CN116574642A - 一种阿氏普里斯特氏菌yz-151发酵制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种阿氏普里斯特氏菌yz-151发酵制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种阿氏普里斯特氏菌YZ‑151发酵制剂及其制备方法和应用，属于生防细菌发酵及应用领域，制备方法包括：将阿氏普里斯特氏菌YZ‑151进行活化处理；将活化后的阿氏普里斯特氏菌YZ‑151制成发酵种子液；将发酵种子液接种于发酵培养基中开始发酵，调节发酵pH4.0～9.0、发酵温度25℃～40℃、发酵接种量1％～10％、发酵装液量30mL/250mL～200ml/250ml、发酵转速110r/min～200r/min和发酵时间1d～6d，获得阿氏普里斯特氏菌YZ‑151发酵制剂。该阿氏普里斯特氏菌YZ‑151发酵制剂对刺五加黑斑病和灰霉病具有良好的防治效果。
Description
技术领域
本发明属于生防细菌发酵及应用技术领域，尤其涉及一种阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂及其制备方法和应用。
背景技术
刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms，别名五加皮、坎拐棒子、一百针、老虎潦，为五加科五加属落叶灌木。刺五加在中国医药学中做为药物广泛应用已有悠久的历史，刺五加的干燥根、根茎、根皮、叶和果实均可入药，具有补中益精、坚筋骨、强志意等功效。刺五加含有多种不同的活性成分和矿物质，现代药理研究结果表明：刺五加具有抗癌、保护肝脏、抗衰老、抗氧化和降血压等药理活性。
随着刺五加栽培面积和栽培区域的逐年扩大，其病害问题严重限制了刺五加的产量和质量。刺五加黑斑病和刺五加灰霉病是造成刺五加产量和质量损失的一种具有破坏性的叶面传播疾病。刺五加黑斑病和刺五加灰霉病是刺五加栽培中的主要病害，主要危害叶片，也可危害茎、花梗、果实、种子等部位。目前，基于传统的病害防治方法如农药和化学制剂等，存在耐药性、环境污染等问题。
生物防治是一种绿色、安全、无污染的防治手段，有益微生物通过拮抗作用、竞争作用、产生抗菌物质等作用机制抑制病原菌生长和繁殖，且不易使病原菌产生耐药性，因此，寻找具有环境友好特性的病害防控途径是目前刺五加生产上亟待解决的重要问题。
芽孢杆菌在应用和生产中是最具前景的生防微生物资源，其防治植物病害主要方法之一是通过拮抗菌本身及其产生代谢产物，而提高拮抗菌繁殖能力和代谢产物的能力是提高其防治植物病害的关键。生防细菌在发酵过程中，发酵液的营养因子、环境因子起到主导作用，各因子交互作用较为复杂，因此探究其对生防细菌生长代谢的影响是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿氏普里斯特氏菌YZ-151发酵制剂及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151进行活化处理；
(2)将活化后的阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151制成发酵种子液；
(3)将发酵种子液接种于发酵培养基中开始发酵，调节发酵pH 4.0～9.0、发酵温度25℃～40℃、发酵接种量1％～10％、发酵装液量30mL/250mL～200ml/250ml、发酵转速110r/min～200r/min和发酵时间1d～6d，获得阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂。
作为优选的实施方式，所述阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151已于2023年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62894。
作为优选的实施方式，步骤(1)的具体操作步骤如下：
将阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151接种于含有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基的培养瓶中，装液量50mL/100mL，32℃、180r/min震荡培养12h进行活化。
作为优选的实施方式，步骤(2)的具体操作步骤如下：
将活化后的阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151调节OD600至1.0左右，以接种量100μL接种于牛肉膏蛋白胨肉汤培养基中，32℃、180r/min培养12h，获得发酵种子液。
作为优选的实施方式，步骤(3)中，所述发酵培养基包括：玉米粉5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L和氯化钠5g/L。
作为优选的实施方式，步骤(3)中，所述发酵pH为6.0，所述发酵温度为30℃，所述发酵接种量为7％，所述发酵装液量为80ml/250ml，所述发酵转速为200r/min，所述发酵时间为1d～2d。
本发明提供一种通过上述制备方法制备获得的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂。
