KR20090088630A - 프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소유전자, 단백질, 재조합 벡터 및 형질전환체, 및 이를사용하여 기능성 유기산을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 닭맹장에서 분리한 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) CC3-1에서 분리된 아미노산 탈아미노화 효소(amino acid deaminase, AAD)를 코딩하는 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 단백질을 기질인 아미노산과 생물전환반응시킴으로써 기능성 유기산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 제조된 기능성 유기산은 제약, 식품, 사료 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소 유전자, 단백질, 재조합 벡터 및 형질전환체, 및 이를 사용하여 기능성 유기산을 제조하는 방법{AMINO ACID DEAMINASE GENE OF PROTEUS MIRABILIS, PROTEIN, RECOMBINANT VECTOR AND TRANSFORMANT, AND METHOD FOR MANUFACTURING FUNCTIONAL ORGANIC ACIDS USING THE SAME}

본 발명은 닭맹장에서 분리된 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) CC3-1 균주에서 분리된 아미노산 탈아미노화 효소(amino acid deaminase, AAD) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 단백질을 기질인 아미노산과 생물전환반응(bioconversion)시킴으로써 기능성 유기산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

NRC(1998) 발표에 따르면 오래전부터 항생제를 사용함으로써 포유자돈 16%, 이유자돈 4%의 증체율의 증가가 가능하고, 사료효율은 각각 7%, 2% 증가시킬 수 있 어 성장촉진 및 사료효율 증진을 위하여 항생제가 지속적으로 사용되고 있다.

전 세계적으로 연간 유럽에서 약 10,000톤, 미국에서 약 25,000톤 등의 항생제가 사용되며, 이중 약 50% 정도가 가축에 사용되고 있다. 국내의 경우 전체적으로 축산용 항생제의 사용량이 축산 선진국에 비해 약 2~10배 정도 높다 (한국농어촌사회연구소).

이와 같은 항생제의 남용은 세균내성을 증가시키고 있으며 국가별 테트라사이클린에 대한 대장균 내성정도는 한국(90.2%), 스페인(91.0%), 벨기에(79.7%), 프랑스(89.0%), 캐나다(81.9%), 영국(78.4%) 등으로 상당히 높은 수준으로 알려져 있다.

그러나, 항생제 사용절감은 병원성세균 질병발병율 증가, 폐사율 증가, 생산성 하락 등으로 농가소득 감소를 초래하므로 항생제를 대체하여 사용할 수 있는 항생제 대체제로서 유기산제, 면역증강제, 생균제, 필수오일 등 가축 건강증진관련 대체물질의 사용량이 크게 증가하리라 예상된다.

항생제 대체물질 중 유기산은 생체 대사산물로서 휘발성산에는 아세트산, 부티르산, 카프로산, 프로피온산, 발레르산, 이소발레르산, 이소부티르산 등이 있으며, 비휘발성산에는 락트산, 숙신산, 옥살산, 푸마르산, 말론산 등 이외 다양한 형태의 케토산, 하이드록시산, 카복시산 등이 있으며, 그 기능 또한 다양하며 기능성이 아직 알려지지 않은 경우가 대부분이다.

이러한 유기산들을 생산하는 미생물로는 유산을 생산하는 유산균이 대표적으로 알려져 있다. 유산균이 생산하는 유기산에는 여러 종류가 있으며 대사산물인 락트산, 아세트산, 부티르산 등은 항돌연변이능, 항균능력 및 장내흡수를 통한 성장촉진 등 다양한 기능을 가지고 있다. 유제품중 치즈내에 존재하는 유산균의 아미노산의 분해과정은 방향족 아미노산, 분지쇄 아미노산(branched chain amino acid) 등으로부터 아미노기전환반응(transamination), 제거반응(elimination)에 의하여 대사되어 하이드록시산, 케토산, 알콜 등 중간 산물을 거쳐 최종적으로 페놀, 스케톨, 인돌, 에스테르 등으로 분해된다(문헌[R. Van Kranenberg 등, Intl. Dairy J. vol.12, pp.111-121, 2002] 참조).

아미노산 분해과정의 중간 산물인 케토산은 만성적인 요독증을 가진 사람을 위한 식품첨가물로서 사용되며, 철이온 흡수에 관련된 사이드로포어(siderophore)(문헌[Drechsel 등, J. Bacteriol. vol. 175, pp.2727-2733, 1993] 참조), 아미노산의 D/L 라세믹 혼합물(racemic mixture)을 단일 형태로의 전환, 세팔로스포린 C의 중요한 중간 산물인 7-ACA의 전환, 기타 유제품 생산에서 풍미증진효과(문헌[Banks J. M. 등, Intl. Dairy J. 11:235-243, 2001] 및 [Yvon M., L. Rijnen, Intl. Dairy J. vol.11, pp.185-201, 2001] 참조) 등의 다양한 기능을 가지고 있어 많은 연구가 진행되고 있다.

