTA-122342, или потомство и/или производное изолята, имеющего депозитарный номер ATCC PTA-122342. В родственном аспекте изобретения, все модифицированные Streptomyces fungicidicus согласно изобретению также рассматриваются как выделенные модифицированные изоляты Streptomyces fungicidicus.
В настоящее изобретение также входят наборы праймеров, имеющие нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO: 29 и 30; SEQ ID NO: 31 и 32; SEQ ID NO: 33 и 34; SEQ ID NO: 35 и 36; SEQ ID NO: 37 и 38; SEQ ID NO: 39 и 40; SEQ ID NO: 41 и 42; SEQ ID NO: 43 и 44; SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 49 и 50; и/или любые их комбинации. Кроме того, наборы, содержащие один или более из таких наборов праймеров, также являются частью настоящего изобретения. Кроме того, в настоящее изобретение входит применение этих праймеров в анализе на идентификацию генома Streptomyces fungicidicus согласно изобретению.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут более поняты со ссылкой на Чертежи, Подробное описание и Примеры.
Краткое описание чертежа
На фиг.1 показано положение 11 полиморфизмов на геноме S. fungicidicus BM38, используемых в качестве маркеров мутации для ПЦР-скрининга, описанного ниже в Примерах.
Подробное описание изобретения
Получение вторичных бактериальных метаболитов или натуральных продуктов для их применения в коммерческих целях, например, в медицине или сельском хозяйстве, связано с такими проблемами, как низкие выходы нужного продукта из родительского микроорганизма/микроорганизма дикого типа. В последние десятилетия, благодаря прогрессу в понимании природы биосинтеза натурального продукта стало очевидным, что продуцирование вторичных метаболитов может регулироваться и контролироваться несколькими способами. В большинстве случаев, гены биосинтеза бактериальных природных продуктов, включая гены, ответственные за образование предшественника, структурную сборку, модификацию после сборки, ауторезистентность и регуляцию, образуют кластеры на бактериальной хромосоме. Биосинтез природных продуктов может быть вызван как внеклеточными, так и внутриклеточными сигнальными молекулами, которые взаимодействуют с путь-специфически регуляторами или плейотропными регуляторами, которые регулируют продуцирование более, чем одного продукта. Мутации, происходящие в любом из этих регуляторных генов или систем, могут повышать, снижать или прекращать продуцирование антибиотиков.
Улучшение штамма может играть определенную роль в экономически эффективном промышленном производстве антибиотиков или других вторичных микробных метаболитов. Мутантные штаммы, способные давать повышенные выходы конкретных метаболитов, могут быть созданы посредством случайных мутаций, путем направленной дизрупции специфических генов или путем введения гена(ов), который(е) устраняет(ют) нарушения пути биосинтеза. Было подтверждено, что генетические манипуляции регуляторных генов, а также генов биосинтеза для гиперпродуцирования специфических вторичных метаболитов, представляют собой эффективную и успешную стратегию улучшения штаммов актиномицетов. В конкретном аспекте изобретения были идентифицированы ключевые кодирующие последовательности Streptomyces fungicidicus, которые, при их модификации и/или элиминации дают изоляты с улучшенными свойствами, позволяющими осуществлять биосинтез и/или продуцирование эндурацидина в коммерческих целях.
Последовательность ДНК размером в 116 тысяч пар оснований, происходящая от штамма S. fungicidicus ATCC 21013 дикого типа, который имеет кластер гена биосинтеза эндурацидина и его фланкирующие области, была уже описана в литературе [в патенте США 8188245, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки] и имеется в GenBank [рег.No. DQ403252]. Как показано ниже, была определена общая геномная последовательность BM38-2 (ATCC NO. PTA-122342), и эту последовательность сравнивали с геномом дикого типа. Такой сравнительный анализ позволил идентифицировать по меньшей мере 77 полиморфизмов или мутационных различий между геномами, и провести отбор семи (7) ключевых открытых рамок считывания, которые относятся к улучшенным свойствам ATCC NO. PTA-122342, как показано ниже. Однако было неожиданно обнаружено, что ни одна из этих семи ключевых открытых рамок считывания не ассоциируется с кластером гена биосинтеза эндурацидина и его фланкирующими областями хромосомы S. fungicidicus. Однако независимо от этого, модификация этих семи ключевых открытых рамок считывания позволяет облегчить конструирование новых модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus с помощью стандартной рекомбинантной технологии, и эти изоляты будут иметь свойства, сравнимые со свойствами уже известных изолятов, или даже будут обладать гораздо лучшими свойствами.
Использование терминов в единственном числе для удобства описания никоим образом не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения. Так, например, термин «изолят» включает один или более таких изолятов, если это не оговорено особо. Использование терминов во множественном числе также не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения, если это не оговорено особо.
Используемый здесь термин «приблизительно» является синонимом термина «около» и обычно означает величину в пределах двадцати пяти процентов от указанной величины, если это не оговорено особо, например, увеличение уровня продуцирования эндурацидина «приблизительно» в 4 раза может означать увеличение продуцирования в 3-5 раз.
Используемая здесь одна аминокислотная последовательность является на 100% «идентичной» второй аминокислотной последовательности, если аминокислотные остатки обеих последовательностей являются идентичными. В соответствии с этим, аминокислотная последовательность является на 50% «идентичной» второй аминокислотной последовательности, если 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнения последовательностей осуществляют по всей непрерывной последовательности аминокислотных остатков, содержащихся в данном белке, например, в сравниваемом белке или в части полипептида. В конкретном варианте осуществления изобретения, во внимание принимаются также выбранные делеции или инсерции, которые могут как-либо иначе влиять на соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.
Процент идентичности используемых здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью алгоритма C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W, где параметры выравнивания и параметры оценки идентичности используются по умолчанию. Эти коммерчески доступные программы могут быть также применены для определения сходства последовательностей с использованием тех же самых или аналогичных параметров по умолчанию. Альтернативно, может быть проведен поиск с помощью модифицированной программы Blast в условиях фильтрации по умолчанию, например, с использованием программы Pileup GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) с параметрами по умолчанию.
Используемый здесь микроорганизм, который «не содержит функционального» полипептида, или в котором «отсутствует функциональный» полипептид (например, Orf682), представляет собой микроорганизм, который не экспрессирует этот полипептид и/или экспрессирует модифицированный полипептид, природная биологическая функция которого составляет максимум 10% от природной биологической функции соответствующего полипептида дикого типа, например, усеченного фермента, который обладает ферментативной активностью (например, ферментативной эффективностью, то есть Vmax/Km) по отношению к его природному субстрату, где такая активность составляет максимум 10% от активности соответствующего фермента дикого типа, как было определено путем проведения стандартного анализа в тех же самых условиях. В конкретных вариантах осуществления изобретения, «отсутствие функционального» полипептида в микроорганизме эквивалентно отсутствию конкретной биологической функции этого полипептида.
Используемая здесь открытая рамка считывания, которая является «отключенной», была модифицирована, например, путем введения делеции в рамку считывания, сдвига рамки считывания, инсерции и/или точковой мутации, в результате чего микроорганизм, который содержит «отключенную» открытую рамку считывания, вообще не экспрессирует полипептид, кодируемый соответствующей рамкой считывания дикого типа и/или экспрессирует модифицированный полипептид, природная биологическая функция которого составляет максимум 10% от природной биологической функции соответствующего полипептида дикого типа. В конкретных вариантах осуществления изобретения, в микроорганизме, содержащем «отключенную» открытую рамку считывания, наблюдается отсутствие конкретной биологической функции полипептида, кодируемого открытой рамкой считывания дикого типа.
Используемый здесь термин «генный кластер» означает набор генетических элементов, сгруппированных вместе на хромосоме, где белковые продукты этих кластеров обладают родственной функцией, такой как способность осуществлять природный путь биосинтеза продукта.
Консервативной заменой является аминокислотная замена, которая, по существу, не влияет на активность (специфичность или аффинность связывания) молекулы. Обычно, консервативные аминокислотные замены включают замены одной аминокислоты на другую аминокислоту с теми же самыми химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В нижеследующей таблице представлены репрезентативные консервативные аминокислотные замены:
Исходный остаток Консервативные замены Исходный остаток Консервативные замены
Ser Leu Ile; Val
Arg Arg; Gln; Glu
Asn Gln; His Met Leu; Ile
Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
Cys Ser Ser Thr
Gln Asn Thr Ser
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp; Phe
His Asn; Gln Val Ile; Leu
Получение модифицированного Streptomyces fungicidicus
Подходящие методы и материалы для осуществления раскрытых вариантов изобретения описаны ниже. Кроме того, осуществление раскрытых вариантов изобретения может быть проведено с применением любых соответствующих методов или технологий, хорошо известных специалистам. Некоторые стандартные методы и технологии согласно изобретению описаны, например, в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (и Дополнение к изданию 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; и Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A.: Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 &UH, England, 2000.
Рекомбинантные экспрессионные плазмидные векторы Streptomyces fungicidicus могут быть получены для их применения в целях создания модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus, экспрессируемую под контролем промотора. В других вариантах осуществления изобретения, промотором является сильный конститутивный промотор Streptomyces, который способствует усилению продуцирования эндурацидина, если вектор экспрессируется в штамме Streptomyces fungicidicus. В некоторых вариантах осуществления изобретения, открытая рамка считывания, вместо собственного нативного промотора, функционально присоединена к гетерологичному промотору. Так, например, она может быть функционально присоединена к конститутивному промотору, такому как сильный конститутивный экспрессионный промотор или индуцибельный промотор. В конкретных вариантах осуществления изобретения, сильным конститутивным промотором является ermE*p, происходящий от продуцента эритромицина, Saccharopolyspora erythraea. В других вариантах, индуцибельным промотором является индуцибельный промотор тиострептона, tipA. В других вариантах осуществления изобретения используется система P(nitA)-NitR [Herai et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 101(39):14031-14035 (2004)] или промотор стрептомицетов SF14. В других вариантах осуществления изобретения используется нативный промотор гена резистентности к апрамицину amRp.В других вариантах осуществления изобретения используются PhrdB, Ptcp830 и/или Pneos. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор содержит открытую рамку считывания orf2798, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и/или открытую рамку считывания orf682, которая была «отключена».