本发明提供的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂在制备植物病原菌拮抗剂中的应用。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌拮抗剂为刺五加病原菌拮抗剂。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌包括：细极链格孢(A.tenuissima)和灰葡萄孢(B.cinerea)。
本发明的有益效果是：
本发明所筛选的一株阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151，已于2023年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62894。为了进一步提高阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151对刺五加黑斑病和灰霉病的防治效果，本发明通过筛选影响阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151产抑菌活性物质的关键培养基成分和培养条件因子，通过单因素法及正交法对发酵工艺进行优化，以期为该菌株工业化生产和提高菌株抑菌活性物质提供技术支撑和理论指导。经过试验证实，由阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵所得的发酵制剂YZ-151BX对由细极链格孢A.tenuissima引起的刺五加黑斑病具有良好的防治效果，在刺五加黑斑病离体叶片试验中发现，发酵制剂YZ-151BX能够降低刺五加黑斑病的病情指数，防效显著高于枯草芽孢杆菌和苯醚甲环唑；由阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵所得的发酵制剂YZ-151BH对由灰葡萄孢B.cinerea引起的刺五加灰霉病具有良好的防治效果，在刺五加灰霉病离体叶片试验中发现，发酵制剂YZ-151BH防效与枯草芽孢杆菌、腐霉利防效相当。
本发明优化了阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151的发酵条件，并以菌株YZ-151对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)和灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)的抑菌活性为考量指标，以提高菌株发酵液抑制活性为目的，为刺五加黑斑病和灰霉病的防治及生防菌剂的开发提供了理论依据。
附图说明
图1为菌株YZ-151对刺五加黑斑病病原菌和灰霉病病原菌的拮抗效果。图中，A为刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)，B为刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)。
图2为菌株YZ-151的菌落形态。
图3为基于菌株YZ-151的16S rDNA部分序列构建的系统发育树。
图4为不同碳源处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图5为不同氮源处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图6为不同pH值处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图7为不同温度处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图8为不同时间处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图9为不同接种量处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图10为不同装液量处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图11为不同转速处理下菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性影响。
图12为菌株YZ-151发酵前后对于细极链格孢A.tenuissima的抑菌情况对比图。图中，A为菌株YZ-151发酵前在BPY基础发酵液中培养48h后的抑菌情况，B为以最佳发酵条件对菌株YZ-151进行发酵后所获得的菌株YZ-151发酵制剂YZ-151BX的抑菌情况。
图13为菌株YZ-151发酵前后对于灰葡萄孢B.cinerea的抑菌情况对比图。图中，A为菌株YZ-151发酵前在BPY基础发酵液中培养48h后的抑菌情况，B为以最佳发酵条件对菌株YZ-151进行发酵后所获得的菌株YZ-151发酵制剂YZ-151BH的抑菌情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料
刺五加根际土：采自于吉林农业大学药用植物园种植基地(43°48′23″N,125°24′57″W)。
