KR20140094772A

KR20140094772A - 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주와 이를 이용한 오르니틴의 고효율적 생산방법

Info

Publication number: KR20140094772A
Application number: KR1020130007202A
Authority: KR
Inventors: 이기성; 이광수
Original assignee: 이기성; 김형중; 배재대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2014-07-31

Abstract

본 발명은 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주와 이를 이용하여 오르니틴 생산성을 높일 수 있는 저비용 고효율적인 생물공정 방법에 관한 것이다.
즉 본 발명은 상기 균주 및 이를 이용한 효율적 생물공정 방법 중 사용된 복합배지 및 최소배지 구성과 배양 조건에 관한 것이다.

Description

아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주와 이를 이용한 오르니틴의 고효율적 생산방법{ Bacillus aryabhattai LKS28 comprising the highly efficient bioconversion activity of arginine into ornithine and its effective bioconversion process condition.}

본 발명은 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 탁월한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주를 제공하며 이를 이용하여 보다 저비용으로 효율적인 오르니틴을 생산할 수 있는 생물공정 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 균주를 이용한 생물공정 과정 중 사용된 최소배지 구성과 배양 조건을 제공한다.

오르니틴(ornithine)은 아르기닌, 프롤린, 및 폴리아민의 생합성에 사용되는 전구체로 식물, 동물, 미생물에서 널리 발견되는 물질이다. 비필수 아미노산이며, 단백질 성분으로서는 발견되지 않으며, 티로시딘(tyrosidine), 그라미시딘(gramicidine)과 같은 항생 펩타이드에 존재한다. 오르니틴은 고등동물의 생체 내 대사에서 오르니틴 회로를 통해 아미노산 또는 암모니아로부터 요소를 생성하여 체외로 배출하는 경로에서 중요한 역할을 한다. L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시켜 근육의 합성을 증가시키고, 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 미국을 중심으로 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 효과 등 새로운 기능성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

오르니틴은 근육 생성과 체지방 감소에 효과가 있기 때문에, 영양보충제로 사용되고 있고, 오르니틴과 알파케토글루타릴산이 2:1의 비율로 함유되어 있는 오르니틴-알파케도글루타릴산염(OKG)은 면역 증강 물질로 이용되고 있다.

유럽에서는 L-오르니틴-L-아스파라긴산염의 형태로 간장장애를 개선하는 의약품으로 이용되고 있고, 일본에서는 L-오르니틴 염산염의 형태로 식품소재로서 사용가능하며, 미국에서는 식이보조제로서 사용가능하다.(대한민국 특허공개 10-2009-0080797)

또한, 오르니틴은 간으로부터 유해한 암모니아를 제거하는데 도움을 주기 때문에, 간경화와 간기능장애를 개선하는 의약품으로 이용되고 있다.

이러한 오르니틴을 생산하는 방법으로는 우유 카제인(casein)을 소화 효소로 처리하는 방법 및 형질전환된 대장균 또는 아미노산, 핵산, 효소와 항생제 유사물질의 생산에서 널리 이용되는 산업용 미생물인 코리네박테리움 속 균주를 이용한 방법이 알려져 있다.(대한민국 특허공개 10-2012-0064045)