В соответствии с этим могут быть сконструированы рекомбинантные штаммы Streptomyces fungicidicus, способные давать более высокие выходы эндурацидина по сравнению со штаммом Streptomyces fungicidicus дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный штамм Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus, введенную в хромосому и экспрессируемую под контролем промотора, такого как сильный конститутивный экспрессионный промотор Streptomyces, который способствует повышению уровня продуцирования эндурацидина в сконструированном штамме. В других вариантах осуществления изобретения, экспрессия введенной открытой рамки считывания в Streptomyces fungicidicus индуцируется не собственным нативным промотором, а гетерологичным промотором. Так, например, она может быть функционально присоединена к конститутивному промотору, такому как сильный конститутивный экспрессионный промотор или индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сильным конститутивным промотором является ermE*p.В других вариантах осуществления изобретения, индуцибельным промотором является tipA. В некоторых примерах используется система P(nitA)-NitR [см. выше] или промотор SF14. В других вариантах осуществления изобретения, конститутивным экспрессионным промотором является amRp.В других вариантах осуществления изобретения используются промоторы PhrdB, Ptcp830 и/или Pneos.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм содержит открытую рамку считывания orf3866 Streptomyces fungicidicus. В конкретных вариантах этого типа, открытая рамка считывания orf3866 функционально присоединена к гетерологичному промотору. Так, например, она может быть присоединена к сильному конститутивному промотору, такому как ermE*p.В других примерах, открытая рамка считывания orf3866 функционально присоединена к промотору tipA, SF14, amRp, PhrdB, Ptcp830 и/или Pneos.
В других вариантах осуществления изобретения, сконструированый штамм кодирует измененную открытую рамку считывания orf4868. Открытая рамка считывания orf4868 может быть отключена посредством инсерционной дизрупции, делеции в рамке считывания, сдвига рамки считывания и/или точковой мутации. В некоторых примерах, открытая рамка считывания orf4868 отключена посредством делеции в рамке считывания. Вообще говоря, любая внутренняя делеция рамки считывания orf4868, из-за ее дефекта, должна приводить к отключению функции orf4868. В родственных вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм включает две, три, четыре, пять, шесть, семь или более открытых рамок считывания Streptomyces fungicidicus.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus происходит от родительского штамма дикого типа, такого как, но не ограничивающегося ими, Streptomyces fungicidicus, имеющийся в Американской коллекции тканевых культур (ATCC) No. 21013. В других вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм Streptomyces fungicidicus происходит от стандартных мутантных штаммов, таких как, но не ограничивающихся ими, штаммы Streptomyces fungicidicus ATCC 31729, Streptomyces fungicidicus ATCC 31730 и Streptomyces fungicidicus ATCC 31731.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровень продуцирования эндурацидина по меньшей мере в 1,2 раза, например, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, включая, но не ограничиваясь ими, в 1,2-10 раз, 1,2-4,6 раз и приблизительно в 2-5 раз превышает уровень продуцирования эндурацидина по сравнению со штаммом Streptomyces fungicidicus дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный Streptomyces fungicidicus может быть сконструирован путем интеграции рекомбинантной плазмиды, содержащей по меньшей мере одну открытую рамку считывания, усиливающую продуцирование эндурацидина, в хромосому родительского штамма Streptomyces fungicidicus. Интегрированный сопряженный вектор может иметь, или может быть сконструирован так, чтобы он имел сильный конститутивный промотор Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления изобретения, плазмида может не содержать репликона стрептомицетов и может быть интегрирована в хромосому посредством гомологичной рекомбинации под действием одного сайт-специфического кроссинговера. В других вариантах осуществления изобретения, плазмида может присутствовать в виде свободной плазмиды. В некоторых вариантах осуществления изобретения, может быть сконструирован сопряженный вектор, в котором плазмидная вставка имеет частично или полностью делетированный представляющий интерес ген и его фланкирующие области, которые могут быть интегрированы в хромосому после двойной гомологичной рекомбинации посредством кроссинговера с образованием мутанта, имеющего делецию в рамке считывания.
Продуцирование эндурацидина из рекомбинантных штаммов Streptomyces fungicidicus
Рекомбинантные штаммы Streptomyces fungicidicus, раскрываемые в настоящей заявке, были использованы для разработки способов получения повышенных уровней эндурацидина. Технический прогресс в данной области позволяет значительно сэкономить затраты, связанные с производством эндурацидина. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ получения эндурацидина включает культивирование раскрытого здесь рекомбинантного штамма Streptomyces fungicidicus в условиях, достаточных для получения эндурацидина. В других вариантах осуществления изобретения, этот способ также включает выделение эндурацидина из культуральной среды после культивирования. В других вариантах осуществления изобретения, способ также содержит определение антибактериальной активности полученного эндурацидина, например, с помощью ВЭЖХ-анализа или биоанализа с использованием S. aureus ATCC 29213 или Bacillis subtilis ATCC 6633 с указанием микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндурацидин получают с использованием раскрытого здесь штамма Streptomyces fungicidicus в условиях ферментации, описанных ранее для получения эндурацидина [Higashide et al., J. Antibiot. 21:126-137 (1968)]. После получения, соединения могут быть очищены и/или проанализированы с помощью ВЭЖХ-анализа. Методы получения эндурацидина и сбора этого соединения из культуральной среды можно найти в патенте США 4465771, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, раскрытый здесь изолят Streptomyces fungicidicus согласно изобретению культивируют в бульоне из триптона и сои (TSB) на шейкере (таком как шейкер, работающий на 225 об/мин и при 30°C в течение 48 часов), а затем переносят в среду для продуцирования эндурацидина (EPM, см. ниже Таблицу 1) на определенный период времени проведения непрерывной ферментации, например, по меньшей мере на пять дней и до одиннадцати дней, включая 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 дней непрерывной ферментации. В более конкретных вариантах осуществления изобретения, получение эндурацидина с использованием штаммов дикого типа и их производных осуществляют в автоматических ферментерах.
Таблица 1
Состав среды для получения эндурацидина (EPM) (pH 6,7)
Растворимый крахмал 1,5 KH2PO4 0,05
Глюкоза 1,0 (NH4)2SO4 0,15
Кукурузная мука 2,5 CaCO3 0,5
Мука из кукурузного глютена 2,0 Лактоза 0,5
Кукурузный жидкий сироп 0,25 ZnCl2 0,005
Хлорид натрия 0,25 Куриный жир 0,7
NaH2PO4 1,3
Таблица 2
Список последовательностей
SEQ ID NO: Открытая рамка считывания Тип SEQ ID NO: Открытая рамка считывания Тип
ATCC No. PTA-122342 WT B 5477
1 Orf2798 NA 15 Orf2798 NA
2 Orf2798 AA 16 Orf2798 AA
3 Orf3866 NA 17 Orf3866 NA
4 Orf3866 AA 18 Orf3866 AA
5 Orf 5175 NA 19 Orf 5175 NA
6 Orf 5175 AA 20 Orf 5175 AA
7 Orf5387 NA 21 Orf5387 NA
8 Orf5387 AA 22 Orf5387 AA
9 Orf4755 NA 23 Orf4755 NA
10 Orf4755 AA 24 Orf4755 AA
11 Orf682 NA 25 Orf682 NA
12 Orf682 AA 26 Orf682 AA
13 Orf4868 NA 27 Orf4868 NA
14 Orf4868 AA 28 Orf4868 AA
AA означает аминокислотную последовательность; NA означает последовательность нуклеиновой кислоты.
Биологический депозит
Культуры нижеследующего биологического материала были депонированы в нижеследующем Международном депозитарии: Американской коллекции типовых культур (ATCC) 10801, University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., в условиях, удовлетворяющих требованиям Будапештского договора.
Организм Регистрационный No. Дата депонирования
Streptomyces fungicidicus
(BM38-2)		 PTA-122342 5 августа 2015
Настоящее изобретение будет более очевидным со ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры, которые представлены как репрезентативные. Нижеследующие примеры приводятся для более полной иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Однако эти примеры никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Примеры
Пример 1
Модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus
Получение биомассы Streptomyces fungicidicus для ее применения в целях биосинтеза эндурацидина
Ферментация Streptomyces fungicidicus может быть проведена в глубоких промышленных ферментерах резервуарного типа, прошедших санитарную обработку и снабженных системами мониторинга и контроля рН, температуры, кислорода, аэрации и встряхивания. Каждую ферментированную партию S. fungicidicus берут из охарактеризованной и регулируемой рабочей посевной маточной культуры для продуцирования, хранящейся в охраняемом помещении в условиях низких температур. Процесс ферментации осуществляют в три стадии с последующим проведением дополнительной обработки, описанной ниже:
Стадия I:
Рабочие посевные культуры, содержащие 107-1010 спор/мл, могут быть использованы для инициации продуцирования партий ферментации. 1-5 сосудов с замороженнй посевной культурой, хранящейся при низкой температуре, вынимают и либо оттаивают на лабораторном столике, либо помещают на водяную баню при 28-32°C до оттаивания содержимого сосудов. Оттаянную(ые) культуру(ы) асептически переносят в 800-1000 мл стерильной воды, хранящейся при комнатной температуре, и осторожно перемешивают для ресуспендирования культуры.
Стадия II:
Ресуспендированную культуру асептически переносят в посевную среду. Посевная среда состоит из глюкозы (0,5 г/л), декстрина (2,5 г/л), жидкого кукурузного сиропа (1,0-4,0 мл/л), соевого порошка (3,0 г/л), сульфата аммония (0,25 г/л), монофосфата калия (0,13-0,54 г/л), сульфата железа (0,00-0,5 г/л), гидроксида калия (0,13 мл/л), осажденного карбоната кальция (1,5 г/л), противовспенивающего агента на основе кремния (0,1 мл/л) и воды, добавляемой в достаточном количестве. Среду стерилизуют при 125°С в течение 45 минут, а затем охлаждают до 28°С.Объем среды регулируют с использованием стерильной воды до получения нужного рабочего объема. рН доводят до 6,6-6,8. Рабочие параметры промышленного посевного цикла включают: температуру инкубирования 28°С±2°С, внутреннее давление 0,5-1,5 кг/см2, скорость аэрации 2-4 Нм3/мин, и скорость перемешивания приблизительно 80 оборотов в минуту, в зависимости от размера и конфигурации сосуда. Затем проводят мониторинг рН и потребления кислорода и мониторинг вязкости, но эти параметры не регулируют. Культивирование осуществляют в течение 50-60 часов, а затем переносят в основной ферментер для получения культуры. Вязкость в момент переноса должна составлять в пределах 350-600 сП, а рН должен составлять ≤6,0, при этом, потребление кислорода должно увеличиваться. Посевную культуру асептически переносят в основную среду для ферментации в целях завершения цикла ферментации.
Стадия III:
Состав среды в основном ферментере для получения культуры включает: кукурузную муку (13,0-15,0 мас./об.%), кукурузную глютеновую муку (3,0-6,0% мас./об.), муку из семян хлопчатника (0,3 мас./об.%), жидкий кукурузный сироп (0-0,6 об./об.%), хлорид натрия (0,3% мас./об.), сульфат аммония (0,25-0,6 мас./об.%), молочную кислоту (0-0,5 об./об.%), хлорид цинка (0,01% мас./об.), сульфат железа (0,0-0,02% мас./об.), гидроксид калия (0,20-0,5 об./об.%), сульфат кальция (0,0-0,5% мас./об.), осажденный карбонат кальция (0,5% мас./об.), альфа-амилазу (0,056% мас./об.), гидроксид калия (0,05 об./об.%), соевое масло (0,5-2,0 об./об.%), противовспенивающий агент и достаточное количество воды. Ингредиенты добавляют в указанном порядке. Воду добавляют к ингредиентам вплоть до введения альфа-амилазы, а затем полученную композицию нагревают до 80°С в течение 15 минут для того, чтобы фермент разлагал сложные углеводы. После этого добавляют остальные ингредиенты, рН доводят до pH 6,6-6,8, и добавляют достаточное количество воды. Среду стерилизуют при 125°С в течение 45 минут, охлаждают до 28°C, и добавляют воду в количестве, достаточном для достижения желаемого рабочего объема.