供试病原菌：细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea均由吉林农业大学植物病害综合治理实验室提供。
各培养基配方如表所示。
细菌提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0：购自于长春海灵科贸有限公司。
实施例1菌株YZ-151的筛选、鉴定和保藏
一、筛选
1)收集若干健康刺五加根际土壤样品，风干土壤样品后过20目筛。称取样品10g后放入装有玻璃珠与90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡10-30min，混匀后静置5min。无菌条件下梯度稀释至10-4备用，以200μL各稀释液涂布于NA培养基上。每个处理重复3次，平板倒置于恒温培养箱内，30℃纯化培养24-48h，分离出多株纯菌落，进行编号后4℃保存备用。
2)无菌条件下，挑取细菌各单菌落分别划线接种于含NA培养基的平板，于恒温培养箱内30℃倒置培养24h后，挑取3块直径约1cm的菌饼接入含NB培养基的三角瓶(装液量50mL/100mL)中，32℃、180r/min震荡培养24h后即得NB细菌培养液。
3)采用滤纸片法初筛：将活化好的刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)分别制成直径8mm的菌饼，在无菌条件下接种于含PDA培养基的平板(平板直径为90mm)中心，同时将灭菌的滤纸片浸泡在NB细菌培养液中1min，进行阴干，之后将滤纸片粘于距上述平板中心约25mm处的4个对称角点，以单独接种病原菌为对照，每个处理重复3次，置于25℃恒温培养箱中暗箱培养。待对照组长满平板，对病原菌生长情况进行测量，观察有无抑菌带产生。
4)采用牛津杯法复筛：将NB细菌培养液于4℃、12000r/min离心20min，收集上清液，经0.22μm滤膜进行去菌体，收集无菌滤液。在含PDA培养基的平板中心接种直径为8mm的菌饼，将4个无菌牛津杯放入距上述平板中心约25mm处的4个对称角点，每个无菌牛津杯内加入200μL无菌滤液，以单独接种病原菌为对照，每个处理重复3次，置于25℃恒温培养箱中暗箱培养，待对照组长满平板后，计算抑菌率。抑菌率计算公式为：抑菌率(％)＝(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/(对照菌落半径-4)×100％。
5)结果
通过分析，将抑菌率最高的一株菌株命名为YZ-151，其中，菌株YZ-151对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)的抑菌率均达到78％以上，结果如表1和图1所示；菌株YZ-151的无菌滤液对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)和刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)的平均抑菌率达52.84％，结果如表2所示。
表1菌株YZ-151对刺五加黑斑病菌和灰霉病菌的抑制情况
| 病原菌 | 细极链格孢A.tenuissima | 灰葡萄孢B.cinerea |
| 抑菌率％ | 78.86±1.41 | 79.57±5.61 |
表2菌株YZ-151的无菌滤液对刺五加黑斑病菌和灰霉病菌的抑制情况
| 病原菌 | 细极链格孢A.tenuissima | 灰葡萄孢B.cinerea |
| 抑菌率％ | 48.06％±1.00 | 57.62％±5.61 |
二、鉴定
1)形态学特性以及生理生化特征鉴定：参照资料《微生物学试验手册》、《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》，将菌株YZ-151划线接种于NA培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养2-3天，观察单菌落形态特征，并进行革兰氏染色和芽孢染色观察，采用细菌微量生化反应管对碳水化合物代谢试验、酶类试验、柠檬酸盐利用试验及耐盐性等生理生化指标进行测定。
2)16S rDNA鉴定：将菌株YZ-151的单菌落接种在NB培养液中，于32℃、180r/min培养24h，离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒对细菌DNA进行提取。16S rDNA选择通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)，PCR反应体系：基因组DNA 2μL、dNTP(10mmoL/L)2μL、10×Buffer 5μL、通用引物27F 2μL、通用引物1492R2μL、Taq酶(2.5U/μL)2μL、ddH2O 35μL。16S rDNA基因PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min；58℃30s；70℃90s，35个循环；72℃10min。上述扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司武汉分公司进行测序。
3)结果
3-1)形态学特性：在NA培养基上，菌株YZ-151菌落成乳白色，菌落表面湿润，不透明(图2)，革兰氏染色呈杆状，有芽孢。