코리네박테리움 속 균주에서, 아르기닌(L-arginine)은 글루타메이트로부터 argCJBDFRGH 형태로 이루어진 아르기닌 오페론(operon) 구조의 유전자로부터 발현된 효소에 의해 합성된다. 아르기닌 생합성에 가장 중요한 역할을 하는 아르기닌 오페론 유전자들은 세포 내에서 합성된 글루타메이트(L-glutamate)를 기질로 이용하여 아르기닌을 합성하는데, 상기 아르기닌의 합성과정의 중간물질로 오르니틴을 생성하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에서 글루타메이트로부터 아르기닌의 합성 경로에서, argJ는 글루타메이트를 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate)로 전환시키고, argB는 N-아세틸글루타메이트를 N-아세틸글루타밀 포스페이트(N-acetylglutamylphosphate)로 전환시키며, argC는 N-아세틸 글루타밀포스페이트를 N-아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde)로 전환시키고, argD는 N-아세틸글루타메이트 세미알데히드를 N-아세틸 오르니틴(N-acetylornithine)으로 전환시키며, argJ는 N-아세틸 오르니틴을 오르니틴으로 전환시키고, argF는 오르니틴을 시트룰린(L-citrulline)으로 전환시키며, argG는 시트룰린을 아르기노숙시네이트(arginosuccinate)로 전환시키고, argH는 아르기노숙시네이트를 아르기닌으로 전환시키는 효소를 코딩한다고 알려져 있고, 상기 아르기닌의 생산경로에 오르니틴을 생성하는 과정이 포함된다고 알려져 있다.

기존에 알려진 아르기닌 생산 균주는 아르기닌 오페론에 돌연변이를 도입하거나 프로모터(promoter) 등의 변이를 통하여 아르기닌 생합성에 관련된 효소의 발현량을 증가시키는 방법으로 개발되었다. 그 중 아르기닌 오페론 유전자의 발현을 조절하고 억제하는 argR과, 아르기닌 농도에 의해 저해를 받는 argB가 아르기닌의 생산량을 증가시키기 위한 표적으로서 널리 연구되었다(대한민국 특허공개 제2010-0060909호).

또한, 오르니틴의 생산성을 향상시키는 방법으로는, 코리네박테리움 속 미생물을 프롤린(proline)을 첨가한 배지에서 배양하여 오르니틴 사이클로디아미나아제(ornithine cyclodeaminase, ocd)의 작용에 의해 오르니틴의 생성량을 증가시키는 방법, 상기 미생물의 배양시 임펠라(impeller) 및 공급(feeding) 조건의 변형에 의해 오르니틴 생산성을 향상시키는 방법 등이 알려져 있고, 형질전환된 대장균을 이용하는 경우에는 argF와 argR가 결실된 균주를 배양할 때 글루타메이트를 배지에 첨가하여 오르니틴의 생산성을 향상시키는 방법, 글루타메이트에서 오르니틴으로 가는 경로 이외에 글루타메이트로부터 프롤린을 생성하는 경로의 첫 단계에 관여하는 감마글루타밀키나아제(γ-glutamylkinase)를 코딩하는 유전자 proB를 결실시킨 형질전환 균주를 이용하여 오르니틴의 생산성을 향상시키는 방법 등이 알려져 있다.

아울러, 오르니틴 전구체인 글루타메이트의 고수율 생산에 관한 연구는 코리네박테리움 글루타미쿰을 대상으로 오랫동안 진행되었다. 그 중 코리네박테리움 글루타미쿰의 글루타메이트 배출능은 비오틴 (biotin) 결핍조건이나 페니실린 G(penicillin G) 또는 지방산 에스테르 계면활성제를 처리할 경우에 증가된다고 알려져 있는데, 이로부터 세포벽이 손상될 경우에 글루타메이트가 손상된 세포벽을 통해 보다 분비가 활성화됨이 알려져 있다.(대한민국 특허공개 제2010-0017581호).

김치는 오랜 역사를 가진 한국의 대표 발효식품으로 2001년 7월 Codex 국제식품규격을 획득하여 세계 각국의 절임류와는 차별화된 자연발효식품이다. 또한 김치에는 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 등이 풍부하며 건강에 좋은 박테리아인 젖산균이 많아 소화를 도와줄 뿐만 아니라 암세포의 성장을 막는 성분들을 가지고 있는 것으로 밝혀지고 있어 세계에서 가장 건강한 식품(World's Healthiest Foods) 5가지 중의 하나로 김치를 선정되기도 하였다