Содержимое ферментера для посева переносят в основную среду для ферментации, и в ферментере создают следующие условия: температуру 28°С, скорость аэрации 40 Нм3/мин, внутреннее давление 0,5 кг/см2, и скорость аэрации, эквивалентную скорости, установленной приблизительно на 1,85 кВт/м3. Рабочие условия изменяют через два часа после начала цикла ферментации путем доведения уровня растворенного кислорода до 12,75 м.д., повышения скорости аэрации до 50 Нм3/мин, и увеличения внутреннего давления до 0,7 кг/см2. После этого, скорость аэрации, внутреннее давление и скорость перемешивания корректируют для гарантии того, что уровень растворенного кислорода не будет скорость-ограничивающим. В культуру добавляют стерильную воду, если вязкость повышается до точки, при которой наблюдается ограничение уровня растворенного кислорода. В течение всего цикла, тщательно регулируют пенообразование для предотвращения загрязнения или оттока культуры. Приблизительно через 3 часа после увеличения подаваемого кислорода начинают осуществлять регуляцию рН. В течение всего цикла ферментации осуществляют регуляцию и/или мониторинг следующих параметров: рН, аэрации, растворенного кислорода, CО2, вязкости, чистоты, скорости перемешивания, внутреннего давления и остаточного сахара. До прекращения роста бактерий, рН поддерживают на уровне 6,8, а затем его можно изменять вплоть до сбора. Типичный цикл ферментации составляет 220-300 часов. Культура считается готовой для сбора, если активность при биоанализе превышает 5000 мкг/л, рН повышается до рН 7,5 или более, вязкость уменьшается, а потребление кислорода прекращается. Культуру после ферментации собирают путем нагревания культуры до 70°С в течение 30 минут для инактивации бактерий, а затем собранную жидкость охлаждают до 25°-28°С.
Последующая обработка:
Из биомассы удаляют воду, после чего биомассу сушат, а затем формуют в предварительную смесь.
Пример 2
Эффект оптимизации продуцирования эндурацидина штаммом Streptomyces fungicidicus
В последние годы было достигнуто увеличение выходов путем обработки родительского штамма (как указано в Таблице 3). Штамм BM38-2 (РОТ-122342) дает самые высокие выходы эндурацидина. Штамм был оптимизирован путем обработки GAB-453 (ATCC 31729) с использованием ряда обработок с использованием методов культивирования и физических методов.
Таблица 3
Увеличение выхода Streptomyces fungicidicus B-54577
ATCC No. Штамм Обработка Выход мкг/мл
ATCC 21013
(Ранее раскрытый)		 B-5477 Родительский штамм дикого типа 730
ATCC 21014
(Ранее раскрытый)		 B-5477m γ-облучение -
ATCC 31729
(Ранее раскрытый)		 GAB-453 УФ-облучение 1290
ATCC 31730
(Ранее раскрытый)		 Emt 36-3 м-фтор-DL-тирозин 2560
ATCC 31731
(Ранее раскрытый)		 Emt 2-140 N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин+м-фтор-DL-тирозин 4360
PTA-122342 (Ранее не раскрытый) BM38-2 Множество обработок с использованием методов культивирования и физических методов 9690
Ссылка: Патент 4465771; APR 14, 1984, Nogami, et.al. Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan.
Ссылка: Патент 3577530, 4 мая 1971, для ATCC 21388.
1. ATCC 21013: Исходный штамм Streptomyces fungicidicus B-5477 дикого типа, депонированный Takeda.
2. ATCC 21014: мутант, полученный путем γ-облучения штамма B-5477 и обозначенный как B-5477m, депонированный Takeda.
3. ATCC 31729: мутант, полученный путем УФ-облучения штамма B-5477 и обозначенный как GAB-453, депонированный Takeda.
4. ATCC 31730: мутант, полученный путем культивирования B-5477 на агаровых планшетах, содержащих м-фтор-DL-тирозин (MFT); мутант, обозначенный как Emt-36-3, депонированный Takeda.
5. ATCC 31731: двойной мутант, полученный путем обработки GAB-453 сначала N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанилином, а затем м-фтор-DL-тирозином (MFT) с получением мутантного штамма, обозначенного как Emt 2-140 и депонированного Takeda.
6. ATCC 21388: штамм, близкородственный штамму Streptomyces fungicidicus (S. macrosporeus) и депонированный Squibb & Sons.
Ниже представлены энрамицины в порядке снижения выхода биосинтеза от самого высокого до самого низкого:
ATCC No. PTA-122342>ATCC 31731>ATCC 31730>ATCC 31729>ATCC 21013 и ATCC 21014.
Примечательно то, что количество полученного эндурацидина ATCC PTA-122342 более чем в два раза превышает количество следующего по продуктивности изолята, и более, чем в 12 раз превышает количество эндурацидина по сравнению с родительским штаммом дикого типа.
Пример 3
Геномный анализ изолятов Streptomyces fungicidicus
Был проведен сравнительный геномный анализ штамма Streptomyces fungicidicus дикого типа, АТСС 21013 (В-5477), и производного штамма согласно изобретению, BM38-2, который включал области вокруг кластера гена биосинтеза эндурацидина (энрамицина).
Было идентифицировано всего 77 вариантов последовательностей ДНК, отличающихся по эффектам модификации физическими методами и методами культивирования родительского штамма В-5477. Информация, полученная в результате геномного анализа, позволила провести быстрое и окончательное сравнение штаммов путем отбора 11 репрезентативных вариантов, расположенных по всему геному BM38-2, как маркеров мутации (см. фиг. 1). Для каждого из маркеров мутации были сконструированы ПЦР-праймеры, которые амплифицируют фрагменты ДНК, содержащие сайты мутации, для последующего секвенирования и сравнения (см. Таблицу 4).
ПЦР-праймеры, нацеленные на маркерные области, были использованы для анализа пяти (5) штаммов, продуцирующих энрамицин, и одного (1) близкородственного штамма, имеющегося в АТСС, включая штаммы дикого типа и мутанты, депонированные Takeda, и эти штаммы сравнивали со штаммом BM38-2. В Таблице 5 систематизированы результаты и представлены ДНК-сигнатуры для 11 маркеров мутации.
Таблица 4
Наборы ПЦР-праймеров (с их соответствующими SEQ ID NN:), используемых для амплификации 11 маркеров мутации, расположенных на геноме S. fungicidicus BM38
Марк. мут.
No.# 		SEQ ID № Последовательность WT† Последовательность
BM38-2 		Праймер SEQ праймеров Размер продукта* (п.о.)
1 29 G A SF1F GGACGATGCCATCAAAACCG 737
30 SF1R ACTGCTTGATCACCGAGGTG
2 31 AC TT SF2F CTGTTCAACCTGACCGGGAA 954
32 SF2R GAAGACCACGACCTCGATGG
3 33 G A SF3F GGGCAGGAGTTCTTGAGGAC 864
34 SF3R CCACGTCAAGAACCTGGTGA
4 35 GA AT SF4F GGCAAGTCGACCCTCATCAA 428
36 SF4R ATGACCGAGAACAGCGTCTC
5 37 A G SF5F CGCATCTGTTCCAGGCAATG 459
38 SF5R TCATCGTGGCGCATAGGTAC
6 39 G A SF6F TGTGGGGATGTCCTTCGGAA 173
40 SF6R CGACGATGCCAAGAGACTGT
7 41 AGGGCG CGGGCC SF7F GGACGATGCCATCAAAACCG 685
42 SF7R ACTGCTTGATCACCGAGGTG
8 43 AT GA SF8F TGCTGCTGTCGATCATGGAG 686
44 SF8R AGGAAGGGCTGGTAGGTCAT
9 45 G C SF9F CGAGTCCGAAGCAGAAGGAG 745
46 SF9R GGGTCGGCAACATCTTCCTC
10 47 C T SF10F GAGCACACGAGGACTGAGAG 976
48 SF10R GTACCCCCTCATAGCGCTTC
11 49 C T SF11F AGAAGTACGGGATTCGGGGA 1000
50 SF11R ACTGCTTGATCACCGAGGTG
# Маркер мутации No.; * Ожидаемый размер ПЦР-продукта;
† Штамм дикого типа (WT): ATCC 21013.
Таблица 5A
Анализ с использованием маркеров мутации для депонированных штаммов Streptomyces fungicidicus по сравнению с ATCC NO. PTA-122342
Маркер мутации No. Родительский ATCC 21013 B-5477 ATCC 21014
B-5477m		 ATCC
21388*		 ATCC
31729		 ATCC
31730		 ATCC
31731		 PTA-122342
1 WT WT WT WT WT WT M
2 WT WT WT WT WT WT M
3 WT WT WT M WT M M
4 WT WT WT WT WT WT M
5 WT WT WT M M M M
6 WT WT WT M M M M
7 WT WT WT WT WT WT M
8 WT WT WT WT WT WT M
9 WT WT WT WT WT WT M
10 WT M M M M WT M
11 WT WT WT WT WT WT M
WT=Соответствует родительскому штамму дикого типа.
M=соответствует мутированной последовательности PTA-122342.
* Штамм S. macrosporeus, близкородственный штамму S. Fungicidicus.
Таблица 5B
Мутации, объединенные с BM38-2 или используемые в качестве маркеров для сравнения с помощью ПЦР
Нуклеотид No. 21013 31729 31730 31731 BM38-2 Маркер мутации No.
565,966 WT M WT M M 4
607,443 WT M M M M
608,938 WT M M M M
890,965 WT M WT M M
2,285,216 WT WT WT WT M
2,387,796 WT WT WT WT M 7
2,387,801 WT WT WT WT M 7
2,659,327 WT M M M M
2,900,485 WT M M M M
2,963,171 WT WT WT WT M 1
3,147,522 WT M M M M
3,164,639 WT WT WT WT M 8
3,358,400 WT M M M M
3,391,492 WT M M M M
3,428,632 WT WT WT M M
3,556,837 WT M M M M
3,607,398 WT M M M M
3,651,914 WT M M M M
3,743,503 WT M M M M
3,823,662 WT M M M M
4,046,322 WT WT WT M M
4,158,534 WT M M M M
4,225,769 WT M M M M
4,281,871 WT M M M M
4,294,357 WT M M M M
4,310,521 WT M M M M 10
4,449,891 WT WT WT WT M 6
4,450,937 WT M M M M
4,458,773 WT M M M M
4,462,128 WT M M M M
4,478,416 WT M M M M
4,954,366 WT WT WT M M
4,989,329 WT M M M M
5,259,346 WT WT WT WT M
5,340,994 WT M M M M 5
5,349,716 WT M WT M M 3
5,757,177 WT WT WT WT M 11
5,906,501 WT WT WT WT M 2
5,947,737 WT M M M M
6,140,913 WT M M M M
6,260,317 WT M M M M
6,703,003 WT M M M M
6,706,989 WT M M M M
7,321,611 WT WT WT WT M 9
WT=Соответствует родительскому штамму дикого типа.