3-2)生理生化特征：菌株YZ-151菌株能够利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不能利用木糖、L-阿拉伯糖，V-P测试呈阴性，OF试验呈阳性，硫化氢试验结果为阴，明胶水解、淀粉水解均为阳性，精氨酸双水解酶均呈阴性，能够利用柠檬酸盐，酒石酸盐呈阴性，酪蛋白水解、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原均为阳性，最高耐盐浓度为7％。
3-3)分子鉴定：将菌株YZ-151的16S rDNA基因PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司武汉分公司进行测序，获得有效序列长度为1434bp(SEQ ID NO：1)，GenBank登录号为OK474770。在NCBI通过BLAST序列比对，并采用MEGAX64软件，通过N-J法构建系统发育树，结果图3显示，菌株YZ-151的16S rDNA有效序列与阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)聚为一支，且亲缘关系最为接近，置信度较高。结合形态学、生理生化特征、16S rDNA鉴定综合分析，鉴定菌株YZ-151为阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)。
三、保藏
本发明所筛选的一株阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151，已于2023年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:62894。
实施例2阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法
1、菌株活化：将保存的菌株YZ-151接种于含有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基(NB)的培养瓶(装液量50mL/100mL)中，32℃、180r/min震荡培养12h；
2、发酵种子液制备：将活化的菌株YZ-151调节OD600至1.0左右，以接种量100μL接种于牛肉膏蛋白胨肉汤培养基(NB)中，32℃、180r/min培养12h，获取菌株YZ-151发酵种子液；
3、发酵的单因素条件优化，主要包括发酵培养基优化、发酵条件优化和正交条件优化；具体操作步骤如下：
1)最佳发酵培养基优化；
①最适发酵碳源筛选：以牛肉膏蛋白胨酵母膏培养基发酵液(BPY)为基础发酵培养基，将其中的葡萄糖分别等量替换为蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉和乳糖，其他成分不变，以葡萄糖为对照。以1％接种量(装液量50mL/100mL)将细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea分别接种于含有菌株YZ-151发酵种子液的不同牛肉膏蛋白胨酵母膏培养基发酵液(BPY)中，34℃、180r/min恒温震荡培养48h。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵碳源。
不同碳源对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图4所示，通过单因素试验检测6种不同碳源培养基在发酵过程中对菌株YZ-151产生抑菌活性物质的影响。结果表明，在选用6种不同碳源培养基上生长的菌株YZ-151，以乳糖为碳源时，其对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的生长没有起到良好的拮抗效果，在其余5种碳源培养基中均能生长良好，且对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌效果表现出显著差异，其中以玉米粉为碳源时，其对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑制效果是几种碳源中表现最为突出的，该菌株YZ-151的发酵滤液对细极链格孢A.tenuissima的抑菌率为70.33％、对灰葡萄孢B.cinerea的抑菌率为75.41％，比对照组分别提高7.22％和7.52％；以蔗糖为碳源时对刺五加2种致病菌的抑制率最低。故选用玉米粉为最佳发酵碳源。
②最适发酵氮源筛选：以筛选的最佳碳源为基础，将其中的牛肉膏分别等量替换为鱼粉、黄豆粉、氯化铵、硫酸铵和麦芽浸粉，其他成分不变，以牛肉膏为对照。以1％接种量(装液量50mL/100mL)将细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea分别接种于含有菌株YZ-151发酵种子液的不同牛肉膏蛋白胨酵母膏培养基发酵液(BPY)中，34℃、180r/min恒温震荡培养48h。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵氮源。