김치는 여러 발효생성물과 재료성분인 식이성분, 비타민, 카로틴, 젖산, 젖산균, 아세틸콜린, 덱스트란(dextran), 아세테이트(acetate) 등이 풍부하여 인체 내에서 면역증강, 항산화, 항균, 항콜레스테롤, 발암 및 변이 물질의 생성을 방지하는 기능을 갖는 기능성 식품으로 알려져 있다. 특히 채소에 풍부한 식이섬유는 변비를 예방하며 풍부한 젖산균은 장내의 유해 미생물의 생육을 억제하여 장내 균총을 개선하는 프로바이오틱(probiotic) 효과를 갖는다. 실제로 김치를 하루에 300g/day 쯤 먹으면 안 먹은 사람에 비하여 대장에 젖산균이 100배가량 증가하므로 김치는 장을 튼튼히 하고, 유해한 균의 생육을 저지하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

김치에는 락토바실러스(Lactobacillus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 바이셀라(Weissella) 속 등의 주요 균주가 있고 이들 균주가 김치발효에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이중 김치속의 풍부한 젖산균들은 락테이트(lactate), 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acidGABA), 박테리오신(bacteriocin) 등 다양한 물질들을 생산하여 식품의 보존, 산미와 향미의 부여, 식중독균의 억제 효과 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 등의 균주는 한국 김치의 맛을 결정하는 우점종으로 알려져 있다. 또한 김치 젖산균 생성물질들은 체내 지질개선, 면역증강, 항 AI(avian influenza) 효능 등의 효과가 있어 의약품이나 화장품의 중간물질로도 이용되고 있다.

L-오르니틴(L-ornithine)은 단백질을 구성하는 아미노산이 아니지만 식품에 통상 함유돠어 있는 아미노산이다. 특히 담수성 쌍각류조개, 재첩중의 L-오르니틴 함량이 비교적 높다. 재첩엑기스 100g중에 유리 오르니틴 함량은 159.9mg이며, 재첩을 저온처리하면 유리 L-오르니틴 함량이 상승한다고 알려져 있다.(대한민국 특허공개 10-2011-0081672)

따라서, 본 발명은 우리나라 고유의 음식의 하나인 김치로부터 오르니틴 생성능력이 있는 균주의 분리, 동정 및 특성 등에 대하여 연구함으로써 김치 균주의 생리활성물질 생성능력을 파악하고 이를 통해 우리김치의 우수성을 과학적으로 입증하고자 하였다. 또한, 본 발명의 결과를 토대로 우리나라 발효식품유래의 오르니틴 생성 미생물을 활용하여 저비용 고효율 생산율을 제고하고자 하였다.

즉, 오르니틴 고생산성 균주를 이용하여 오르니틴 생전환 제조방법을 제시하고자 하였다.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 첫번째 목적은 오르니틴 고생성능을 갖는 새로운 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 보다 효율적인 오르니틴 생산공정 배지 및 배양조건을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 탁월한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주를 제공한다.

본 발명은 상기 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 탁월한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28를 이용하여 보다 효율적인 오르니틴 생산공정 및 배양조건 등을 제공한다.

본 발명으로 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주를 제공할 수 있으며 이를 이용한 보다 효율적인 오르니틴 생산공정을 제공 할 수 있다. 또한 본 발명에서 생산공정에 이용된 최소배지를 적용함으로서 기존 복합배지 사용 시 보다 저비용 이면서 효율적으로 오르니틴을 생산 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)LKS28균주의 불용성 인산염 가용화능을 나타낸 사진
1 : 3마그네슘인산(Mg₃(PO₄)₂)에 대한 가용화능, 2 : 3칼슘인산(Ca₃(PO₄)₂에 대한 가용화능, 3 : 패화석에 대한 가용화능
도 2은 본 발명의 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)LKS28균주의 계통분류학적 근연도를 나타낸 그림
도 3는 본 발명의 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)LKS28균주의 유리아미노산TLC분석결과를 나타낸 그림으로, 복합배지에서 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)LKS28균주가 아르기닌을 오르니틴으로 생전환한 능력을 나타낸 결과 그림이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)LKS28균주의 유리아미노산TLC분석결과를 나타낸 그림으로, 최소배지에서 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)LKS28균주가 아르기닌을 오르니틴으로 생전환한 능력과 효율을 나타낸 결과 그림이다.