M=соответствует мутированной последовательности PTA-122342.
В таблицах 5A-5B идентифицированы генетические различия между родительским штаммом (ATCC 21013 B-5477) и уже описанными штаммами. Большинство из этих уже описанных штаммов представляют собой производные штаммов ATCC 21013 B-5477, которые были получены путем модификации методом культивирования и/или физическим методом. Наиболее явные генетические различия были обнаружены для BM38-2 (ATCC No. PTA-122342). Очевидно, что праймеры, представленные в Таблице 4, могут быть также использованы для точной идентификации отличий BM38-2 (PTA-122342) от других штаммов Streptomyces fungicidicus и/или близкородственных штаммов Streptomyces sp.
Пример 4
Анализ отобранных мутаций в S. fungicidicus BM38-2
Промышленный штамм S. fungicidicus ATCC No. PTA-122342 был получен путем проведения повторных раундов мутагенеза с последующим отбором мутантов, продуцирующих высокие уровни энрамицина. Для получения информации о мутациях, введенных в штамм ATCC No. PTA-122342, который может давать повышенные уровни энрамицина, была определена общая геномная последовательность ATCC No. PTA-122342, и эту последовательность сравнивали с ее предшественником S. fungicidicus дикого типа. Этот сравнительный анализ позволяет идентифицировать по меньшей мере 77 полиморфизмов или мутационных отличий между двумя геномами. Неожиданно было обнаружено только одно различие в области хромосомы, несущей кластер гена биосинтеза энрамицина. Такое различие заключалось в замене одного нуклеотида в гене endC. Мутация нуклеотида C на T 6,260,317 в гене endC приводила к замене кодона CTC на кодон CTT, при условии, что молчащая мутация находится в кодонах для лейцина. Поэтому, маловероятно, что эта мутация играет значимую роль в явном увеличении выхода энрамицина, продуцируемого BM38-2. Отсутствие других мутаций в кластере гена энрамицина указывает на то, что хромосомные замены, ответственные за увеличение выхода энрамицина, продуцируемого BM38-2, могут сохраняться в плейотропных (не специфичных к определенному пути) регуляторных элементах или в общих регуляторных генах, расположенных в любом участке генома.
Было обнаружено, что несколько регуляторов ответа в актиномицетах влияют на биосинтез природного продукта более чем по одному пути. Ключевым примером является локус absA1A2, присутствующий в кластере гена CDA S. coelicolor, который кодирует двухкомпонентную систему передачи сигнала, аналогичную системе, присутствующей в кластере гена биосинтеза энрамицина на S. fungicidicus. Было показано, что фосфорилированная форма AbsA2 ингибирует продуцирование антибиотика благодаря непосредственному нарушению экспрессии путь-специфических регуляторов кластеров гена биосинтеза CDA, актинородина и ундецилпродигиозина. Мутации, которые ингибируют киназную активность AbsA2, повышают уровни продуцирования антибиотика. Другой пример плейотропной регуляции наблюдается в S. clavuligerus, где ген ccaR, присутствующий в кластере цефамицина С, кодирует регуляторный белок, регулирующий продуцирование цефамицина С и клавулановой кислоты.
Мутации в геноме ATCC No. PTA-122342, которые могут с наибольшей вероятностью повышать выходы энрамицина, могут присутствовать в генах, которые, как было предсказано с помощью биоинформационного анализа, кодируют регуляторные продукты, включая продукты, которые могут обладать плейотропными регуляторными свойствами. Ниже представлены примеры предполагаемых регуляторных генов, идентифицированных в геноме S. fungicidicus BM38-2, который имеет мутационные различия по сравнению со штаммом S. fungicidicus дикого типа [Мутационные различия в каждом из нижеследующих примеров показаны отсутствием звездочки, а отличающиеся/пропущенные/встроенные нуклеотиды показаны жирным шрифтом].
Сравнение последовательностей
orf682: Было предсказано, что этот ген кодирует регуляторный белок в семействе TetR, содержащем домен, связывающийся с ДНК, имеющей спираль-виток-спираль (HTH). Дополнительный G встроен в гомополимерную цепь, индуцирующую сдвиг рамки считывания.
Figure 00000001
>WT_682 транслированный генный продукт
VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGAEDGDGGASVRQTPVEALRQGTTGA GGLSLVERRKAALRFEIACAAVHLFTSQGVAATTGEQIAQSVGISSRTLWRHFPTKESCVLPLL TAALDFAVDRLRHWPAETSLLDFFAETCRKGDLPAATPEILDLIRMTSTEPALRAVWLQAHD DALPVLGGLLARRSGADAGDLRVTVHAATLNGALRAAVEDFARRYADRPDAADAELARCL DAALRAASEGLPY [SEQ ID NO: 26]
>BM38.2_682 транслированный генный продукт
VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGGRGRGRWSERAPDAG [SEQ ID NO: 12]
orf2798: Было предсказано, что этот ген кодирует ДНК-связывающийся регулятор транскрипции в семействе MurR/RpiR. Этот ген содержит домены спираль-виток-спираль (HTH) и сахар-изомеразы (SIS). Мутация G на A приводит к замене Gly на Ser.
Figure 00000002
Figure 00000003
>WT_2798 транслированный генный продукт
MGGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVT RFAVALGFDGYPALRRHLR
EVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLG LRAAAAQAHGFAYFAAKVH
PDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTV ADSPFAPVAGLSDLLLPAAV
GTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 16]
>BM38.2_2798 транслированный генный продукт
MSGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVT RFAVALGFDGYPALRRHLREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQ AGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQAHGFAYFAAKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGAS ALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTVADSPFAPVAGLSDLLLPAAVGTGLAFDTACAP MLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 2]
orf3866: Было предсказано, что этот ген кодирует ДНК-связывающийся регулятор ответа в семействе OmpR. Этот ген содержит домен REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах, и домен «крыло-спираль» (wHTH), характерный для регуляторных белков-антибиотиков Streptomyces (SARP). Мутация G на A приводит к замене Ala на Thr.
Figure 00000004
Figure 00000005
>WT_3866 транслированный генный продукт
LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPD GLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGAD DYVAKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQP VALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETV RGFGYKLKA [SEQ ID NO: 18]
>BM38.2_3866 транслированный генный продукт
LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPD GLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGAD DYVTKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQP VALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETV RGFGYKLKA
[SEQ ID NO: 4]
orf4755: Было предсказано, что этот ген кодирует фактор РНК-полимеразы сигма-70 семейства сигма-E. Мутация T на G в кодоне Arg (CGT (CGG) представляет собой молчащую мутацию.
Figure 00000006
Figure 00000007
>WT_4755 транслированный генный продукт
LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDR RGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQ LPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWRE GGRVG [SEQ ID NO: 24]
>BM38.2_4755 транслированный генный продукт
LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDR RGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQ LPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWRE GGRVG [SEQ ID NO: 10]
orf4868: Было предсказано, что этот ген кодирует белок регуляции транскрипции. Этот ген содержит домен приема сигнала REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах. Делеция (удаление C) в последовательности тандемных повторов приводит к мутации со сдвигом рамки считывания.
Figure 00000008
>WT_4868 транслированный генный продукт
MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHR ATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTK PFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPIHVHGDLKVDTAARRVFLGEDEVAL [SEQ ID NO: 28]
>BM38.2_4868 транслированный генный продукт
MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHR ATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTK PFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPSMSTATSRWTPPPAASS WARTKWR [SEQ ID NO: 14]
orf5175: Было предсказано, что этот ген кодирует белок регуляции транскрипции гистидин-киназы. Этот ген содержит домен приема сигнала REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах. Мутация C на T приводит к замене Pro на Ser.
Figure 00000009
>WT_5175 транслированный генный продукт
MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQM PGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGPHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVF VELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLND ESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 20]
>BM38.2_5175 транслированный генный продукт
MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQM PGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGSHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVF VELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLND ESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 6]
orf5387: Было предсказано, что этот ген кодирует регулятор транскрипции в семействе MerR. Этот ген содержит ДНК-связывающийся домен HTH и домен REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентной системе. Мутация A на C приводит к замене Tyr на Ser.
Figure 00000010
Figure 00000011
>WT_5387 транслированный генный продукт
MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAER LREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELA LAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNYMTTIIAKLDARNRLDAIR IARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 22]
>BM38.2_5387 транслированный генный продукт
MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAER LREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELA LAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNSMTTIIAKLDARNRLDAIRI ARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 8]
Очевидно, что все размеры оснований или аминокислот и все величины молекулярного веса или молекулярной массы приводятся здесь для описания нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению и имеют приближенные значения для стандартных вариантов измерения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Intervet International B.V.
Intervet Inc.