대표적인 기능성 유기산 중 페닐락트산은 아미노산 중 페닐알라닌으로부터 유도되며 유산균에서 생산되는 대사산물 중의 하나로서 그람 양성, 음성 병원성세균 및 곰팡이 등에 항균능력을 보유하는 것으로 나타나 생물 방부제의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(문헌[Valerio F. 등, FEMS Microbiol. Letters. 233:289-295, 2004] 참조), 파마코포어(pharmacophore) 합성전구체, 항에이즈제(anti-HIV reagent), 레닌저해제(renin inhibitor), 단백질저해제(protease inhibitor) 등 다양한 기능성을 가지고 있다(문헌[Yoshihiro H. 등, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol.60, pp. 1279-1283] 참조). 인돌-3-아세트산, 인돌부틱산 등 인돌화합물은 트립톤의 전환에 의하여 생성되며 식품성장조절제(PGRs)에 속하여 1 mM보다 적은 농도로도 식물의 성장을 조절하는 물질로 알려져 있다. 이소발레르산은 분지쇄 휘발성산으로서 루이신의 전환에 의해 생성되며 스위스치즈 향의 진함과 강도와 관련되어 있다는 보고가 있다(문헌[Singh P. 등, J. Microbiol. vol. 39, pp.229-231, 2001] 참조). 이외에도 생물전환공정으로 생산가능한 많은 기능성을 보유한 유기산들이 있으며 아직 밝혀지지 않은 기능성을 포함하면 본 발명의 중요성이 앞으로도 더욱 높아지리라 예상된다.

이러한 기능성 유기산들의 제조방법에는 유산균, 초산균 등과 같은 미생물에의한 대사산물로부터 얻는 방법, 효소를 이용한 생물전환 방법, 생합성에 의한 방법 등이 있다.

그러나, 미생물의 배양을 통한 방법은 생산된 다양한 유기산으로부터 분리 정제해야 하는 어려움이 있으며 수율 또한 높지 않고, 생합성에 의한 방법은 생합성 과정 중 유해한 부산물의 발생가능성이 있으며 인체에 적용시 독성의 문제를 배제하기 어려우며, 현재 일부 기업의 독점으로 인하여 합성전구체의 확보가 어렵다.

효소를 사용한 생물전환 방법은 고역가의 효소의 확보가 가능하다면 복잡한 생산과정 없이도 순(mild)한 조건에서 직접적으로 다양한 아미노산 기질을 이용하여 다양한 기능성 유기산을 대량으로 생산할 수 있는 효율적이고 경제적인 방법이 라 할 수 있다.

효소를 사용하여 아미노산으로부터 케토산을 생산하는 방법에는 아미노기전환반응(transamination)에 의한 방법, 탈아미노화반응(deamination)에 의한 방법이 있다. 아미노기전환반응에 의한 방법은 가역반응이며 부산물인 글루타메이트가 형성되며 50% 이상의 수율을 올리기가 어려워 낮은 비용으로 생산하기 어려운 단점이 있어 대량생산이 어렵다. 반면 탈아미노화반응에 의한 방법은 부산물이 생기기 않으며 상대적으로 수율이 높아 이 방법이 가장 효율적으로 기능성 유기산을 생산할 수 있는 방법이다. 생산하고자 하는 유기산의 광학이성질체에 따라 L-형 또는 D-형에 작용하는 효소를 각각 경제성, 기능성 등을 고려하여 다양하게 선정하여 사용이 가능하며 생산된 다양한 유기산들은 제약용, 식품용, 사료용 등 광범위한 용도로 사용이 가능하다.

유산균에 의한 케토산 생산은 주로 아미노기전이(aminotransferase) 효소에 의한 아미노기전환반응(transamination)으로 생산이 되는 것으로 알려져 있으며, 치즈 가공시에 케토글루타르산 첨가를 통하여 아미노산 분해반응의 증진을 통한 글루타메이트, 감마 아미노부티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)의 생산촉진, 향기 성분의 유도촉진을 통한 풍미증진에 관한 연구가 다수 보고되고 있다(문헌[Banks J. M. 등, Intl. Dairy J. vol.11, pp.235-243, 2001], [Valerio F. 등, FEMS Microbiol. Letters. vol.233, pp.289-295, 2004], [Williams A. G. 등, Intl. Dairy J. vol.12, pp.841-852, 2002], [Yvon M. 등, Intl. Dairy J. vol.11, pp.185-201, 2001] 및 [Yvon M. 등, Intl. Dairy J. vol. 8, pp. 889-898, 1998] 참조). 이들은 유산균에 의해 발효 숙성되어 분해됨으로써 페닐락트산, 이소발레르산 등의 향과 관련 있는 성분들이 생산되는 것으로 분석되었다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantalum)과 같은 여러 종류의 유산균에 페닐알라닌을 첨가함으로써 곰팡이 균주에 항균능력을 나타내는 페닐락트산, 4-하이드록시페닐락트산 등을 발효를 통하여 생산함으로써 안전성이 있는 식품 품질과 보존에 사용할 수 있다(문헌[Valerio F. 등, 2004. FEMS Microbiol. Letters. vol.233, pp.289-295, 2004] 참조). 그러나, 유산균을 사용한 방법은 높은 수율의 페닐락트산을 생산하기 어렵다. 따라서, 높은 수율의 기능성 유기산들의 생산을 위해서는 탈아미노화 효소에 의한 생산방법이 요구된다.