본 발명의 하나인 아르기닌을 오르니틴으로의 생전환능이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주에 관한 것이다.

본 발명에 의한 상기 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주는 기능성과 영양성이 증진된 식품 개발의 일환으로 김치에서 분리한 균주 중 하나로서 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 우수한 균주이다.

본 발명에 의한 상기 균주는 고초균의 일종으로서, API 검정(API test)를 통하여 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus strain 이라는 것을 알 수 있었고, 그 특성은 하기 표 1과 같은 형태학적, 생리학적 특성 및 영양요구성을 지닌다. 또한 이 균주의 보다 정확한 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 결정을 시행하므로서, Bacillus aryabhattai임을 알 수 있었다.

본 발명의 또다른 하나는 상기 균주를 이용한 오르니틴 생산공정 방법이다. 일반적으로 복합배지에 균주를 접종하여 오르니틴을 생산하고자 하는데 반하여 본 발명에서 구성한 조건의 최소배지를 사용 할 경우 배지의 비용절감은 물론 오르니틴 생산 수율을 높일 뿐만 아니라 오르니틴 분리가 매우 용이해질 수 있었다.

이러한 오르니틴으로의 생전환 능력은 TLC(Thin Layer Chromatography : 박층크로마토그래피)분석방법으로 검증·조사하고 분석하였다.

균주의 선발 및 특성규명

김치로부터의 균주선발을 위해서는 엠알에스(MRS)배지와 트립톤 이스트(TYE)배지 등에서 배양한 후 1차적으로 분리 선별 하였다.

김치로부터 분리한 미생물들을 최소배지에 불용성 인산염(3마그네슘인산, 3칼슘인산, 패화석)이 각각 포함된 고체배지에 접종하여 배양하였다. 배양 후 고체배지에 투명환을 나타내는 불용성 인산염 가용화 균주를 순수배양하였다. 순수배양된 균주를 상기의 불용성 인산염 고체배지에 각각 접종하여 각 균주의 불용성 인산염 가용화 범위를 조사하였다. 투명환의 크기를 분석하여 불용성 인산염의 가용화능이 높은 균주를 분리하였다.

그 결과 선발된 균주의 일반적인 생리생화학적·형태적인 특징은 다음과 같다.

선발된 균주의 일반적 특징

Characteristics	LKS 28
Gram Stain	+
Urease Test	+
Oxidase Test	+
Gelatinase Test	+
Indole Production	-
Voges-Proskauer Test	+
Nitrate Reduction Test	+
Starch Hydrolysis	+

순수배양된 균주를 상기의 불용성 인산염 고체배지에 각각 접종하여 각 균주의 불용성 인산염 가용화 범위인 투명환의 크기를 분석한 결과 불용성 인산염의 가용화능이 매우 높았다(도 1).

분리된 균주의 염기서열과 기존 균주와의 유전유사도 조사

MRS, TYE 배지 및 생리활성 기능 확인 배지 등에서 우수한 생리활성능을 보인 미생물들을 선별하여 16S rDNA분석과 API kit 분석 등으로 분류 동정하였다.

MRS, TYE 배지 및 생리활성 기능 확인 배지 등에서 우수한 생리활성능을 보인 미생물들의 16S rDNA분석을 위하여 PCR primer를 제작하였다.