Zabriskie, T. Mark
<120> Модифицированные изоляты Streptomyces Fungicidicus и их применение
<130> 24130
<150> 62/430,455
<151> 2016-12-06
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 843
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 1
atgagcggca ccgggagccc tgcggcgcgc ctgcaggcgc tcttcgaggg gcatcggctg 60
acgccgaccc agcggcgcat cgcgcacagc atggtccggc gcgccgccga cgtgccgttc 120
ctgtccagcg tggagctggc cgagctggcc ggggtcagcc agccgtcggt gacccggttc 180
gccgtcgccc tcggcttcga cggctatccg gcgctgcgcc ggcacctgcg cgaggtcgcg 240
cccgccgaac cggcgccgga gaccggctcc tccaacgagt accagcaggc cgtcgaggcc 300
gagatcgaga acctgcggca tctggcggag gtgctggccg acccccggcc ggtgcggcag 360
gccgggcgca tgctggcggg gagccggccg ctgcccgtgc tgggactgcg ggcggcggcg 420
gcccaggcgc acggcttcgc gtacttcgcc gccaaggtcc atcccgacgt acggctgctc 480
aacgagggcg gcaccatgct ccacgaccgg atcgacgccg ccgcgcgggc cggggcgagc 540
gccctgctgt gcttcgcgct gccccgccat ccccgggagg tcgtcgacgc cctcatccac 600
gccaaggaga cggggctgac cgtggtcacc gtcgccgact cgccgttcgc gccggtcgcc 660
gggctgtccg acctgctgct gcccgcggcc gtcgggaccg gcctcgcctt cgacacggcg 720
tgcgcgccga tgctgctggg ccgggtgctg ctggaggcga tgtgcgacga cctgcccgac 780
gcgcaggcac ggctggagga gttcgacgtg agggcggcgg cgcgcggact gttcgtggac 840
tga 843
<210> 2
<211> 280
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 2
Met Ser Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ala Arg Leu Gln Ala Leu Phe Glu
1 5 10 15
Gly His Arg Leu Thr Pro Thr Gln Arg Arg Ile Ala His Ser Met Val
20 25 30
Arg Arg Ala Ala Asp Val Pro Phe Leu Ser Ser Val Glu Leu Ala Glu
35 40 45
Leu Ala Gly Val Ser Gln Pro Ser Val Thr Arg Phe Ala Val Ala Leu
50 55 60
Gly Phe Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Arg Arg His Leu Arg Glu Val Ala
65 70 75 80
Pro Ala Glu Pro Ala Pro Glu Thr Gly Ser Ser Asn Glu Tyr Gln Gln
85 90 95
Ala Val Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Arg His Leu Ala Glu Val Leu
100 105 110
Ala Asp Pro Arg Pro Val Arg Gln Ala Gly Arg Met Leu Ala Gly Ser
115 120 125
Arg Pro Leu Pro Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ala His
130 135 140
Gly Phe Ala Tyr Phe Ala Ala Lys Val His Pro Asp Val Arg Leu Leu
145 150 155 160
Asn Glu Gly Gly Thr Met Leu His Asp Arg Ile Asp Ala Ala Ala Arg
165 170 175
Ala Gly Ala Ser Ala Leu Leu Cys Phe Ala Leu Pro Arg His Pro Arg
180 185 190
Glu Val Val Asp Ala Leu Ile His Ala Lys Glu Thr Gly Leu Thr Val
195 200 205
Val Thr Val Ala Asp Ser Pro Phe Ala Pro Val Ala Gly Leu Ser Asp
210 215 220
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Val Gly Thr Gly Leu Ala Phe Asp Thr Ala
225 230 235 240
Cys Ala Pro Met Leu Leu Gly Arg Val Leu Leu Glu Ala Met Cys Asp
245 250 255
Asp Leu Pro Asp Ala Gln Ala Arg Leu Glu Glu Phe Asp Val Arg Ala
260 265 270
Ala Ala Arg Gly Leu Phe Val Asp
275 280
<210> 3
<211> 759
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 3
ttgccggccc gccaggcgca ggcgcgcacc gaccgagagc acacgaggac tgagagcacc 60
gggatggcag accagaccca cgtcctgttc gtcgaggacg acgacgtcat ccgcgaggcc 120
acccagctgg ccctggagcg ggacggcttc gcggtcaccg cgaagcccga cgggctgtcg 180
ggcctggagg cgttccacac cgaccgtccc gacatcgcgc tgctggacgt catggtcccc 240
ggtctggacg gggtgagcct gtgccggcgc atacgggacg agtcgatggt gccggtgatc 300
atgctgtcgg cgcgggccga cgccatcgac gtggtgctgg gcctggaggc gggcgccgac 360
gactatgtga ccaagccgtt cgacggcgcc gtgctggtgg cccggatccg cgcggtgctg 420
cgccgcttcg ggcgggcgaa cggcggccgg gaggaaccgg cggcggacgc cgggggtgtg 480
ctggcgttcg gcgaactgga gatcgacacc gggggcatgg aggtgcgccg ggcggggcag 540
ccggtggcgc tgacgccgac cgagatgcgg ctgctgctgg agttctcggc ggcgccgggc 600
acggtgctct cccgcgacaa gctgctcgaa cgggtgtggg agtacggctg gggcggtgac 660
acccgggtcg tcgacgtcca tgtgcagcgg ctgcgcacga agatcggcca ggaccgcatc 720
gagacggtcc gcggtttcgg ttacaagctg aaggcctga 759
<210> 4
<211> 252
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 4
Leu Pro Ala Arg Gln Ala Gln Ala Arg Thr Asp Arg Glu His Thr Arg
1 5 10 15
Thr Glu Ser Thr Gly Met Ala Asp Gln Thr His Val Leu Phe Val Glu
20 25 30
Asp Asp Asp Val Ile Arg Glu Ala Thr Gln Leu Ala Leu Glu Arg Asp
35 40 45
Gly Phe Ala Val Thr Ala Lys Pro Asp Gly Leu Ser Gly Leu Glu Ala
50 55 60
Phe His Thr Asp Arg Pro Asp Ile Ala Leu Leu Asp Val Met Val Pro
65 70 75 80
Gly Leu Asp Gly Val Ser Leu Cys Arg Arg Ile Arg Asp Glu Ser Met
85 90 95
Val Pro Val Ile Met Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ala Ile Asp Val Val
100 105 110
Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ala Asp Asp Tyr Val Thr Lys Pro Phe Asp
115 120 125
Gly Ala Val Leu Val Ala Arg Ile Arg Ala Val Leu Arg Arg Phe Gly
130 135 140
Arg Ala Asn Gly Gly Arg Glu Glu Pro Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val
145 150 155 160
Leu Ala Phe Gly Glu Leu Glu Ile Asp Thr Gly Gly Met Glu Val Arg
165 170 175
Arg Ala Gly Gln Pro Val Ala Leu Thr Pro Thr Glu Met Arg Leu Leu
180 185 190
Leu Glu Phe Ser Ala Ala Pro Gly Thr Val Leu Ser Arg Asp Lys Leu
195 200 205
Leu Glu Arg Val Trp Glu Tyr Gly Trp Gly Gly Asp Thr Arg Val Val
210 215 220
Asp Val His Val Gln Arg Leu Arg Thr Lys Ile Gly Gln Asp Arg Ile
225 230 235 240
Glu Thr Val Arg Gly Phe Gly Tyr Lys Leu Lys Ala
245 250
<210> 5
<211> 678
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 5
atggtgcaga aggccaagat cctcctggtc gatgaccggc cggagaatct gctcgcgctg 60
gaggcgatcc tctcggcgct cgatcagacg ctggtgcggg catcgtccgg ggaggaagcg 120
ctcaaagcgc tgctgacgga cgacttcgcg gtcattctgc tggacgtcca gatgccgggc 180
atggacggtt tcgagaccgc ggcccacatc aagcggcggg aacgcacccg ggacatcccg 240
atcatcttcc tcaccgcgat caaccacggt tcgcaccaca cgttccgggg ctacgcggcg 300
ggtgcggtcg actacatctc gaagccgttc gacccgtggg tgctgcgcgc gaaggtctcg 360
gtcttcgtcg agctgtacat gaagaactgc cagctgcggg agcaggcggc gctgctgcgg 420
ctccagttgg acggcggcga gaaggacgat gccgaggcag gcgactcggc ggggctgctc 480
gccgagctgt cggcgcggct cgcggccgtc gaggagcagg ccgaggcgct gaccaagcag 540
ctcaacgacg agtcgacgga cgcggccgcg gtggccacgg cggctcatct ggagcgcaag 600
ctcacggggt tgcggcgggc gctggacgcc ctggagcccg ggaccggcag cgcgtcgtcg 660
gtgccgtcgc agaactga 678
<210> 6
<211> 225
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 6
Met Val Gln Lys Ala Lys Ile Leu Leu Val Asp Asp Arg Pro Glu Asn
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Glu Ala Ile Leu Ser Ala Leu Asp Gln Thr Leu Val
20 25 30
Arg Ala Ser Ser Gly Glu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu Thr Asp Asp
35 40 45
Phe Ala Val Ile Leu Leu Asp Val Gln Met Pro Gly Met Asp Gly Phe
50 55 60
Glu Thr Ala Ala His Ile Lys Arg Arg Glu Arg Thr Arg Asp Ile Pro
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Thr Ala Ile Asn His Gly Ser His His Thr Phe Arg
85 90 95
Gly Tyr Ala Ala Gly Ala Val Asp Tyr Ile Ser Lys Pro Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Val Leu Arg Ala Lys Val Ser Val Phe Val Glu Leu Tyr Met Lys
115 120 125
Asn Cys Gln Leu Arg Glu Gln Ala Ala Leu Leu Arg Leu Gln Leu Asp
130 135 140
Gly Gly Glu Lys Asp Asp Ala Glu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ala Glu Leu Ser Ala Arg Leu Ala Ala Val Glu Glu Gln Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Thr Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ser Thr Asp Ala Ala Ala Val Ala
180 185 190
Thr Ala Ala His Leu Glu Arg Lys Leu Thr Gly Leu Arg Arg Ala Leu
195 200 205
Asp Ala Leu Glu Pro Gly Thr Gly Ser Ala Ser Ser Val Pro Ser Gln
210 215 220
Asn
225
<210> 7
<211> 582
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 7
atggtgcggg aagcgctggc cgcactgctc gaactcgagg acgacatccg ggtggtggca 60
gaagtcggct ccggtgagga cgtactcgac gcggccaggg gaacacgtcc cgacctcgtg 120
atcgtggacg tcaacatgcc gggactcgac gggctcaccg cggccgagcg gctgcgcgag 180
cagctgcccg actcccgcat cctggtgctg accgtcctgg acgcgcccaa cgtcctgcgc 240
cgggcgcagg acgtccgggt cgacggctac ctcgtcaaga acgctccggt ggagcacctc 300
gtcaaggccg tgcgccagat catggccggg gaacgcgtca tctcaccgga gctggcgctg 360
gccgcctggg agggcaaggc cagcccgctc accgcgcggg aggccgatgt gctccggatc 420
gcggcggccg gcgcggagac cgccgagatc gccgagtacc tgcatctttc accgggcacg 480
gtgcggaact ccatgaccac catcatcgcc aagctcgacg cgcgcaaccg gctcgacgcc 540
atccgcatcg cacgcgacgc cgggtggctc ctcaactcct ga 582
<210> 8
<211> 193
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 8
Met Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asp Asp Ile
1 5 10 15
Arg Val Val Ala Glu Val Gly Ser Gly Glu Asp Val Leu Asp Ala Ala
20 25 30
Arg Gly Thr Arg Pro Asp Leu Val Ile Val Asp Val Asn Met Pro Gly
35 40 45
Leu Asp Gly Leu Thr Ala Ala Glu Arg Leu Arg Glu Gln Leu Pro Asp
50 55 60
Ser Arg Ile Leu Val Leu Thr Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Leu Arg
65 70 75 80
Arg Ala Gln Asp Val Arg Val Asp Gly Tyr Leu Val Lys Asn Ala Pro
85 90 95
Val Glu His Leu Val Lys Ala Val Arg Gln Ile Met Ala Gly Glu Arg