탈아미노화 효소에 의한 생산방법은 아미노산의 광학이성질체, 즉 D-형 아미노산과 L-형 아미노산에 따라 생산균주가 다르다. D-형의 아미노산을 전환하는 효소인 D-아미노산 산화효소(D-amino acid oxidase; D-AAO)는 약 86 KDa의 분자량을 가진 플라보 단백질이며 현재 세팔로스포린 C의 생산을 위하여 7-아미노세파로스포란산(7-aminocepahalosporanic acid; 7-ACA)의 2단계 효소전환반응에 중요한 역할을 하는 GL-7-ACA 아실라제(acylase)와 함께 사용되고 있다. 과거에는 돼지 신장 세포의 탈아미노화 효소를 사용하였으나, 미생물원에 관심을 갖게 되었고 최근의 D-AAO에 의한 케토산 생산은 주로 효모균인 로도토룰라 속(Rhodotorula sp.), 트리고놉시스 속(Trigonopsis sp.) 등을 이용하였다. 효모 트리고놉시스 베리아빌리스 (Trigonopsis variabilis) 세포전체와 카탈라아제를 동시고정화기술을 통하여 생산되는 과산화수소를 제거하며 산소에 의한 효소의 불활성화 및 탈카복실화 반응을 방지하고 효소활성을 지속적으로 유지시키며 케토산인 페닐피루브산을 생산하였다(문헌[Fernadez-Lafuente R. 등, Enzyme Microbiol. Technol. vol. 23, pp.28-33, 1998] 참조). 트리코놉시스 베리아빌리스 균의 D-AAO 유전자를 강력한 프로모터를 가지며 생물량(biomass) 수율 또한 우수한 효모균인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 재조합하여 높은 발현을 유도하였다(문헌[Yu J. 등, J. Mol. Caltalysis B: Enzymatic 18, 2002, pp.291-297] 참조). 로도토툴라 그라실리스(Rhodotorula gracillis)를 이용하여 세틸메틸암모늄 브로마이드(cetylmethylammonium bromide; CTAB)를 사용하여 막 투과성을 높여 카탈라아제 첨가없이 케토산으로 전환하였다(문헌[Singh P. 등, J. Microbiol. vol. 39, pp.229-231, 2001] 참조). 국내에서도 효모 트리고놉시스 베리아빌리스(Trigonopsis variabilis)의 D-아미노산 산화효소 유전자를 대장균에 클로닝하고 발현시킨 예가 있다(문헌[Lee J. H. 등, 1995, Korean J. Biotechnol. Bioeng. vol.10, pp.264-270, 1995] 참조).

L-아미노산 탈아미노화 효소(L-amino acid deaminase; L-AAD)는 다이머형태(dimeric form)의 효소로서 리보플라빈아데닌디뉴클레오티드(FAD)가 비공유결합으로 단백질에 강하게 결합되어 있다. L-아미노산에 높은 기질 특이성을 나타내며 자연계에 널리 분포되어 있는 효소로서 뱀, 곤충 독 등에 있으며 곰팡이, 조류에도 존재하며 세균의 경우 로도코코스 오파구스(Rhodococcus opacus), 프로테우스 속(Proteus sp.), 프로비텐시아 속(Providencia sp.), 모르간넬라(Morganella sp.) 등 생물계에서 다양하게 분포되어 있다. 로도코코스 오파구스의 L-아미노산 산화 효소를 유전공학적 기법으로 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)에서 발현시킨 보고가 있다(문헌[Geueke B. and W. Hummel, Protein Expression Purification vol.28, pp.303-309, 2003] 참조).

이에, 본 발명자들은 페닐락트산을 비롯한 다양한 기능성 유기산들을 대량으로 생산하기 위해, 닭맹장에서 분리한 프로테우스 미라빌리스 CC3-1에서 분리된 아미노산 탈아미노화 효소가 페닐알라닌을 비롯한 다양한 아미노산을 기질로 하여 다양한 기능성 유기산을 대량으로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

[문헌 1] R. Van Kranenberg 등, Intl. Dairy J. vol.12, pp.111-121, 2002

[문헌 2] Drechsel 등, J. Bacteriol. vol.175, pp.2727-2733, 1993

[문헌 3] Banks J. M. 등, Intl. Dairy J. vol.11:235-243, 2001

[문헌 4] Yvon M., L. Rijnen, Intl. Dairy J. vol.11, pp.185-201, 2001

[문헌 5] Valerio F. 등, FEMS Microbiol. Letters. vol.233, pp.289-295, 2004

[문헌 6] Yoshihiro H. 등, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol.60, pp. 1279-1283

[문헌 7] Singh P. 등, J. Microbiol. vol. 39, pp.229-231, 2001

[문헌 8] Williams A. G. 등, Intl. Dairy J. vol.12, pp.841-852, 2002

[문헌 9] Yvon M. 등, Intl. Dairy J. vol. 8, pp. 889-898, 1998

[문헌 10] Fernadez-Lafuente R. 등, Enzyme Microbiol. Technol. vol. 23, pp.28-33, 1998

[문헌 11] Yu J. 등, J. Mol. Caltalysis B: Enzymatic 18, 2002, pp.291-297

[문헌 12] Lee J. H. 등, 1995, Korean J. Biotechnol. Bioeng. vol.10, pp.264-270, 1995