16S rDNA 분석에 사용된 호스트균주와 플리스미드 DNA 및 프라이머

Name	Phenotype
Plasmids
pBluescript Ⅱ	pBluescriptⅡ SK(+/-) phagemid, Amp^r, lacz gene, MCS	Stratagen
E. coli
DH5α	F^-Φ80dlacZ△(lacZYA-argF)U160 endA1 recA1 hsdR17(r_k-m_k+) deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1
Primer
16s 63F	5'-CCCAAGCTTAACTGCAGCAGGCCTAACACATGCAAGTC-3'
16s 1406R	5'-CGGAATTCGGGATCCACGGWGTRCAAG-3'

분리한 미생물을 NB broth 5㎖에 균주를 접종하여 37℃에서 12～16시간동안 배양한 후, NB broth 50㎖에 배양된 균주를 다시 접종하여 12～16시간동안 배양하였다. 배양액을 4℃에서 13,000rpm으로 10min동안 원심분리한 후 상등액은 버리고 세포를 얻었다. 얻어진 세포에 TE buffer 567㎕, 10% SDS 30㎕, proteinase K(20㎎/㎖) 3㎕를 첨가한 후 vortexing하여 균질화 하였고, 37℃에서 1시간동안 incubation하였다. 5M NaCl 100㎕을 첨가 후 균질화 하고 CTAB/NaCl solution 80㎕를 첨가 후 vortexing하여 65℃에서 10min동안 반응시켰다. 혼합액에 chloroform:isoamyl-alcohol(24:1)을 동량 첨가하고 vortexing한 후, 5min 동안 원심분리하여 상등액을 새 tube에 옮겼다. 상등액에 동량의 phenol:chloroform:isoamyl alcohol(25:24:1)을 첨가하고 vortexing한 다음 10min간 원심분리하여 상등액을 새 tube에 옮겼다. 얻어진 상등액에 0.6배 부피의 isopropanol을 첨가한 후 천천히 inverting하여 genomic DNA가 배출되게 하였다. 백색의 genomic DNA 가닥이 육안으로 보이면, 유리봉으로 건져내어 70% 에탄올 1㎖을 첨가한 후 4℃, 13,000rpm으로 10min동안 원심분리하여 상등액을 버리고 건조하였다. RNase가 첨가된 멸균증류수로 현탁한 후 37℃에서 30min간 반응하여 RNA를 제거한 후 -20℃에 보관하였다.

균주에서 추출한 genomic DNA를 template DNA로 사용하였고, PCR 증폭은 Gene Cycle^TM(BIO-RAD Co.)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응용액은 제작된 primer(10pmol)를 각각 3㎕씩 첨가, template DNA(10ng Genomic DNA) 5㎕, 멸균증류수 39㎕를 PCR Mixer (Bioneer Co. Korea)에 첨가하여 혼합한 후 mineral oil을 첨가하였다. PCR 반응조건은 94℃ 4min간 denaturation을 1cycle, 94℃ 1min동안 denaturation, 60℃ 1min 간 annealing 72℃ 1min 30sec간 elongation과정을 30cycle 시행한 후, 72℃에서 10min 동안 final extension을 하였다. 증폭된 DNA는 0.8% agarose gel로 전기영동하여 확인하였다.

E. coli strain DH5α를 TYE 평판배지에 도말한 후 37℃에서 12～16시간 동안 배양하여 single colony를 얻었다. Single colony를 5ml SOB(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.058% NaCl, 0.019% KCl, pH 7.0)에 1/100 부피로 접종하고 A₆₀₀값이 0.4～0.6이 될 때까지(약 3시간)더 배양하였다. 배양액을 4℃에서 원심분리(4,000 rpm, 10분)한 후 10% glycerol을 첨가하여 3회 세척하였다. 이렇게 제조된 competent cell을 각각 80㎕씩 분주하여 electroporation을 위해 -70℃에 보관하여 사용하였다. EcoRⅠ으로 enzyme digestion된 pBluescriptⅡ KS vector를 self-ligation한 것과 pBluescriptⅡ vector 1㎕을 각각 제조한 competent cell에 electroporator(BioRad)를 이용하여 전기충격으로 형질전환(transformation)을 수행하여 TYE-Amp 고체배지에서 형질전환율을 확인하였다.