不同氮源对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图5所示，以玉米粉为基础碳源，在6种不同氮源培养基上生长的菌株YZ-151均可产生抑菌活性物质，且对刺五加2种致病菌的抑菌效果表现出显著差异(p＜0.05)，其中以对照(牛肉膏)为氮源时，该菌株YZ-151的发酵滤液对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌率最高，分别为70.12％和75.20％，显著高于硫酸铵、氯化铵、鱼粉、麦芽浸粉和黄豆粉(p＜0.05)。故选用牛肉膏为最佳发酵氮源。
2)最佳发酵条件优化；
①最适发酵pH筛选：根据最适发酵碳源和最适发酵氮源筛选结果，利用1mol/LNaOH溶液和1mol/L HCL溶液调节pH至4.0～9.0。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵pH。
不同pH对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图6所示，以玉米粉为基础碳源，以牛肉膏为基础氮源时，对菌株YZ-151进行最佳pH筛选。结果表明，pH值过高或过低均会降低菌株YZ-151的发酵滤液的抑菌活性，针对细极链格孢A.tenuissima的抑菌效果，pH5.0～pH8.0时抑菌活性显著高于pH 4.0和pH 9.0(p＜0.05)，其中pH为6.0时菌株YZ-151对细极链格孢A.tenuissima的抑菌效果较好，抑菌率为75.00％；对于灰葡萄孢B.cinerea的抑菌效果，pH为6.0时菌株YZ-151对灰葡萄孢B.cinerea的抑菌效果最好，抑菌率为76.63％，显著高于pH4.0、pH 5.0、pH 7.0、pH 9.0(p＜0.05)。总体来看，在pH为6.0时，菌株YZ-151对刺五加2种致病菌的平均抑菌效果最好，平均抑菌率达75.82％。故选择pH为6.0作为最佳发酵pH值。
②最适发酵温度筛选：根据最适发酵pH筛选结果，将温度梯度设置为25℃～40℃。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵温度。
不同温度对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图7所示，菌株YZ-151抑菌活性受温度的影响呈先上升后下降趋势，菌株YZ-151在25℃～40℃时生长良好，且能够产生较高的抑菌活性物质。针对细极链格孢A.tenuissima的抑菌效果，温度为34℃时，抑菌效果较好，抑菌率为76.22％，显著高于其它温度(p＜0.05)；对于灰葡萄孢B.cinerea的抑菌效果，各温度之间差异不显著，其中34℃时对灰葡萄孢B.cinerea的抑菌率较高为80.79％。总体来看，在34℃时菌株YZ-151对刺五加2株致病菌的平均拮抗效果较好，抑菌率为78.51％。故选择温度34℃为最佳发酵温度。
③最适发酵时间筛选：根据最适发酵温度筛选结果，将时间梯度设置为1d～6d。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵时间。
不同时间对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图8所示，通过发酵7个时间段对菌株YZ-151进行培养，菌株YZ-151的抑菌活性随时间的增加呈先升再降的趋势。菌株YZ-151在发酵2d、2.5d、3d时对细极链格孢A.tenuissima的抑菌活性无显著差异，其中在发酵2d时抑菌效果较好，抑菌率为75％，显著高于1d、4d、5d、6d(p＜0.05)；菌株YZ-151发酵2d～6d时，对灰葡萄孢B.cinerea的抑菌效果无显著差异，而显著高于发酵1d(p＜0.05)，其中发酵2d时，对灰葡萄孢B.cinerea的抑菌效果最好，抑菌率最高为74.59％。总体来看，发酵2d时菌株YZ-151对刺五加2种致病菌的平均抑菌效果较好，抑菌率为74.8％。故选择发酵2d作为最佳发酵时间。
④最适发酵接种量筛选：根据最适发酵时间筛选结果，将接种量梯度设置为1％～10％。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵接种量。
不同接种量对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图9所示，菌株YZ-151在各处理条件下对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌活性无显著差异，其中接种量7％时对细极链格孢A.tenuissima的拮抗作用最好，抑菌率达72.56％；对灰葡萄B.cinerea的抑制作用中，在接种量10％时，对灰葡萄孢B.cinerea拮抗效果较好，其次为7％和9％。总体来看，在接种量7％时，菌株YZ-151对刺五加2种致病菌的平均抑制效果较好，抑菌率为73.93％。故选择接种量为7％作为最佳发酵接种量。
⑤最适发酵装液量筛选：根据最适发酵接种量筛选结果，将装液量梯度设置为30mL/250mL～200ml/250ml；培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵装液量。
