CN111733120A

CN111733120A - 一株阿氏芽孢杆菌及其在西洋参病害防治中的应用

Info

Publication number: CN111733120A
Application number: CN202010860097.9A
Authority: CN
Inventors: 于馨; 陈国忠; 张兴晓; 冯志彬; 姜琳琳; 朱洪伟; 张建龙
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Shandong Jinzhuji Pharmaceuticals Co ltd; Shandong Yucheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN111733120B

Abstract

本发明公开了一株阿氏芽孢杆菌JNM8102，属于微生物利用与开发领域。该菌株已于2019年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），保藏编号为：CGMCC No.18498；所述阿氏芽孢杆菌JNM8102可应用于西洋参病虫害防治中，具有遗传稳定性强，与环境兼容性好、防病持效期长等优点。

Description

一株阿氏芽孢杆菌及其在西洋参病害防治中的应用

技术领域

本发明属于植物病虫害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，特别涉及一株阿氏芽孢杆菌JNM8102及其在西洋参防治中的应用。

背景技术

西洋参（学名：Panax quinquefolius）是五加科人参属多年生草木植物，别名花旗参、洋参、西洋人参、American ginseng，原产于加拿大的大魁北克与美国的威斯康辛州，我国北京怀柔、山东文登与吉林长白山等地皆有种植。西洋参具有滋阴补气，宁神益智及清热生津，降火消暑的双重功效，应用广泛，市场供不应求。西洋参种植投资大，整个周期长达4~5年，种植过程中有多种病虫害威胁植株影响产量，病虫害严重时造成减产甚至绝产。研究发现，对西洋参威胁最大的是根腐病，主要由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌（Fusarium solani）等引起，该菌同时也是香蕉、西瓜、黄瓜等作物的病原菌。

随着绿色农业理念的发展，国家对农作物农药残留的限量越发严格，西洋参种植管理过程中农药使用种类和范围受到极大限制，对镰刀菌最有效的含五氯硝基苯类农药已被禁用，在发生根腐病的时候缺乏特效药，给种植户带来重大经济损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种阿氏芽孢杆菌JNM8102，通过利用微生物的方法达到防治西洋参病害的目的。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一株阿氏芽孢杆菌JNM8102，该菌株已于2019年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），保藏编号为：CGMCC No.18498，保藏地址为中国北京。

进一步地，所述菌株16S rRNA基因序列如SEQ.NO.1。

进一步地，所述阿氏芽孢杆菌JNM8102在西洋参病害防治中的应用。

一种生物防治制剂，包括所述的一种阿氏芽孢杆菌JNM8102。

一种生物防制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱30～37℃培养18～24h，待斜面长满菌落用于转接液体种子；

（2）液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，八层纱布封口，温度30~37℃，160～220r/min摇床振荡培养14～28h，长出大量菌体细胞，得液体种子；

（3）液体发酵：按体积比5～20%接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速300～700r/min，溶氧控制20%~50%，pH7.0～7.5，温度30～37℃，通气培养24～48h，得到菌株JNM8102的发酵液。

进一步地，所述固体斜面培养基的成分及其浓度为：葡萄糖1~2 g/L，酵母浸粉 3~5 g/L，蛋白胨 5~10 g/L，NaCl 3~5 g/L，琼脂 15~20 g/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

进一步地，所述液体种子培养基的成分及其浓度为：葡萄糖 5~10g/L，酵母浸粉 3~5 g/L，蛋白胨 5~10 g/L，NaCl 3~5 g/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

进一步地，所述发酵培养基的成分及其浓度为：葡萄糖10~20g/L，蛋白胨5~10 g/L，酵母浸粉1~5 g/L，MgSO₄ 0.1~0.5 g/L，KH₂PO₄ 0.1~1 g/L，硫酸铵2~5 g/L，CoCl₂ 50~100mg/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述的一株阿氏芽孢杆菌JNM8102，具有生长速度快、发酵密度高，作用谱广防治多种西洋参病害、遗传稳定性强，与环境兼容性好、防病持效期长等优点，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为菌株JNM8102显微形态；

图2为菌株JNM8102基于16S rRNA序列的系统发育树；

图3为菌株JNM8102促进西洋参出苗的田间试验结果，其中左图为未经过菌株JNM8102发酵液处理的西洋参种子出苗情况，右图为经过菌株JNM8102发酵液处理的西洋参种子出苗情况；