DNA를 cloning은 증폭된 PCR product인 16S DNA를 BamHⅠ과 HindⅢ로 double digestion하고 pBluescriptⅡ KS vector도 BamHⅠ과 HindⅢ로 digestion하였다. 절단한 PCR 산물과 cloning vector를 혼합하여 T4 ligase(Elpis co.)로 ligation을 16℃에서 2시간 실행하였다. Ligation 반응액을 20-30분간 drop dialysis를 실행하여 salt를 제거한 후, cuvette에 E. coli DH5α와 ligation sample을 섞어 30분간 ice에 방치한 후 eletroporation을 실시하였다. SOC 1㎖(SOB 980㎕. 2M Mg² ⁺ 10㎕, 40% glucose 10㎕)에 cuvette의 sample을 옮겨 담은 후 37℃의 shaking incubator에서 1～2시간 동안 배양하였다. 80㎕의 X-gal (20mg/DMF 1㎖)이 도말된 TYE Amp 고체배지에 SOC에 배양된 재조합체를 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하여, Blue-White screen을 통해 선별된 colony를 PCR 산물의 vector내 삽입유무를 확인하기 위하여 배양하고 plasmid를 분리하였다. 분리한 plasmid는 BamHⅠ과 SalⅠ, EcoRⅠ과 SalⅠ가하여 37℃에서 2시간 동안 digestion한 다음 0.8% agarose gel에서 insert DNA를 확인하였다.

항생제(Amp)가 첨가된 TYE broth 배지 5㎖에 선별된 균주를 접종하여 37℃에서 12～16시간동안 배양한 후, 4℃, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 cell을 얻었다. 얻어진 cell에 100㎕의 solutionⅠ(0.9% glucose, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl pH 8.0, 4㎎/㎖)을 넣고 혼합하여 균질화한 후, 200㎕의 solutionⅡ(0.2N NaOH, 1% SDS)를 넣어 용해시켜 얼음에 5분 동안 반응시켰다. 10분이 경과하지 않도록 주의하면서 150㎕의 solutionⅢ(5M potassium acetate 60㎖, glacial acetic acid 11.5㎖, dH₂O 28.5㎖)을 첨가한 후, 10분 동안 얼음에서 반응시킨 후 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 새 tube에 옮기고 동량의 phenol: chloroform: isoamylalcohol(25:24:1)을 처리하여 혼탁 시킨 다음 5분 동안 상온에서 원심분리하였다. 얻어진 상등액을 새 tube에 옮긴 후 100% 에탄올 (-20℃) 1㎖을 첨가하여 salt를 제거하고 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 버린다. 이어서 70% 에탄올 (-20℃) 1㎖을 첨가하여 침전시킨 후 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 버리고 건조시킨 다음 멸균증류수로 녹이고 RNase (10㎎/㎖)로 RNA를 분해하여 -20℃에 보관하였다.　염기서열분석을 목적으로 하는 plasmid DNA 분리 시 Promega사의 plasmid purification kit를 사용하였다. 염기서열 결정은 코스모진텍에 의뢰하여 실험하였고, 상동성분석에는 NCBI의 BLAST research program을 사용하여 실시하였다.

결정된 16S rDNA의 염기서열을 NCBI의 유전자은행에 등록된 균주들과 비교하여 계통수와 유전유사도를 조사하고 그 결과를 도 2에 나타냈다.

다음 염기서열과 같이 선발된 균주는 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai)의 신규균주로 나타났다.

GCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT

본 발명자들은 선발된 균주를 바실러스 아리압하타이 (Bacillus aryabhattai) LKS28로 명명하고 이를 2011년 11월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 등록기탁하였다.(기탁번호 : KCTC 12085BP)

Bacillus aryabhattai LKS28균주의 아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 효율을 측정하는 실험은 TLC방법으로 분석 조사하였다.