100 105 110
Val Ile Ser Pro Glu Leu Ala Leu Ala Ala Trp Glu Gly Lys Ala Ser
115 120 125
Pro Leu Thr Ala Arg Glu Ala Asp Val Leu Arg Ile Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ala Glu Thr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu His Leu Ser Pro Gly Thr
145 150 155 160
Val Arg Asn Ser Met Thr Thr Ile Ile Ala Lys Leu Asp Ala Arg Asn
165 170 175
Arg Leu Asp Ala Ile Arg Ile Ala Arg Asp Ala Gly Trp Leu Leu Asn
180 185 190
Ser
<210> 9
<211> 549
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 9
ttgcacggga agaccgagac accggtggag ggcatgaccg aggaagagtt cgacgctttc 60
tacgcggccg cgttcccccg cctgaccgga cagttgtacg tcttcaccgg tgacctcggc 120
gaggcccagg acgtcgtcca ggaggcgttc gtacgggcct gggaccggcg cgggaggctg 180
atcgccgacg aggcgcccga ggcgtgggtg cgcaccgtcg ccatgcggct cgcggtgagc 240
cgctggcgcc gcgcgaaacg ctggctggaa ctcgtacggc actccccgcc cccggagacg 300
acccccggcc cgggccccga ccgcaccgcc ctggtcgccg cgctgcgcca actgcccgag 360
caccagcgca tggccgtcgt cctccatcac ctgtgcgacc tcagcgtcga acaggtagcc 420
tccgagaccg gcgcacccgt gggcacggtc aaggccaggc tctcccgcgg acgggcggca 480
ctggccagac atctggcggt ggacgaggcc gacgagtcgg cctggaggga gggcggccgg 540
gtcggatga 549
<210> 10
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 10
Leu His Gly Lys Thr Glu Thr Pro Val Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu
1 5 10 15
Phe Asp Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Phe Pro Arg Leu Thr Gly Gln Leu
20 25 30
Tyr Val Phe Thr Gly Asp Leu Gly Glu Ala Gln Asp Val Val Gln Glu
35 40 45
Ala Phe Val Arg Ala Trp Asp Arg Arg Gly Arg Leu Ile Ala Asp Glu
50 55 60
Ala Pro Glu Ala Trp Val Arg Thr Val Ala Met Arg Leu Ala Val Ser
65 70 75 80
Arg Trp Arg Arg Ala Lys Arg Trp Leu Glu Leu Val Arg His Ser Pro
85 90 95
Pro Pro Glu Thr Thr Pro Gly Pro Gly Pro Asp Arg Thr Ala Leu Val
100 105 110
Ala Ala Leu Arg Gln Leu Pro Glu His Gln Arg Met Ala Val Val Leu
115 120 125
His His Leu Cys Asp Leu Ser Val Glu Gln Val Ala Ser Glu Thr Gly
130 135 140
Ala Pro Val Gly Thr Val Lys Ala Arg Leu Ser Arg Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
Leu Ala Arg His Leu Ala Val Asp Glu Ala Asp Glu Ser Ala Trp Arg
165 170 175
Glu Gly Gly Arg Val Gly
180
<210> 11
<211> 769
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 11
gtggtgtcac tgactgacaa gatgtcggcg aacgccattt cggatgtgtg gacggcgggc 60
ggacggcggc ccctcgttat gctgcggggg gggggcagag gacggggacg gtggagcgag 120
cgtgcgccag acgccggttg aggcactgcg gcaggggacg acgggggccg ggggcctgtc 180
cctcgtcgag cgccgcaagg cggcactgcg cttcgagatc gcctgcgcgg cggtgcactt 240
gttcacctcg cagggggtcg ccgccacgac gggcgaacag atcgcgcagt ccgtggggat 300
ctcctcccgc accctgtggc gccatttccc cacgaaggag agctgcgtcc ttcccctgct 360
gacggcggcg ctcgacttcg ccgtggaccg cctgcgtcac tggccggcgg agacgagcct 420
gctggacttc ttcgccgaga cctgccgcaa gggtgacctg cccgccgcca ccccggagat 480
cctcgacctg atccgcatga cctccaccga accggccctg cgcgccgtgt ggctccaggc 540
ccacgacgac gcgcttcccg tcctcggcgg gcttctcgcg cggcgctccg gcgccgatgc 600
cggcgacctg agggtgacgg tgcacgcggc gacgctgaac ggcgccctgc gggcggcggt 660
ggaggacttc gcccggcggt acgcggaccg gccggacgcc gcggacgccg aactcgcccg 720
ctgtctcgac gccgccctgc gcgcggcctc ggagggactc ccctactga 769
<210> 12
<211> 46
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 12
Val Val Ser Leu Thr Asp Lys Met Ser Ala Asn Ala Ile Ser Asp Val
1 5 10 15
Trp Thr Ala Gly Gly Arg Arg Pro Leu Val Met Leu Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Arg Gly Arg Gly Arg Trp Ser Glu Arg Ala Pro Asp Ala Gly
35 40 45
<210> 13
<211> 504
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 13
atgcgcccgc ccgtcaccca ccaccaccct gccggaggcg ctgcgcgccg cccctatcga 60
ctcttgatcg tggaggacga gaaacgcctc gctctctccc tcgccaaggg actcaccgcc 120
gagggctacg ccgtggacgt cgtccacgac ggccgggagg gcctgcaccg ggccacggag 180
gggacgtacg acctcctcat cctggacatc atgctgcccg gtctcaacgg ctaccgggtc 240
tgcgccgcgc tccgcgccgc cggacacgac gtgccgatcc tgatgctcac ggccaaggac 300
ggcgagtacg acgaggcgga gggcctggac accggcgccg acgactacct caccaagccg 360
ttctcgtacg tcgtcctcgt cgccaggatc aaggcgctgc tgcgccgccg gccggccggg 420
gcctccccat ccatgtccac ggcgacctca aggtggacac cgccgcccgc cgcgtcttcc 480
tgggcgagga cgaagtggcg ctga 504
<210> 14
<211> 167
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 14
Met Arg Pro Pro Val Thr His His His Pro Ala Gly Gly Ala Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Val Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala Leu
20 25 30
Ser Leu Ala Lys Gly Leu Thr Ala Glu Gly Tyr Ala Val Asp Val Val
35 40 45
His Asp Gly Arg Glu Gly Leu His Arg Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Asp
50 55 60
Leu Leu Ile Leu Asp Ile Met Leu Pro Gly Leu Asn Gly Tyr Arg Val
65 70 75 80
Cys Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly His Asp Val Pro Ile Leu Met Leu
85 90 95
Thr Ala Lys Asp Gly Glu Tyr Asp Glu Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gly
100 105 110
Ala Asp Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Phe Ser Tyr Val Val Leu Val Ala
115 120 125
Arg Ile Lys Ala Leu Leu Arg Arg Arg Pro Ala Gly Ala Ser Pro Ser
130 135 140
Met Ser Thr Ala Thr Ser Arg Trp Thr Pro Pro Pro Ala Ala Ser Ser
145 150 155 160
Trp Ala Arg Thr Lys Trp Arg
165
<210> 15
<211> 843
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 15
atgggcggca ccgggagccc tgcggcgcgc ctgcaggcgc tcttcgaggg gcatcggctg 60
acgccgaccc agcggcgcat cgcgcacagc atggtccggc gcgccgccga cgtgccgttc 120
ctgtccagcg tggagctggc cgagctggcc ggggtcagcc agccgtcggt gacccggttc 180
gccgtcgccc tcggcttcga cggctatccg gcgctgcgcc ggcacctgcg cgaggtcgcg 240
cccgccgaac cggcgccgga gaccggctcc tccaacgagt accagcaggc cgtcgaggcc 300
gagatcgaga acctgcggca tctggcggag gtgctggccg acccccggcc ggtgcggcag 360
gccgggcgca tgctggcggg gagccggccg ctgcccgtgc tgggactgcg ggcggcggcg 420
gcccaggcgc acggcttcgc gtacttcgcc gccaaggtcc atcccgacgt acggctgctc 480
aacgagggcg gcaccatgct ccacgaccgg atcgacgccg ccgcgcgggc cggggcgagc 540
gccctgctgt gcttcgcgct gccccgccat ccccgggagg tcgtcgacgc cctcatccac 600
gccaaggaga cggggctgac cgtggtcacc gtcgccgact cgccgttcgc gccggtcgcc 660
gggctgtccg acctgctgct gcccgcggcc gtcgggaccg gcctcgcctt cgacacggcg 720
tgcgcgccga tgctgctggg ccgggtgctg ctggaggcga tgtgcgacga cctgcccgac 780
gcgcaggcac ggctggagga gttcgacgtg agggcggcgg cgcgcggact gttcgtggac 840
tga 843
<210> 16
<211> 280
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 16
Met Gly Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ala Arg Leu Gln Ala Leu Phe Glu
1 5 10 15
Gly His Arg Leu Thr Pro Thr Gln Arg Arg Ile Ala His Ser Met Val
20 25 30
Arg Arg Ala Ala Asp Val Pro Phe Leu Ser Ser Val Glu Leu Ala Glu
35 40 45
Leu Ala Gly Val Ser Gln Pro Ser Val Thr Arg Phe Ala Val Ala Leu
50 55 60
Gly Phe Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Arg Arg His Leu Arg Glu Val Ala
65 70 75 80
Pro Ala Glu Pro Ala Pro Glu Thr Gly Ser Ser Asn Glu Tyr Gln Gln
85 90 95
Ala Val Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Arg His Leu Ala Glu Val Leu
100 105 110
Ala Asp Pro Arg Pro Val Arg Gln Ala Gly Arg Met Leu Ala Gly Ser
115 120 125
Arg Pro Leu Pro Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ala His
130 135 140
Gly Phe Ala Tyr Phe Ala Ala Lys Val His Pro Asp Val Arg Leu Leu
145 150 155 160
Asn Glu Gly Gly Thr Met Leu His Asp Arg Ile Asp Ala Ala Ala Arg
165 170 175
Ala Gly Ala Ser Ala Leu Leu Cys Phe Ala Leu Pro Arg His Pro Arg
180 185 190
Glu Val Val Asp Ala Leu Ile His Ala Lys Glu Thr Gly Leu Thr Val
195 200 205
Val Thr Val Ala Asp Ser Pro Phe Ala Pro Val Ala Gly Leu Ser Asp
210 215 220
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Val Gly Thr Gly Leu Ala Phe Asp Thr Ala
225 230 235 240
Cys Ala Pro Met Leu Leu Gly Arg Val Leu Leu Glu Ala Met Cys Asp
245 250 255
Asp Leu Pro Asp Ala Gln Ala Arg Leu Glu Glu Phe Asp Val Arg Ala
260 265 270
Ala Ala Arg Gly Leu Phe Val Asp
275 280
<210> 17
<211> 759
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 17
ttgccggccc gccaggcgca ggcgcgcacc gaccgagagc acacgaggac tgagagcacc 60
gggatggcag accagaccca cgtcctgttc gtcgaggacg acgacgtcat ccgcgaggcc 120
acccagctgg ccctggagcg ggacggcttc gcggtcaccg cgaagcccga cgggctgtcg 180
ggcctggagg cgttccacac cgaccgtccc gacatcgcgc tgctggacgt catggtcccc 240
ggtctggacg gggtgagcct gtgccggcgc atacgggacg agtcgatggt gccggtgatc 300
atgctgtcgg cgcgggccga cgccatcgac gtggtgctgg gcctggaggc gggcgccgac 360
gactatgtgg ccaagccgtt cgacggcgcc gtgctggtgg cccggatccg cgcggtgctg 420
cgccgcttcg ggcgggcgaa cggcggccgg gaggaaccgg cggcggacgc cgggggtgtg 480
ctggcgttcg gcgaactgga gatcgacacc gggggcatgg aggtgcgccg ggcggggcag 540
ccggtggcgc tgacgccgac cgagatgcgg ctgctgctgg agttctcggc ggcgccgggc 600
acggtgctct cccgcgacaa gctgctcgaa cgggtgtggg agtacggctg gggcggtgac 660
acccgggtcg tcgacgtcca tgtgcagcgg ctgcgcacga agatcggcca ggaccgcatc 720