[문헌 13] Geueke B. and W. Hummel, Protein Expression Purification vol.28, pp.303-309, 2003

따라서, 본 발명의 목적은 제약용, 식품용, 사료용 등 광범위한 용도를 갖는 기능성 유기산들을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 닭맹장에서 분리 선발한 프로테우스 미라빌리스 CC3-1에서 분리된 아미노산 탈아미노화 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 단백질을 기질인 아미노산과 생물전환반응시켜 기능성 유기산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 다양한 아미노산 기질원으로부터 미리 생산 확보된 아미노산 탈아미노화 효소를 이용하여 배양, 분리, 정제 등의 복잡한 생산과정 없이 생물전환 방법을 이용하여 다양한 페닐락트산, 페닐피루브산 등과 같은 기능성을 갖는 유기산들을 대량생산할 수 있다.

본 발명의 아미노산 탈아미노화 효소는 세포막통과 단백질에 속하며 프로테우스 미라빌리스 CC3-1균에서 분리될 수 있다. 상기 아미노산 탈아미노화 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 염기서열과 동일한 아미노산 탈아미노화 효소는 현재까지 미생물로부터 분리된 적이 없다. 따라서, 본 발명은 아미노산 탈아미노화 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질, 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 상기 단백질을 기질인 아미노산과 생물전환반응시킴으로써 기능성 유기산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 아미노산 탈아미노화 효소는 프로테우스의 게놈유전자에서 특이프라이머(서열번호 2 및 3)를 사용하여 증폭하여 분리되었다.

또한, 본 발명에서는 닭맹장에서 분리된 프로테우스 미라빌리스 CC3-1의 아미노산 탈아미노화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 이때 유전자를 포함하는 벡터로는 대장균 발현 벡터가 바람직하며, 예를 들면 도 3 의 개열지도로 나타내어지는 pET-28C(+) 벡터에 탈아미노화 효소 유전자의 N-말단과 C-말단을 BamH Ⅰ과 Hind Ⅲ로 치환하여 얻어진 유전자를 pET-28C(+) 벡터의 BamH Ⅰ과 Hind Ⅲ부위에 삽입시켜 얻어진 pET-28C(+)-DA 벡터 등을 예시할 수 있다.

상기 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 균주 유래 아미노산 탈아미노화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 적절한 미생물을 형질전환시켜 미생물 형질전환체를 제조할 수 있으며, 이때 형질전환체는 대장균, 스트렙도마이세스 속 및 효모균 중 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 피키아 속(Pichia sp.), 로도토룰라 속(Rhodotorula sp.) 등의 미생물, 바람직하게는 대장균, 더 바람직하게는 대장균 BL21균주일 수 있다.

본 발명에 따른 닭맹장에서 분리된 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 균주 유래 아미노산 탈아미노화 효소는 세포막통과 단백질로서, 아미노산 탈아미노화 효소의 발현이 유도된 상기 형질전환체의 세포침전물을 세포파쇄기로 분쇄시킨 후 그대로 생물전환반응에 사용하거나, 효소 단백질을 분리 · 정제하여 생물전환공정시에 알긴산, 아가로스 등 담체를 이용하여 고정화하여 생물전환반응에 사용할 수도 있다.

본 발명에서는 또한 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 유래 아미노산 탈아미노화 효소를 기질인 아미노산들과 반응시켜 다양한 기능성 유기산들을 합성하는 방법을 제공한다. 이때, 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 유래 아미노산 탈아미노화 효소는 프로테우스 속, 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 균주로부터 직접 분리되거나 프로테우스속, 프로비텐시아 속, 모르간넬라 속 등으로부터 아미노산 탈아미노화 효소를 분리할 수 있으며, 바람직하게는 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 유래 아미노산 탈아미노화 효소 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 생산된 것일 수 있다.

기질인 페닐알라닌, 이소루이신, 루이신, 타이로신, 발린, 라이신 등의 아미노산들은 순수정제된 아미노산과 더불어 호마박, 임자박, 대두박, 유청 등 다양한 단백질성 원료를 직접사용하거나 단백질 가수분해를 통하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 반응은 32℃ 내지 37℃에서 4 내지 72 시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 기능성 유기산 중 페닐락트산은 가축질병 예방 및 치료에 사용되고 있는 기존 항생제들을 대체하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 균주가 생산하는 효소를 이용하여 제조된 페닐락트산 등 기능성 유기산들을 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따라 제조된 페닐락트산은, 유산균에서 생산되며 독성 및 부작용이 거의 없는 것으로 알려진 화합물로서, 가축이나 사람의 장내에서 세균성질병을 일으키는 살모넬라 티피머리움, 살모넬라 갈리나리윰, 살모넬라 엔테리티디스, 장독성대장균, 포도상구균 등 병원성세균들을 억제할 뿐만 아니라 식품부패를 일으키는 곰팡이들을 억제하여 생물방부제의 효과를 나타내므로 본 발명에 따라 생산된 기능성 항균유기산들을 유효성분으로 함유하는 조성물은 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명으로부터 생산된 기능성 유기산들은 약학 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 100 중량%로 포함된다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있는데, 이러한 예로 락토스, 덱스트로스, 솔비톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파리핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일 등과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마이크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 0.01 내지 600 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg 체중의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 이는 투여경로, 질병의 중증정도, 환자의 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있는 것으로 상기 투여량이 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 식품 첨가제는 병원성세균 억제를 통한 설사, 복통 등 소화기 질병예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가되는 건강기능식품 또는 건강보조식품으로 제공될 수 있는데, 이러한 경우 상기 식품 첨가제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 혼합하여 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용목적, 즉 예방, 건강증진 또는 치료적 처치에 따라 적절하게 결정될 수 있으며, 상기의 사료 첨가제와 동일하게, 페닐락트산외 기능성 유기산들을 0.1 내지 4 g/kg, 바람직하게는 2 내지 3 g/kg로 첨가할 수 있다. 또한, 두류, 곡물 등의 분말 그 자체 또는 건조물을 이용할 수도 있다.