즉, 기능성물질인 오르니틴의 생산성을 확인하기 위하여 실험용 조건배지는 복합배지(TYE)와 최소배지(M)에 아르기닌을 첨가하지 않은 조건과 아르기닌을 첨가한조건(0.1%)으로 각각 구성하였다.

선택된 각각의 미생물을 1차적으로 MRS(Lactobacillus 속), TYE(Bacillus 속) 액상 배지에 2day 동안 전 배양 후 다음과 같이 준비된 실험용 조건배지에 100㎕씩 접종 후 28℃에서 50h 배양하여 TLC분석용 시료를 준비하였다.

기본 복합배지 및 최소배지 조성

액체배지	조성 / L (단, 고체배지는 agar 20g/L 첨가)
MRS	Proteose Peptone No.3 Beef Extract Yeast Extract Dextrose Polysorbate 80	10.0g 10.0g 5.0g 20.0g 1.0g	Ammonium Citrate Sodium Acetate Magnesium Sulfate Manganese Sulrate Dipotassium Phosphate	2.0g 5.0g 0.1g 0.05g 2.0g
TYE	Tryptone Yeast Extract	15.0g 5.0g	Sodium chloride	8.0g
Minimal Medium (M)	Glucose KH₂PO₄ Ca(NO₃)₂	15.0g 0.25g 1.0g	MgSO₄ KCl FeCl₃	0.25g 0.12g trace

TLC 분석용 시료를 위한 균주별 본 배양 조건(실험용 조건배지 및 배양조건)

접종 균주	배지 구성	비고
젖산균류	- MRS, MRS+Arg(0.1%), MRS+Glu(0.1%) - M, M+Arg(0.1%), M+Glu(0.1%)	28℃/50h 배양 Arg : Arginine Glu : Glutamic acid MRS : 젖산균용 복합배지 TYE : Bacillus속 등 일반균주용 복합배지 M : 최소배지 (Minimal medium)
*Bacillus* 속	- TYE, TYE+Arg(0.1%), TYE+Glu(0.1%) - M, M+Arg(0.1%), M+Glu(0.1%)

상기와 같은 실험용 조건배지에서 배양되어진 본 배양액(sup+cell / 500ul)자체와 배양액(500ul)을 원심분리하여 상등액(sup), 세포(cell)로 시료를 준비한 후 각 각의 배양액(sup+cell), 상등액(sup), 세포(cell) 시료에 유리아미노산 추출용 용매조성비(methanol : chloroform : D.W = 12 : 5 : 3)가 되도록 5ml을 처리하였다. 시료를 vortex mixer로 잘 섞었다. 그 후 원심분리(3000rpm 5분)하여 상등액을 취하여 아미노산분석용 TLC plate(silica G)에 100ul씩 점적 한 후 전개용매(1-butanol : acetic acid : D.W = 80 : 20 : 20)를 이용하여 전개 하였다. 전개 후 실온에서 건조시킨 다음, 아미노산의 발색을 위하여 1% ninhydrin/ethanol 용액을 조제하여 분무 후 110℃에서 5~10분간 반응 시켰다.

표5, 도3, 4에서 보여 주듯이 TYE(lane1), TYE+Arg(lane2), TYE+Glu(lane3)와 같은 복합배지에 선발된 균주(Bacillus aryabhattai LKS28)를 접종 후 50h 배양했을 때, lane4(TYE), lane5(TYE+Arg)와 lane6(TYE+Glu)에서 나타난 바와 같이 복합배지에서는 생물전환이 관찰이 미약하였으나(A-lane5), 매우 특이하게 최소배지에서 생물전환이 매우 잘 일어남을 알 수 있었다.(B-lane5)(표5, 도 3, 4)