gagacggtcc gcggtttcgg ttacaagctg aaggcctga 759
<210> 18
<211> 252
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 18
Leu Pro Ala Arg Gln Ala Gln Ala Arg Thr Asp Arg Glu His Thr Arg
1 5 10 15
Thr Glu Ser Thr Gly Met Ala Asp Gln Thr His Val Leu Phe Val Glu
20 25 30
Asp Asp Asp Val Ile Arg Glu Ala Thr Gln Leu Ala Leu Glu Arg Asp
35 40 45
Gly Phe Ala Val Thr Ala Lys Pro Asp Gly Leu Ser Gly Leu Glu Ala
50 55 60
Phe His Thr Asp Arg Pro Asp Ile Ala Leu Leu Asp Val Met Val Pro
65 70 75 80
Gly Leu Asp Gly Val Ser Leu Cys Arg Arg Ile Arg Asp Glu Ser Met
85 90 95
Val Pro Val Ile Met Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ala Ile Asp Val Val
100 105 110
Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ala Asp Asp Tyr Val Ala Lys Pro Phe Asp
115 120 125
Gly Ala Val Leu Val Ala Arg Ile Arg Ala Val Leu Arg Arg Phe Gly
130 135 140
Arg Ala Asn Gly Gly Arg Glu Glu Pro Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val
145 150 155 160
Leu Ala Phe Gly Glu Leu Glu Ile Asp Thr Gly Gly Met Glu Val Arg
165 170 175
Arg Ala Gly Gln Pro Val Ala Leu Thr Pro Thr Glu Met Arg Leu Leu
180 185 190
Leu Glu Phe Ser Ala Ala Pro Gly Thr Val Leu Ser Arg Asp Lys Leu
195 200 205
Leu Glu Arg Val Trp Glu Tyr Gly Trp Gly Gly Asp Thr Arg Val Val
210 215 220
Asp Val His Val Gln Arg Leu Arg Thr Lys Ile Gly Gln Asp Arg Ile
225 230 235 240
Glu Thr Val Arg Gly Phe Gly Tyr Lys Leu Lys Ala
245 250
<210> 19
<211> 678
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 19
atggtgcaga aggccaagat cctcctggtc gatgaccggc cggagaatct gctcgcgctg 60
gaggcgatcc tctcggcgct cgatcagacg ctggtgcggg catcgtccgg ggaggaagcg 120
ctcaaagcgc tgctgacgga cgacttcgcg gtcattctgc tggacgtcca gatgccgggc 180
atggacggtt tcgagaccgc ggcccacatc aagcggcggg aacgcacccg ggacatcccg 240
atcatcttcc tcaccgcgat caaccacggt ccgcaccaca cgttccgggg ctacgcggcg 300
ggtgcggtcg actacatctc gaagccgttc gacccgtggg tgctgcgcgc gaaggtctcg 360
gtcttcgtcg agctgtacat gaagaactgc cagctgcggg agcaggcggc gctgctgcgg 420
ctccagttgg acggcggcga gaaggacgat gccgaggcag gcgactcggc ggggctgctc 480
gccgagctgt cggcgcggct cgcggccgtc gaggagcagg ccgaggcgct gaccaagcag 540
ctcaacgacg agtcgacgga cgcggccgcg gtggccacgg cggctcatct ggagcgcaag 600
ctcacggggt tgcggcgggc gctggacgcc ctggagcccg ggaccggcag cgcgtcgtcg 660
gtgccgtcgc agaactga 678
<210> 20
<211> 225
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 20
Met Val Gln Lys Ala Lys Ile Leu Leu Val Asp Asp Arg Pro Glu Asn
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Glu Ala Ile Leu Ser Ala Leu Asp Gln Thr Leu Val
20 25 30
Arg Ala Ser Ser Gly Glu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu Thr Asp Asp
35 40 45
Phe Ala Val Ile Leu Leu Asp Val Gln Met Pro Gly Met Asp Gly Phe
50 55 60
Glu Thr Ala Ala His Ile Lys Arg Arg Glu Arg Thr Arg Asp Ile Pro
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Thr Ala Ile Asn His Gly Pro His His Thr Phe Arg
85 90 95
Gly Tyr Ala Ala Gly Ala Val Asp Tyr Ile Ser Lys Pro Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Val Leu Arg Ala Lys Val Ser Val Phe Val Glu Leu Tyr Met Lys
115 120 125
Asn Cys Gln Leu Arg Glu Gln Ala Ala Leu Leu Arg Leu Gln Leu Asp
130 135 140
Gly Gly Glu Lys Asp Asp Ala Glu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ala Glu Leu Ser Ala Arg Leu Ala Ala Val Glu Glu Gln Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Thr Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ser Thr Asp Ala Ala Ala Val Ala
180 185 190
Thr Ala Ala His Leu Glu Arg Lys Leu Thr Gly Leu Arg Arg Ala Leu
195 200 205
Asp Ala Leu Glu Pro Gly Thr Gly Ser Ala Ser Ser Val Pro Ser Gln
210 215 220
Asn
225
<210> 21
<211> 582
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 21
atggtgcggg aagcgctggc cgcactgctc gaactcgagg acgacatccg ggtggtggca 60
gaagtcggct ccggtgagga cgtactcgac gcggccaggg gaacacgtcc cgacctcgtg 120
atcgtggacg tcaacatgcc gggactcgac gggctcaccg cggccgagcg gctgcgcgag 180
cagctgcccg actcccgcat cctggtgctg accgtcctgg acgcgcccaa cgtcctgcgc 240
cgggcgcagg acgtccgggt cgacggctac ctcgtcaaga acgctccggt ggagcacctc 300
gtcaaggccg tgcgccagat catggccggg gaacgcgtca tctcaccgga gctggcgctg 360
gccgcctggg agggcaaggc cagcccgctc accgcgcggg aggccgatgt gctccggatc 420
gcggcggccg gcgcggagac cgccgagatc gccgagtacc tgcatctttc accgggcacg 480
gtgcggaact acatgaccac catcatcgcc aagctcgacg cgcgcaaccg gctcgacgcc 540
atccgcatcg cacgcgacgc cgggtggctc ctcaactcct ga 582
<210> 22
<211> 193
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 22
Met Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asp Asp Ile
1 5 10 15
Arg Val Val Ala Glu Val Gly Ser Gly Glu Asp Val Leu Asp Ala Ala
20 25 30
Arg Gly Thr Arg Pro Asp Leu Val Ile Val Asp Val Asn Met Pro Gly
35 40 45
Leu Asp Gly Leu Thr Ala Ala Glu Arg Leu Arg Glu Gln Leu Pro Asp
50 55 60
Ser Arg Ile Leu Val Leu Thr Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Leu Arg
65 70 75 80
Arg Ala Gln Asp Val Arg Val Asp Gly Tyr Leu Val Lys Asn Ala Pro
85 90 95
Val Glu His Leu Val Lys Ala Val Arg Gln Ile Met Ala Gly Glu Arg
100 105 110
Val Ile Ser Pro Glu Leu Ala Leu Ala Ala Trp Glu Gly Lys Ala Ser
115 120 125
Pro Leu Thr Ala Arg Glu Ala Asp Val Leu Arg Ile Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ala Glu Thr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu His Leu Ser Pro Gly Thr
145 150 155 160
Val Arg Asn Tyr Met Thr Thr Ile Ile Ala Lys Leu Asp Ala Arg Asn
165 170 175
Arg Leu Asp Ala Ile Arg Ile Ala Arg Asp Ala Gly Trp Leu Leu Asn
180 185 190
Ser
<210> 23
<211> 549
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 23
ttgcacggga agaccgagac accggtggag ggcatgaccg aggaagagtt cgacgctttc 60
tacgcggccg cgttcccccg cctgaccgga cagttgtacg tcttcaccgg tgacctcggc 120
gaggcccagg acgtcgtcca ggaggcgttc gtacgggcct gggaccggcg cgggaggctg 180
atcgccgacg aggcgcccga ggcgtgggtg cgcaccgtcg ccatgcggct cgcggtgagc 240
cgctggcgcc gcgcgaaacg ctggctggaa ctcgtacggc actccccgcc cccggagacg 300
acccccggcc cgggccccga ccgcaccgcc ctggtcgccg cgctgcgcca actgcccgag 360
caccagcgca tggccgtcgt cctccatcac ctgtgcgacc tcagcgtcga acaggtagcc 420
tccgagaccg gcgcacccgt gggcacggtc aaggccaggc tctcccgcgg acgggcggca 480
ctggccagac atctggcggt ggacgaggcc gacgagtcgg cctggaggga gggcggccgt 540
gtcggatga 549
<210> 24
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 24
Leu His Gly Lys Thr Glu Thr Pro Val Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu
1 5 10 15
Phe Asp Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Phe Pro Arg Leu Thr Gly Gln Leu
20 25 30
Tyr Val Phe Thr Gly Asp Leu Gly Glu Ala Gln Asp Val Val Gln Glu
35 40 45
Ala Phe Val Arg Ala Trp Asp Arg Arg Gly Arg Leu Ile Ala Asp Glu
50 55 60
Ala Pro Glu Ala Trp Val Arg Thr Val Ala Met Arg Leu Ala Val Ser
65 70 75 80
Arg Trp Arg Arg Ala Lys Arg Trp Leu Glu Leu Val Arg His Ser Pro
85 90 95
Pro Pro Glu Thr Thr Pro Gly Pro Gly Pro Asp Arg Thr Ala Leu Val
100 105 110
Ala Ala Leu Arg Gln Leu Pro Glu His Gln Arg Met Ala Val Val Leu
115 120 125
His His Leu Cys Asp Leu Ser Val Glu Gln Val Ala Ser Glu Thr Gly
130 135 140
Ala Pro Val Gly Thr Val Lys Ala Arg Leu Ser Arg Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
Leu Ala Arg His Leu Ala Val Asp Glu Ala Asp Glu Ser Ala Trp Arg
165 170 175
Glu Gly Gly Arg Val Gly
180
<210> 25
<211> 768
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 25
gtggtgtcac tgactgacaa gatgtcggcg aacgccattt cggatgtgtg gacggcgggc 60
ggacggcggc ccctcgttat gctgcggggg ggggcagagg acggggacgg tggagcgagc 120
gtgcgccaga cgccggttga ggcactgcgg caggggacga cgggggccgg gggcctgtcc 180
ctcgtcgagc gccgcaaggc ggcactgcgc ttcgagatcg cctgcgcggc ggtgcacttg 240
ttcacctcgc agggggtcgc cgccacgacg ggcgaacaga tcgcgcagtc cgtggggatc 300
tcctcccgca ccctgtggcg ccatttcccc acgaaggaga gctgcgtcct tcccctgctg 360
acggcggcgc tcgacttcgc cgtggaccgc ctgcgtcact ggccggcgga gacgagcctg 420
ctggacttct tcgccgagac ctgccgcaag ggtgacctgc ccgccgccac cccggagatc 480
ctcgacctga tccgcatgac ctccaccgaa ccggccctgc gcgccgtgtg gctccaggcc 540
cacgacgacg cgcttcccgt cctcggcggg cttctcgcgc ggcgctccgg cgccgatgcc 600
ggcgacctga gggtgacggt gcacgcggcg acgctgaacg gcgccctgcg ggcggcggtg 660
gaggacttcg cccggcggta cgcggaccgg ccggacgccg cggacgccga actcgcccgc 720
tgtctcgacg ccgccctgcg cgcggcctcg gagggactcc cctactga 768
<210> 26
<211> 255
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 26
Val Val Ser Leu Thr Asp Lys Met Ser Ala Asn Ala Ile Ser Asp Val
1 5 10 15
Trp Thr Ala Gly Gly Arg Arg Pro Leu Val Met Leu Arg Gly Gly Ala
20 25 30
Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Ser Val Arg Gln Thr Pro Val Glu Ala
35 40 45
Leu Arg Gln Gly Thr Thr Gly Ala Gly Gly Leu Ser Leu Val Glu Arg
50 55 60
Arg Lys Ala Ala Leu Arg Phe Glu Ile Ala Cys Ala Ala Val His Leu
65 70 75 80