不同装液量对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图10所示，菌株YZ-151的抑菌活性随装液量上升呈先升后降趋势。在装液量为80mL/250mL～100mL/250mL时，对细极链格孢A.tenuissima的拮抗效果较好，显著高于装液量30mL/250mL、50mL/250mL、200mL/250mL(p＜0.05)，其中装液量为80mL/250mL时其对细极链格孢A.tenuissima的拮抗作用最好，抑制率达76.02％；在装液量为80mL/250mL～200mL/250mL时，对灰葡萄孢B.cinerea的拮抗效果无显著差异，而显著高于装液量30mL/250mL和50mL/250mL(p＜0.05)，其中装液量为80mL/250mL时其对灰葡萄孢B.cinerea的抑制效果最好，抑制率达81.30％。总体来看，当装液量为80mL/250mL时，其对刺五加2种致病菌的拮抗效果较好，平均抑菌率达78.66％。故选择装液量80mL/250mL作为最佳发酵装液量。
⑥最适发酵转速筛选：根据最适发酵装液量筛选结果，将转速设置为110r/min～200r/min。培养结束后以牛津杯法测定抑菌活性，确定最佳发酵转速。
不同转速对菌株YZ-151的抑菌活性影响如图11所示，菌株YZ-151在5种转速处理下，对细极链格孢A.tenuissima的抑制效果无显著差异，其中在200r/min时，对细极链格孢A.tenuissima的抑制效果最好，抑菌率为75％；在200r/min处理下，菌株YZ-151对灰葡萄孢B.cinerea的抑制效果较好，抑菌率为81.1％，显著高于其他处理(p＜0.05)。总体来看，当转速为200r/min时，菌株YZ-151对刺五加2种致病菌的拮抗效果较好，平抑菌率为78.05％。故选择200r/min作为最佳发酵转速。
3)最佳发酵条件的正交优化；
以单因素筛选出的最佳发酵碳源、氮源、pH、温度、时间、接种量、装液量和转速，选择温度(30℃、34℃、37℃)、时间(1d、2d、2.5d)、装液量(50mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL)、转速(150r/min、180r/min、200r/min)这4种因素(表1)，采用DPS 9.50设计正交表L9(34)，并进行正交试验。
表1菌株YZ-151发酵因素与水平
最佳发酵条件的正交优化结果见表2。由表2可知，菌株YZ-151通过正交优化分析，对细极链格孢A.tenuissima的拮抗作用影响的大小依次为A＞B＞C＞D，即温度对细极链格孢A.tenuissima的抑菌活性影响最大；且最佳条件组合为A1B1C2D3，即温度为30℃、时间为1d、装液量为80mL/250mL、转速为200r/min。
最佳发酵条件的正交优化结果见表2。由表2可知，株YZ-151通过正交优化分析，对灰葡萄孢B.cinerea抑制作用影响的大小依次为D＞A＞B＞C，即转速对灰葡萄孢B.cinerea的抑制活性影响最大，且最佳组合条件为A1B2C2D3，即温度为30℃、时间为2d、装液量为80mL/250mL、转速为200r/min。
表2菌株YZ-151正交优化结果
4、阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备
根据上述获得的最佳发酵条件对菌株YZ-151进行发酵培养，首先将保存的菌株YZ-151接种于含有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基(NB)的培养瓶(装液量50mL/100mL)中，32℃、180r/min震荡培养12h进行活化；将活化的菌株YZ-151调节OD600至1.0左右，以接种量100μL接种于牛肉膏蛋白胨肉汤培养基(NB)中，32℃、180r/min培养12h，获取菌株YZ-151发酵种子液；配制最佳发酵培养基(玉米粉5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L)，设置最佳发酵pH、最佳发酵温度、最佳发酵接种量最佳发酵装液量、最佳发酵转速以及最佳发酵时间后，将菌株YZ-151发酵种子液接种于最佳发酵培养基中开始发酵，完成阿氏普里斯特氏菌YZ-151发酵制剂的制备，将发酵1d所获得的阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂命名为YZ-151BX，将发酵2d所获得的阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂命名为YZ-151BH。
经抑菌试验验证(表3)可知，所获得的阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂YZ-151BX对细极链格孢A.tenuissima的抑菌率达79.47％，较BPY基础发酵液(以牛肉膏蛋白胨酵母膏培养基发酵液(BPY)为基础发酵液将菌株YZ-151于34℃、180r/min恒温震荡培养48h后，去除菌体后的无菌滤液的抑菌率68.5％)相比，抑菌率提高10.97％(图12)。
经抑菌试验验证(表4)可知，所获得的阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂YZ-151BH对灰葡萄孢B.cinerea的抑菌率达80.69％，较BPY基础发酵液(以牛肉膏蛋白胨酵母膏培养基发酵液(BPY)为基础发酵液将菌株YZ-151于34℃、180r/min恒温震荡培养48h后，去除菌体后的无菌滤液的抑菌率76.83％)相比，抑菌率提高3.86％(图13)。