图4为菌株JNM8102促进西洋参生长的田间试验结果，其中左图为未经过菌株JNM8102发酵液处理的西洋参苗生长情况，右图为经过菌株JNM8102发酵液处理后的西洋参苗生长情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

一、制备菌株JNM8102的步骤为：

（1）分离；

本发明所述阿氏芽孢杆菌JNM8102，采用稀释涂布法分离获得的。具体方法为：

1、选取用餐厨垃圾养殖7天的黑水虻（Hermetia illucens）幼虫20条，在超净台上用生理盐水冲洗黑水虻幼虫体表；

2、将冲洗后的黑水虻幼虫置于75%乙醇溶液中浸泡1min，转入0.1%升汞浸泡2min；

3、将黑水虻幼虫取出，并用无菌水冲洗干净黑水虻幼虫身上残留的药剂，在解剖镜下用解剖针取出肠道；

4、将取出的黑水虻置于无菌研钵里加入5mL无菌生理盐水进行研磨，制成菌悬液，梯度稀释后涂布于LB培养基平板中，30℃恒温培养4d，将培养基上的不同形态的菌落在LB培养基平板中进行划线，纯化获得的菌株，并分别编号保存。

上述LB培养基的组分及其相应浓度为：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

（2）筛选；

采用对峙培养法，用直径5mm的打孔器将尖孢镰刀菌接种到PDA培养基的中心点，在菌块离中心2 cm处对称两侧接种10μL拮抗菌液，倒置，在28℃恒温培养5d，以不接种拮抗菌液的培养皿作对照，根据抑菌圈大小确定拮抗效果，筛选抑菌圈最大的菌株进行培养并保藏。

上述PDA培养基的组分及其相应浓度为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

通过大量筛选工作得到一株能够高效拮抗尖孢镰刀菌的菌株JNM8102。

二、菌株JNM8102的鉴定，鉴定主要项目为：菌种特性、分子鉴定及其稳定性。

（1）菌株JNM8102的特性鉴定。

菌株JNM8102在LB培养基上30培养2d后菌落近圆形，表面光滑湿润凸起，边缘不规则，乳白色或淡黄色，不产色素；通过镜检观察（图1），菌体呈杆状，有芽孢，能运动，革兰氏阳性；生理生化指标见表1。

（2）菌株JNM8102的分子鉴定。

经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rRNA 基因序列长度为1361bp，在GenBank上进行BLAST比对，得出该菌株与Bacillus aryabhattai（EF114313）碱基相似性达99%，结合形态学及生理生化指标，将JNM8102菌株鉴定为Bacillus aryabhattai。16S rRNA序列信息见SEQ.NO.1。基于16S rRNA序列的系统发育树见图2。

SEQ.NO.1

cgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagt

（3）菌株JNM8102遗传稳定性鉴定。

采用划线法将Bacillus aryabhattai JNM8102在固体斜面培养基上连续传代50次，测定菌体形态、生长速度及抗尖孢镰刀菌的能力，与原代菌株无明显差异，遗传稳定性良好。

三、菌种JNM8102的保藏。

本项发明所述的Bacillus aryabhattai JNM8102，已于2019年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：阿氏芽孢杆菌（Bacillusaryabhattai），保藏编号：CGMCC No. 18498，保藏单位地址：中国北京。

四、阿氏芽孢杆菌JNM8102发酵过程。

（1）菌株活化；挑取菌种划线接种至固体斜面培养基：葡萄糖 2 g/L，酵母浸粉 5g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min，于恒温培养箱30℃培养24h，待斜面长出大量菌体细胞用于转接液体种子。

（2）液体种子制备；挑取活化菌株接种于装有种子培养基中，纱布封口，于30℃，220r/min摇床振荡培养28h，长出大量菌体，得液体种子。其中，种子培养基中的组分及其浓度：葡萄糖 10g/L，酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L， NaCl 5 g/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

（3）液体发酵；按体积比5%接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制30%，pH 7.0，温度30℃，通气培养48h。其中，发酵培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 1 g/L，硫酸铵5 g/L，CoCl250mg/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