Phe Thr Ser Gln Gly Val Ala Ala Thr Thr Gly Glu Gln Ile Ala Gln
85 90 95
Ser Val Gly Ile Ser Ser Arg Thr Leu Trp Arg His Phe Pro Thr Lys
100 105 110
Glu Ser Cys Val Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala Leu Asp Phe Ala Val
115 120 125
Asp Arg Leu Arg His Trp Pro Ala Glu Thr Ser Leu Leu Asp Phe Phe
130 135 140
Ala Glu Thr Cys Arg Lys Gly Asp Leu Pro Ala Ala Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Leu Ile Arg Met Thr Ser Thr Glu Pro Ala Leu Arg Ala Val
165 170 175
Trp Leu Gln Ala His Asp Asp Ala Leu Pro Val Leu Gly Gly Leu Leu
180 185 190
Ala Arg Arg Ser Gly Ala Asp Ala Gly Asp Leu Arg Val Thr Val His
195 200 205
Ala Ala Thr Leu Asn Gly Ala Leu Arg Ala Ala Val Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Arg Arg Tyr Ala Asp Arg Pro Asp Ala Ala Asp Ala Glu Leu Ala Arg
225 230 235 240
Cys Leu Asp Ala Ala Leu Arg Ala Ala Ser Glu Gly Leu Pro Tyr
245 250 255
<210> 27
<211> 505
<212> ДНК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 27
atgcgcccgc ccgtcaccca ccaccaccct gccggaggcg ctgcgcgccg cccctatcga 60
ctcttgatcg tggaggacga gaaacgcctc gctctctccc tcgccaaggg actcaccgcc 120
gagggctacg ccgtggacgt cgtccacgac ggccgggagg gcctgcaccg ggccacggag 180
gggacgtacg acctcctcat cctggacatc atgctgcccg gtctcaacgg ctaccgggtc 240
tgcgccgcgc tccgcgccgc cggacacgac gtgccgatcc tgatgctcac ggccaaggac 300
ggcgagtacg acgaggcgga gggcctggac accggcgccg acgactacct caccaagccg 360
ttctcgtacg tcgtcctcgt cgccaggatc aaggcgctgc tgcgccgccg gccggccggg 420
gcctccccca tccatgtcca cggcgacctc aaggtggaca ccgccgcccg ccgcgtcttc 480
ctgggcgagg acgaagtggc gctga 505
<210> 28
<211> 168
<212> БЕЛОК
<213> streptomyces fungicidicus
<400> 28
Met Arg Pro Pro Val Thr His His His Pro Ala Gly Gly Ala Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Val Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala Leu
20 25 30
Ser Leu Ala Lys Gly Leu Thr Ala Glu Gly Tyr Ala Val Asp Val Val
35 40 45
His Asp Gly Arg Glu Gly Leu His Arg Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Asp
50 55 60
Leu Leu Ile Leu Asp Ile Met Leu Pro Gly Leu Asn Gly Tyr Arg Val
65 70 75 80
Cys Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly His Asp Val Pro Ile Leu Met Leu
85 90 95
Thr Ala Lys Asp Gly Glu Tyr Asp Glu Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gly
100 105 110
Ala Asp Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Phe Ser Tyr Val Val Leu Val Ala
115 120 125
Arg Ile Lys Ala Leu Leu Arg Arg Arg Pro Ala Gly Ala Ser Pro Ile
130 135 140
His Val His Gly Asp Leu Lys Val Asp Thr Ala Ala Arg Arg Val Phe
145 150 155 160
Leu Gly Glu Asp Glu Val Ala Leu
165
<210> 29
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 29
ggacgatgcc atcaaaaccg 20
<210> 30
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 30
actgcttgat caccgaggtg 20
<210> 31
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 31
ctgttcaacc tgaccgggaa 20
<210> 32
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 32
gaagaccacg acctcgatgg 20
<210> 33
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 33
gggcaggagt tcttgaggac 20
<210> 34
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 34
ccacgtcaag aacctggtga 20
<210> 35
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 35
ggcaagtcga ccctcatcaa 20
<210> 36
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 36
atgaccgaga acagcgtctc 20
<210> 37
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 37
cgcatctgtt ccaggcaatg 20
<210> 38
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 38
tcatcgtggc gcataggtac 20
<210> 39
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 39
tgtggggatg tccttcggaa 20
<210> 40
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 40
cgacgatgcc aagagactgt 20
<210> 41
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 41
ggacgatgcc atcaaaaccg 20
<210> 42
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 42
actgcttgat caccgaggtg 20
<210> 43
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 43
tgctgctgtc gatcatggag 20
<210> 44
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 44
aggaagggct ggtaggtcat 20
<210> 45
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 45
cgagtccgaa gcagaaggag 20
<210> 46
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 46
gggtcggcaa catcttcctc 20
<210> 47
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 47
gagcacacga ggactgagag 20
<210> 48
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 48
gtaccccctc atagcgcttc 20
<210> 49
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 49
agaagtacgg gattcgggga 20
<210> 50
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 50
actgcttgat caccgaggtg 2
<---

Claims (4)

1. Штамм Streptomyces fungicidicus для продуцирования эндурацидина, который имеет депозитарный номер ATCC PTA-122342.
2. Способ получения эндурацидина, включающий
культивирование штамма Streptomyces fungicidicus по п. 1, в культуральной среде в условиях, достаточных для получения эндурацидина, и
выделение эндурацидина из культуральной среды.
RU2019117260A 2016-12-06 2017-09-20 Модифицированные изоляты streptomyces fungicidicus и их применение RU2773311C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662430455P 2016-12-06 2016-12-06
US62/430,455 2016-12-06
PCT/EP2017/073771 WO2018103905A1 (en) 2016-12-06 2017-09-20 Modified streptomyces fungicidicus isolates and their use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019117260A RU2019117260A (ru) 2021-01-11
RU2019117260A3 RU2019117260A3 (ru) 2021-01-29
RU2773311C2 true RU2773311C2 (ru) 2022-06-01

Family

ID=

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4465771A (en) * 1980-10-31 1984-08-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of enduracidin and microorganisms therefor
WO2008054945A2 (en) * 2006-09-29 2008-05-08 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Enduracidin biosynthetic gene cluster from streptomyces fungicidicus
CN103374537B (zh) * 2012-04-25 2015-01-07 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4465771A (en) * 1980-10-31 1984-08-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of enduracidin and microorganisms therefor
WO2008054945A2 (en) * 2006-09-29 2008-05-08 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Enduracidin biosynthetic gene cluster from streptomyces fungicidicus
CN103374537B (zh) * 2012-04-25 2015-01-07 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Орлова Т.И. и др. Биологически активные нерибосомальные пептиды.I. нерибосомальные антибиотики полипептиды. Антибиотики и химиотерапия, 2011, Т. 56, N 3-4, С. 57-68. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070122885A1 (en) Methods of increasing production of secondary metabolites by manipulating metabolic pathways that include methylmalonyl-coa
JP2023012549A (ja) 改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株およびその使用
US11858967B2 (en) Compositions and methods for enhanced production of enduracidin in a genetically engineered strain of streptomyces fungicidicus
EP2451955B1 (en) Process for preparation of tacrolimus
CN106754608B (zh) 生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用
US6689611B1 (en) Modified Streptomyces host cells for increased avermectin production and methods of making the same
CN101153274B (zh) 提高利福霉素产量的方法
RU2773311C2 (ru) Модифицированные изоляты streptomyces fungicidicus и их применение
KR20090088630A (ko) 프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소유전자, 단백질, 재조합 벡터 및 형질전환체, 및 이를사용하여 기능성 유기산을 제조하는 방법
EP1831249B1 (en) Novel genes involved in gluconeogenesis
CN114891678B (zh) 多粘芽孢杆菌cpl258及其筛选和应用
WO2002066651A2 (en) Nucleotide sequences of the ribosomal protein s12 gene (rpsl) from corynebacterium glutamicum
JP3884651B2 (ja) Ｂ２アベルメクチン：ｂ１アベルメクチンの比を指示するストレプトミセス・アベルミティリス遺伝子
KR20220031043A (ko) 스트렙토미세스 클라불리게루스
US6692946B2 (en) Polynucleotides encoding the nadA gene and methods of producing nicotinic acid or nicotinic acid derivatives
Danchin et al. The adenylate cyclase catalytic domain of Streptomyces coelicolor is carboxy-terminal
US6689587B2 (en) Polynucleotides encoding the nadC gene and methods of producing nicotinic acid or nicotinic acid derivatives
WO2011043666A1 (en) Antibiotic compositions, methods for providing the same and streptomyces coelicolor mutants for use in such methods
KR101592269B1 (ko) 전사조절 시그마 인자 ＳｉｇＡ-ｖｍ 및 이 인자의 과발현에 의한 글라이코펩타이드 계열 화합물의 생산성 증대 방법
CN102392028A (zh) 指导b2:b1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因
CN113755517A (zh) 一种slcg_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用
Bendera et al. Characterization of the genes controlling the phytotoxin coronatine including conjugation coronamic acid
WO2002038598A1 (en) Nucleotide sequences which code for the nada gene