본 발명의 식품 첨가제가 적용될 수 있는 식품의 종류에 특별한 제한은 없으며, 육류, 소세지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 예로 들 수 있고, 통상적인 의미에서의 식품방부제, 기능성식품 및 건강보조식품 등을 모두 포함한다. 본 발명에 따른 식품 첨가물의 양은 일반적으로 식품의 경우에는 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있고, 음료의 경우에는 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 첨가제는 유효성분으로서 아미노산 탈아미노화 효소로부터 생물전환에 의해 생산된 페닐락트산, 페닐피루브산, 페닐아세트산 등 기능성 유기산들을 지시된 비율로 함유하는 것 이외에는 여러 가지 영양제, 탄수화물, 비타민, 미네랄(전해질), 풍미제, 착색제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 필요에 따라 선택적으로 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 두 가지 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 이러한 성분들의 비율은 그렇게 중요하지 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 아미노산 탈아미노화 효소 생산 균주 분리 및 선발

(1) 균주 분리 및 선발

돼지와 닭의 내장 및 분변 시료 각각 1 g을 0.85% 염화나트륨용액 9㎖에 혼합하고 1 ㎖씩을 연속적으로 동일한 염화나트륨 용액에 십진희석하여 2% 박토펩 톤, 2% DL-페닐알라닌, 0.02% 제2철 암모늄 시트레이트, 0.5% 염화나트륨, 2% 아가가 함유된 수정된 티-모드 배지(문헌[Consiglio Nazione delle Ricerche, patent 47512A/87, January 1987] 참조)에 도말하여 37℃ 1일간 배양한 후 갈색의 환을 형성하는 균주를 선발하였다(문헌[Maria C. 등, J. clin. Microbiol. vol. 26, pp.791-793] 참조)(표 1). 각 균주의 활성을 검증하기 위하여 0.2% DL-페닐알라닌, 0.3% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨, 0.1% 제2인산나트륨, 2% 아가 등이 함유된 피에이 아가배지(문헌[Ewing WH 등, Public Health Lab, vol.15. pp.153-161. 1957] 참조)에 멸균된 루프로 접종한 후 37℃ 1일간 배양하여 1리터당 37% 염산이 2.5 ㎖ 함유되어 있는 10% 염화 제2철 용액을 페트리디쉬상에 부어 푸른색의 정도를 확인하였다(표 1). 또한 각 분리균주를 피에이 액체배지에 24시간동안 배양한 후, 그 배양액 1 ㎖를 동일한 비율로 희석하여 0.05M 포스페이트 완충액에 녹아있는 1% 페닐알라닌(바이오베이직(Biobasic), 미국)용액 1㎖를 사용하여 37℃, 5분간 반응한 후 3 N 가성소다액으로 반응을 정지시킨 시험액과 공시험액의 차이를 분광광도계(터모(Thermo), 미국)로 320 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 CC3-1균주가 가장 많은 페닐피루브산을 생산하는 것으로 확인되었다.

(2) 분리균주의 16S rDNA 동정

분리 선발된 CC3-1 균주를 피에이 한천배지에 도말하여 37℃에서 하루동안 배양한 후 콜로니를 1 ㎖의 증류수에 고농도로 현탁한 후 아쿠프렙 제노믹디엔에이 추출키트(Accuprep^® genomic DNA extraction kit, 바이오니아(Bioneer), 한국)를 이용하여 제놈 DNA를 추출하였다. 분리된 제놈 DNA는 전기영동을 통하여 확인하였다. 균주의 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 추출한 제놈 DNA를 주형으로 DNA 가닥을 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 27F 프라이머 (5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3')와 1492R 프라이머 (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3')였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃/1분, 55℃/1분, 72℃/1분의 조건으로 총 35 회 수행하였다. DNA 증폭 후 전기영동을 통하여 약 1500 bp 크기의 16S rDNA를 확인하였다. 증폭된 16S rDNA는 아쿠프렙 PCR 정제키트 (바이오니아, 한국)를 이용하여 정제하였다. 정제된 16S rDNA는 자동 DNA 서열분석기 (ABI 3100, 어플라이드 바이오시스템 인코포레이티드(Applied Biosystem Inc.), 미국)를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 상기의 27F와 1492R 프라이머 외에 530F 프라이머 (5' GTGCCAGCMGCCGCGG 3')와 1100R 프라이머 (5' GGGTTGCGCTCGTTG 3')의 두 가지 프라이머를 분석에 사용하였다. 이후 염기서열을 조합하여, 이즈택손(EzTaxon) 서버 (http://www.eztaxon.org/; Chun et al., 2007)를 이용하여 유연관계 동정 및 16s rDNA 유사도 측정을 하였다.