도면3, 4의 설명표(유리아미노산 분석용 TLC시료 배양조건)

도면	Lane No .	배지조성	배양조건	비고
A	Lane 1	TYE 배지	접종 전	배지원액
	Lane 2	TYE+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 3	TYE+Glu(0.1%) 첨가배지
	Lane 4	TYE 배지	접종 후 (균주 LKS 28을 28℃에서 50h 배양)	sup(배양상등액) +Cell(세포)
	Lane 5	TYE+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 6	TYE+Glu(0.1%) 첨가배지
	Lane 7	TYE 배지	접종 후 (균주 LKS 28을 28℃에서 50h 배양)	sup(배양상등액)
	Lane 8	TYE+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 9	TYE+Glu(0.1%) 첨가배지
	Lane 10	TYE 배지	접종 후 (균주 LKS 28을 28℃에서 50h 배양)	cell(세포)
	Lane 11	TYE+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 12	TYE+Glu(0.1%) 첨가배지
B	Lane 1	M 배지	접종 전	배지원액
	Lane 2	M+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 3	M+Glu(0.1%) 첨가배지
	Lane 4	M 배지	접종 후 (균주 LKS 28을 28℃에서 50h 배양)	sup(배양상등액) +Cell(세포)
	Lane 5	M+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 6	M+Glu(0.1%) 첨가배지
	Lane 7	M 배지	접종 후 (균주 LKS 28을 28℃에서 50h 배양)	sup(배양상등액)
	Lane 8	M+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 9	M+Glu(0.1%) 첨가배지
	Lane 10	M 배지	접종 후 (균주 LKS 28을 28℃에서 50h 배양)	cell(세포)
	Lane 11	M+Arg(0.1%) 첨가배지
	Lane 12	M+Glu(0.1%) 첨가배지

이러한 결과는 획기적인 결과로서

① 아르기닌(Arg)→오르니틴(Orn)으로의 생전환용 배지를 복합배지 대신 저비용 최소배지(100배 이상 저렴)로 제조할 수 있다.

② 또한 생전환(Arg→Orn) 효율도 복합배지 못지않게, 최소배지에서도 탁월한 생전환 효율을 보이므로서 저비용·고생산 공정을 제공하였다.

③ 따라서 균주(Bacillus aryabhattai LKS28) 자체 특성이 생전환능(Arg→Orn), 불용성염가용화능, 항균활성능 등 다양한 기능을 가지므로서 다양한 방면(사료, 미생물제제, 생물비료, 생균제, 화장품, 식품, 의약품, 환경보전제 등)에서 활용될 수 있다는 점이 매우 중요하다.

즉, 이 균주를 실제 저비용·고효율적 생전환(Arg→Orn)공정을 위해 저비용·최소배지에서 적용했을 때 매우 탁월한 고생산성·고효율성을 나타난 점 역시 응용측면에서 매우 중요하였다.

④ 뿐만 아니라 최소배지에서 생전환(Arg→Orn)이 60% 이루어 지므로서, 최종 목표 생전환 산물인 고가의 기능성 오르니틴(Orn)을 매우 쉽게 분리·수획·정제할 수 있다는 점이다.

시간적, 경제적 측면뿐 아니라 기술적으로도 최종산물을 쉽게 획득할 수 있음은 본 발명의 또 다른 장점이다.

Claims

아르기닌을 오르니틴으로 생전환하는 능력이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주
아르기닌을 오르니틴으로의 생전환 능력이 우수한 바실러스 아리압하타이 엘케이에스28균주를 이용한 오르니틴 고효율 생산 공정 방법 중 사용된 복합배지와 최소배지 구성 및 배양조건(10~35℃, 12h 이상 배양). 단, 아르기닌 농도는 0.1~5%, 포도당은 설탕, 과당, 당알콜 등으로 대신할 수 있음을 포함한다. 당들의 농도는 1.5~5%를 포함한다.