表3菌株YZ-151优化后的效果
| 病原菌 | YZ-151BX抑菌率％ | BPY基础发酵液抑菌率％ |
| 细极链格孢 | 79.47±0.35a | 68.50±3.01b |
表4菌株YZ-151优化后的效果
| 病原菌 | YZ-151BH抑菌率％ | BPY基础发酵液抑菌率％ |
| 灰葡萄孢 | 80.69±0.35a | 76.83±1.22b |
本发明通过单因素筛选与正交试验对菌株YZ-151进行发酵条件优化，菌株YZ-151经最优条件发酵培养后对细极链格孢A.tenuissima和灰葡萄孢B.cinerea的抑菌率分别为79.47％和80.69％，较BPY基础发酵液抑菌率分别提高10.97％和3.86％。综上，菌株YZ-151经过培养基优化和发酵条件优化后可以显著提高对刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)和灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)的抑制活性。
实施例3阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂YZ-151BX对刺五加黑斑病离体叶片的防控试验
选取完整、健康的刺五加叶片，连同叶柄剪下，先将刺五加叶片用75％酒精消毒15s，无菌水冲洗数次，置于超净工作台内晾干，备用。
刺五加黑斑病：将1000亿/g枯草芽孢杆菌1000倍液、10％苯醚甲环唑800倍液、YZ-151BX发酵原液涂抹至叶片上，之后接种刺五加黑斑病病原菌(细极链格孢A.tenuissima)菌饼(直径8mm)，将带有菌丝的一面与叶片贴合，每个处理2个分支叶片，每个叶片接种1点，对照叶片先涂抹无菌水后接种菌饼，再用无菌湿棉球裹住叶柄后放入带有单层灭菌滤纸的培养皿(Φ＝120mm)中。每个处理10次重复。于25℃，相对湿度90％～100％的暗箱条件下放置，5天后采用根系扫描仪测量病斑面积与叶片面积，并参照刺五加黑斑病分级标准：0级：叶片完整，无病斑：1级：有少量病斑(占叶片面积的1％～5％)；3级：病斑形成中等数量(占叶片面积的6％～10％)；5级：病斑数量较多(占叶片面积的11％～20％)；7级：病斑很多且较大(占叶片面积的21％～50％)；9级：病斑很多且较大(占叶片面积的51％～100％)。
病情指数＝{∑[(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×9)]}×100。
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂YZ-151BX对刺五加黑斑病的防病效果如表5所示，各药剂处理后刺五加黑斑病病情指数均低于CK组(清水对照)，病情指数在14.07-52.59之间，其中发酵制剂YZ-151BX的病情指数显著低于枯草芽孢杆菌和苯醚甲环唑(p＜0.05)。各药剂处理组的防治效果在47.89％-73.24％之间，其中发酵制剂YZ-151BX的防治效果为73.24％，显著高于枯草芽孢杆菌和苯醚甲环唑的防效(p＜0.05)。
表5发酵制剂YZ-151BX对刺五加黑斑病的防控效果
| 处理 | 病情指数 | 防治效果％ |
| YZ-151BX | 14.07±2.57c | 73.24±4.88a |
| 枯草芽孢杆菌 | 27.41±2.57b | 47.89±4.88b |
| 苯醚甲环唑 | 22.96±2.57b | 56.34±4.88b |
| CK | 52.59±5.13a | — |
实施例4阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂YZ-151BH对刺五加灰霉病离体叶片的防控试验
选取完整、健康的刺五加叶片，连同叶柄剪下，先将刺五加叶片用75％酒精消毒15s，无菌水冲洗数次，置于超净工作台内晾干，备用。
将1000亿/g枯草芽孢杆菌1000倍液、50％腐霉利可湿性粉剂1000倍液、YZ-151BH发酵原液涂抹至叶片上，之后接种刺五加灰霉病病原菌(灰葡萄孢B.cinerea)菌饼(直径8mm)将带有菌丝的一面与叶片贴合，每个处理3个分支叶片，每个叶片接种1点，对照叶片先涂抹无菌水后接种菌饼，再用无菌湿棉球裹住叶柄后放入带有单层灭菌滤纸的培养皿(Φ＝120mm)中。每个处理10次重复。于25℃，相对湿度90％～100％的暗箱条件下放置，5天后采用根系扫描仪测量病斑面积和叶片面积，并参照刺五加灰霉病分级标准：0级：叶片完整，无病斑：1级：有少量病斑(占叶片面积的1％～5％)；3级：病斑形成中等数量(占叶片面积的6％～10％)；5级：病斑数量较多(占叶片面积的11％～20％)；7级：病斑很多且较大(占叶片面积的21％～50％)；9级：病斑很多且较大(占叶片面积的51％～100％)。
病情指数＝{∑[(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×9)]}×100。