그 결과, 닭 맹장에서 분리된 CC3-1균주는 표준균주인 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) NCTC 11938T 균주와 99.78% 상동성을 나타내었다.

실시예 2: 아미노산 탈아미노화 효소의 클로닝

단계 1: T-벡터를 이용한 아미노산 탈아미노화 효소 유전자의 클로닝

실시예 1에서 선발된 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 균주의 탈아미노화 효소 유전자의 증폭을 위하여 서열번호: 2(5'-GGA TCC GAA TGA ACA TTT CAA-3') 및 3(5'-AAG CTT TTA CTT CTT AAA ACG-3')의 서열을 갖는 전방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때 반응용액은 총 50 ㎕에 주형 플라스미드 5 ㎕, 프라이머 각 10 pmol 1 ㎕, 익스택(ExTaq) 중합효소(타카라(TaKaRa)) 5 유닛 1 ㎕, dNTP 10 mM 8 ㎕, 및 10X 완충액 5 ㎕를 함유하였으며, 반응조건은 94℃ 5분; (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분) 35 사이클; 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은, 도 2의 (a)에 나타낸 바와 같이, 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 1422 bp의 밴드로 확인하였으며, ABI3700 염기해독기로 서열을 분석하여 이를 블라스트(Blast) 서버 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 기존의 아미노산 탈아미노화 효소와 비교 분석하여 본 발명에서 클로닝한 유전자 또한 아미노산 탈아미노화 효소의 역할을 하는 유전자 서열임을 확인하였다(도 2).

아미노산 탈아미노화 효소의 PCR 결과물을 추출한 후, pGEM^® - T 이지 벡터 시스템즈(Easy Vector Systems)(프로메가(Promega), 미국)을 사용하여 pGEM -T 이지 벡터에 삽입하였다. 이를 대장균 JM109(프로메가, 미국)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 JM109에서 플라스미드를 추출하여 제한효소인 Not Ⅰ으로 절단한 후 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 아미노산 탈아미노화 효소 유전자(1422 bp)가 pGEM^® -T 이지 벡터(3015 bp)에 클로닝되었음을 확인하였다.

단계 2: pET-28C(+) 발현벡터를 이용한 아미노산 탈아미노화 효소 유전자의 클로닝

pET-28C(+) 벡터(노바겐(Novagen), 미국)를 BamH Ⅰ및 Hind Ⅲ로 처리한 후, 아미노산 탈아미노화 효소 유전자가 삽입된 T-벡터를 BamH Ⅰ및 Hind Ⅲ로 처리하여 분리하였다. 분리된 아미노산 탈아미노화 효소 유전자 절편을 T4 DNA 결합효소를 이용하여 pET-28C(+) 벡터(노바겐, 미국)에 삽입시켰다. 유전자가 삽입된 재조합벡터를 pET-28C(+)-DA 벡터로 명명하였으며, 그 개열지도를 도 3에 나타내었다. 그 후, pET-28C(+)-DA 벡터를 대장균(BL21)에 도입하여 형질전환시켰다. 형질전환된 과발현 대장균(BL21)으로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소인 BamH Ⅰ및 Hind Ⅲ로 절단하여 아가로즈 겔 전기영동으로 아미노산 탈아미노화 효소 유전자의 크기를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 유래 아미노산 탈아미노화 효소 유전자(1422 bp)가 pET-28C(+) 벡터(약 5367 bp)에 클로닝되었음을 확인하였다.

실시예 3: 프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소의 활성 확인

단계 1: 형질전환체로부터 프로테우스 유래 아미노산 탈아미노화 효소의 발현 유도

얻어진 형질전환체 대장균 BL21(노바겐, 미국)을 카나마이신 50 ㎍/㎖이 함유된 LB 배지 10 mL에 접종하고 37℃에서 12 내지 16시간 교반 배양기에서 배양한 후, 이를 다시 카나마이신 50 ㎍/㎖이 함유된 LB 배지 100 mL에 이동접종하여 흡광도(O.D₆₀₀)값이 0.6 내지 1.0이 되도록 배양하였다. 배양된 배지에 이소프로필-베타-D 티오갈락토피라노사이드(isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside; IPTG) (시그마(Sigma)) 1 mM을 첨가하여 대량 발현을 유도한 후, 1시간씩 간격으로 12시간동안 배양하면서 배양액 1 ㎖씩을 취하였다. 아미노산 탈아미노화 효소의 발현 양상을 확인하기위해 5X 단백질 샘플 완충액(바이오닉스(Bionics), 한국)와 3차 증류수를 첨가한 후 100℃에서 10 내지 15분간 중탕 가열하였다. 이를 10,000 g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 각 시간별로 시료의 발현양상과 최적의 발현시간을 확인하기위해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophoresis)를 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 2시간 이후부터 50 kDa 크기의 프로테우스 유래 아미노산 탈아미노화 효소의 발현이 유도되었음을 확인하였다(도5).