五、菌株JNM8102发酵液抗病试验。

通过管碟法进行Bacillus aryabhattai JNM8102发酵液抗植物病原菌能力的检验，结果如表2所示。Bacillus aryabhattai JNM8102发酵液对尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、玉米弯孢菌（Curvularia lunata）、灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）、小麦赤霉菌（Gibberella saubinetii）、黑曲霉（Aspergillusniger）等植物病原菌的生长均具有显著的拮抗作用。其中对尖孢镰刀菌的抑制效果最为显著，10μL发酵液的平均抑制直径达到3cm以上；对其它植物病原菌也显现了良好的抑制作用，平均抑制直径都在2.0 cm以上，具有开发利用的潜力。

六、菌株JNM8102防治西洋参根腐病的田间试验效果。

试验一

选取一块三年生西洋参大田，划分成同等大小的三块地，第一块地为对照组，用茄病镰刀菌孢子液灌根，不施用任何菌剂；第二块地为处理组1，先用菌株JNM8102的发酵液灌根，然后再用茄病镰刀菌孢子液灌根；第三块地为处理组2，先用茄病镰刀菌孢子液灌根，然后用菌株JNM8102的发酵液灌根，比较西洋参根腐病的发病率，结果如表3所示。根据表3可以发现施用菌株JNM8102发酵液的地块西洋参根腐病发病率显著低于未施用菌液的对照组。

试验二

选取一块面积约400平方米从未种过西洋参的农田，划分成同等大小的两块地，第一块地为处理组，用菌株JNM8102发酵液浸种15分钟；第二块地为对照组，种子不处理，结果如表4所示。3月底采用点播方法播种，当年6月底统计出苗率，如图3所示。结果表明用菌株JNM8102发酵液浸种的处理组西洋参出苗率显著高于未用菌液浸种的对照组，参苗更齐、更高、根系更发达，如图4所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一株阿氏芽孢杆菌及其在西洋参病害防治中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1361

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggcaacctgc ctgtaagact gggataactt 60

cgggaaaccg aagctaatac cggataggat cttctccttc atgggagatg attgaaagat 120

ggtttcggct atcacttaca gatgggcccg cggtgcatta gctagttggt ggggtaacgg 180

ctcaccaagg caacgatgca tagccgacct gagaggatga tcagccacac tgggactgag 240

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 300

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gaagaacaag tacgagagta actgctcgta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 420

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg 480

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ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag aaaagcggaa ttccacgtgt 600

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taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 720

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cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 840

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 900

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gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca tttagttggg cactctaagg tgactgccgg 1080

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1140

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ataaaaccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc 1260

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1320

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtggag t 1361

Claims

1.一株阿氏芽孢杆菌JNM8102，其特征在于，该菌株已于2019年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillusaryabhattai），保藏编号为：CGMCC No.18498，保藏地址为中国北京。

2.根据权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌JNM8102，其特征在于，所述菌株16S rRNA基因序列如SEQ.NO.1所示。

3.权利要求1所述阿氏芽孢杆菌JNM8102在西洋参病害防治中的应用。

4.一种生物防治制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌JNM8102。

5.一种生物防治制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，八层纱布封口，温度为30~37℃，160～220r/min的摇床振荡培养14～28h，长出大量菌体细胞，得液体种子；

（3）液体发酵：按体积比5～20%接种量向发酵培养基接入步骤（2）制备的液体种子，转速300～700r/min，溶氧控制20%~50%，pH7.0～7.5，温度30～37℃，通气培养24～48h，得到菌株JNM8102的发酵液。

6.根据权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述固体斜面培养基的成分及其浓度为：葡萄糖1~2 g/L，酵母浸粉 3~5 g/L，蛋白胨 5~10 g/L，NaCl 3~5 g/L，琼脂 15~20 g/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

7.根据权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述液体种子培养基的成分及其浓度为：葡萄糖 5~10g/L，酵母浸粉 3~5 g/L，蛋白胨 5~10 g/L， NaCl 3~5 g/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

8.根据权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分及其浓度为：葡萄糖10~20g/L，蛋白胨5~10 g/L，酵母浸粉1~5 g/L，MgSO₄ 0.1~0.5 g/L，KH₂PO₄ 0.1~1 g/L，硫酸铵2~5 g/L，CoCl₂ 50~100mg/L，pH 7.0~7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。