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂YZ-151BH对刺五加黑斑病的防病效果如表6所示，各药剂处理后刺五加灰霉病病情指数均低于CK组(清水对照)，病情指数在14.07-49.63之间。各药剂处理组的防治效果在65.67％-71.64％之间，其中发酵制剂YZ-151BH的防治效果为71.64％，与枯草芽孢杆菌、腐霉利防效相当(p＞0.05)。
表6发酵制剂YZ-151BH对刺五加灰霉病的防控效果
| 处理 | 病情指数 | 防治效果％ |
| YZ-151BH | 14.07±2.57b | 71.64±5.17a |
| 1000亿/g枯草芽孢杆菌 | 14.07±2.57b | 71.64±5.17a |
| 50％腐霉利可湿性粉剂 | 17.04±2.57b | 65.67±5.17a |
| CK(清水对照) | 49.63±5.13a | — |
综上，本发明所制备的阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂对由细极链格孢A.tenuissima引起的刺五加黑斑病和由灰葡萄B.cinerea引起的刺五加灰霉病具有良好的防治效果，具有开发作为生防菌剂的潜力。
本发明公开了一种阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151发酵制剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
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Claims (10)
1.一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151进行活化处理；
(2)将活化后的阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151制成发酵种子液；
(3)将发酵种子液接种于发酵培养基中开始发酵，调节发酵pH4.0～9.0、发酵温度25℃～40℃、发酵接种量1％～10％、发酵装液量30mL/250mL～200ml/250ml、发酵转速100r/min～200r/min和发酵时间1d～6d，获得阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂。
2.根据权利要求1所述的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)YZ-151已于2023年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCCNo:62894。
3.根据权利要求1所述的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作步骤如下：
将阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151接种于含有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基的培养瓶中，装液量50mL/100mL，32℃、180r/min震荡培养12h进行活化。
4.根据权利要求1所述的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作步骤如下：
将活化后的阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151调节OD600至1.0左右，以接种量100μL接种于牛肉膏蛋白胨肉汤培养基中，32℃、180r/min培养12h，获得发酵种子液。
5.根据权利要求1所述的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵培养基包括：玉米粉5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L和氯化钠5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵pH为6.0，所述发酵温度为30℃，所述发酵接种量为7％，所述发酵装液量为80ml/250ml，所述发酵转速为200r/min，所述发酵时间为1d～2d。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的制备方法制备获得的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂。
8.如权利要求7所述的一种阿氏普里斯特氏菌(Priestiaaryabhattai)YZ-151发酵制剂在制备植物病原菌拮抗剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌拮抗剂为刺五加病原菌拮抗剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括：细极链格孢(A.tenuissima)和灰葡萄孢(B.cinerea)。
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Also Published As
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