단계 2: 프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소의 활성 확인

상기 단계 1에서 얻어진 세포 파쇄물과 대조군으로 pET-28C(+) 벡터만으로 형질전환시킨 형질전환체를 사용하여 상기 단계 1의 공정을 수행하여 얻은 용출액을 각각 고액분리기를 이용하여 7,000 rpm에서 10분간 분리하여 상등액을 제거하였다. 얻어진 각 단백질 펠렛(pellet)에 포스페이트 완충용액(조성: 100 mM 포스페이트, 10 mM EDTA)를 가하여 혼합한 후 초음파 분쇄기(소닉스(Sonics), 미국)로 3 kHz에서 약 1~2분 동안 분쇄하였다. 이를 다시 10,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후, 얻어진 단백질에 100 mM 포스페이트 완충용액을 첨가하였다. 효소 단백질의 활성을 확인하기 위해, 상기 단백질 용액 1 ㎖에 2%(w/v) 페닐알라닌(시그마, 미국)을 기질로서 1 ㎖를 첨가하여 37℃에서 20시간 동안 효소반응을 수행하였다. 3N NaOH 1 ㎖로 반응을 종결시키고 UV 분광광도계(spectrophotometer)(터모, 미국)를 이용하여 흡광도(A₃₂₀)를 측정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 프로테우스 유래 아미노산 탈아미노화 효소가 페닐알라닌을 기질로 하여 페닐피루브산을 생성시킨 것을 확인함으로써 클로닝된 프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소가 우수한 효소작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

단계 3: 프로테우스 미라빌리스 유래 아미노산 탈아미노화 효소의 기질특이성 시험

0.5% 페닐알라닌, 루이신, 아이소루이신, 0.1 내지 0.2 % 타이로신 용액을 0.05M 포스페이트 완충액으로 현탁한 아미노산 용액 1㎖에 단계 2의 방법으로 파쇄된 효소용액 1 ㎖를 가하여 37℃, 5 내지 30분간 반응시켜 후 산소전극(메틀러 톨레도(Mettler Toledo), 독일)을 사용하여 산소발생정도를 비교하였다. 그 결과 표 3과 같이 모든 시험에 사용된 아미노산에서 산소가 발생되어 다양한 유기산들의 생산이 가능함을 알 수 있었다.

실시예 4: 생물전환을 통한 기능성 유기산 대량생산

본 발명에 따른 프로테우스 미라빌리스 CC3-1 유래 아미노산 탈아미노화 효소를 대장균으로부터 생산하여 생물전환하여 유기산을 생산하는 방법은 다음과 같다. 전체적인 생산공정의 모식도는 도 6과 같다.

(1) 종균배양

형질전환된 대장균 균주를 50 ppm 카나마이신(바이오베이직, 미국), 25 ppm 클로로암페니콜이 들어있는 LB 아가배지에서 활성화되도록 배양한 후 콜로니 1 루프를 1 L LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 8 내지 14시간동안 150 내지 200 rpm으로 진탕배양하였다. 50 L 발효조에 총 부피가 30 L가 되도록 하기 27 L 용액 Ⅰ과 3 L 용액 Ⅱ를 분리멸균하여 냉각 후 여과멸균된 5% 카나마이신을 30 ㎖ 용액와 함께 혼합하고 DB 액체배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 진탕배양하였다.

용액 Ⅰ(27 L)

- 360 g 트립톤

- 720 g 효모추출물

- 120 ml 글리세린

용액 Ⅱ(3L)

- 69.3 g 무수제일인산칼륨(0.17 M)

- 376.2g 무수제이인산칼륨(0.72 M)

(2) 500 L 유도배양

하기 용액 1과 용액 2를 따로 멸균한 후 1 M/T 발효조에 혼합하고 37℃, 150 내지 200 rpm으로 진탕배양한 후, 1 내지 3시간째에 멸균된 30% 락토스용액 2.5 L를 투입하고 4 내지 12 시간동안 37℃, 150 rpm으로 유도배양하였다.

용액 1(450 L)

- 6 kg 트립톤

- 12 kg 효모추출물

- 2 L 글리세린

용액 2(50 L)

- 1.2 kg 무수제일인산칼륨(0.17 M)

- 6.3 kg 무수제이인산칼륨(0.72 M)

(3) 균체회수

유도배양이 끝난 500 L 배양액을 5,000 rpm으로 원심분리한 후 균체회수하고 미리 멸균하여 준비한 50 L 0.02 M 나트륨 포스페이트 완충액에 현탁하여 4℃로 차갑게 유지하였다.

(4) 세포파쇄

균체파쇄기(CSL, 영국)를 이용하여 10,000 psi로 형질전환 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 50 L 세포 파쇄물을 4℃로 원심분리하였고, 상등액을 회수하였다.

(5) 생물전환

기질인 페닐알라닌(대상, 대한민국) 25 kg을 0.02 M 인산 나트륨 완충액 1,000 L에 혼합하고 멸균하였다. 멸균 후 온도를 37℃로 냉각시킨 후 25 L 세포 파쇄물을 투입하였다. 100 내지 150 rpm으로 교반시키면서 생물전환 반응을 수행하였다. 각 시간별로 시료를 샘플링하여 생산된 기능성 유기산 중 페닐피루브산 생산량을 조사하였다(도 7). 그 결과 시간에 따라 페닐피루브산의 생산량이 급격히 증가하였으며, 10시간째 최대생산량을 나타내었다.

(6) 생산된 기능성 유기산들의 회수공정

반응이 끝난 반응액 1,000 L에 7 kg의 염화칼슘을 투입하고 교반기로 충분히 혼합하였다. 암모니아수로 pH를 9.4로 조정하였고 교반기로 충분히 혼합하였다. 다시 5 N 염산용액으로 pH를 8.5로 조정하였다. 그리고 5,000 rpm으로 원심분리하여 침전시켰다. 침전물을 40 내지 80 ℃로 열풍 혹은 진공 건조하여 건조무게를 측정하였다. 그 결과 1회 생물전환반응에 6.75 kg씩 2회 생물전환 반응시켜 총 13.5 kg의 건조물이 생성되었다.

도 1은 본 발명에 따른 프로테우스 미라빌리스 CC3-1에서 분리된 유전자를 증폭하여 전기영동한 결과이고,

도 2는 본 발명에 따른 아미노산 탈아미노화 효소 유전자가 클로닝된 T-벡터를 BamH Ⅰ및 Hind Ⅲ 로 절단하여 전기영동하여 확인한 결과이고,

도 3은 본 발명에 따른 아미노산 탈아미노화 효소 유전자를 대장균 발현 벡터인 pET-28C(+) 벡터에 클로닝시켜 제조한 재조합 벡터 pET-28C(+)-DA의 개열지도를 나타낸 모식도이고,

도 4는 본 발명에 따른 아미노산 탈아미노화 효소 유전자가 클로닝된 MpET-28C(+)-DA 벡터를 BamH Ⅰ및 Hind Ⅲ 로 절단하여 전기영동하여 확인한 결과이고,

도 5는 본 발명에 따른 아미노산 탈아미노화 효소 유전자가 클로닝된 pET-28C(+) 벡터로 형질전환된 대장균 BL21 균주에 IPTG를 처리하여 아미노산 탈아미노화 효소의 발현이 유도된 것을 확인한 결과이고,

도 6은 본 발명에 따른 아미노산 탈아미노화 효소 유전자에 의해 생산된 탈아미노화 효소 단백질을 생물전환 반응기내에서 다양한 기질 아미노산과 반응시켜 기능성 유기산들을 제조하는 생물전환공정의 전체적인 모식도이고,

도 7은 본 발명에 따른 아미노산 탈아미노화 효소 유전자에 의해 생산된 탈아미노화 효소 단백질을 생물전환 반응기내에서 페닐알라닌 기질과 반응시켜 제조한 페닐피루브산의 시간에 따른 생산량을 나타내는 그래프이다.

<110> Biotopia Inc. <120> Amino acid deaminase gene of Proteus Mirabilis, protein, recombinant vector and transformant, and method for manufacturing functional organic acids using the same <130> FPD/200801-0052 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1422 <212> DNA <213> Proteus mirabilis <400> 1 atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60 ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatctaga 120 gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180 ggtgccggta ttcaggggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240 actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300 attagttacc aaacatcgcc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360 cgtggcatga atgagaaaat tggtgcagat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420 gcgctggcgg atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480 gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540 cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600 gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660 atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720 gtgagtgaga aaggggcgat taaaacgtct caagttgtac tcgccggggg tatctggtcg 780 cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840 caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900 catttccgcg agcaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960 atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020 ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080 tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140 acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200 tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260 atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320 accgaaggcc cagcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380 attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer specific for an amino acid deaminase gene <400> 2 ggatccgaat gaacatttca a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer specific for an amino acid deaminase gene <400> 3 aagcttttac ttcttaaaac g 21

Claims (12)

1. 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) CC3-1에서 분리된 아미노산 탈아미노화 효소의 활성을 갖는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 효소 유전자.
2. 제 1 항의 유전자로부터 생산된 효소 단백질.
3. 제 1 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제 3 항에 있어서,

   대장균용 발현 벡터임을 특징으로 하는 재조합 벡터.
5. 제 4 항에 있어서,

   도 3의 개열지도를 갖는 pET-28C(+)-DA 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
6. 제 3 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제 6 항에 있어서,

   대장균, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 세균, 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 효모, 피키아 속(Pichia sp.) 효모 및 로도토룰라 속(Rhodotorula sp.) 효모로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
8. 제 7 항에 있어서,

   대장균임을 특징으로 하는 형질전환체.
9. 제 8 항에 있어서,

   대장균이 대장균 BL21 균주임을 특징으로 하는 형질전환체.
10. 제 2 항의 효소 단백질을 기질인 아미노산과 생물전환 반응시킴으로써 기능성 유기산을 제조하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서,

    기질이 페닐알라닌, 이소루이신, 루이신, 타이로신, 발린 및 라이신으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산임을 특징으로 하는, 기능성 유기산을 제조하는 방법.
12. 제 10 항에 있어서,

    기능성 유기산이 페닐락트산인 것을 특징으로 하는, 기능성 유기산을 제조하는 방법.

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