CN107603907A - 一株阿氏芽孢杆菌gh‑9及其应用 - Google Patents
一株阿氏芽孢杆菌gh‑9及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株阿氏芽孢杆菌GH‑9及其应用，所述阿氏芽孢杆菌GH‑9已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.14519，保藏日期为2017年08月10日。本发明的优点在于:阿氏芽孢杆菌GH‑9能够降解高氨氮同时又降解总氮，没有亚硝态氮和硝态氮积累，同步进行硝化与反硝化。试验证明，由阿氏芽孢杆菌GH‑9制备的生物菌降解剂可以降解500mg/L浓度的氨氮，同时使氨氮降解效率达到77％，总氮降解效率可达到61％。
Description
技术领域
本发明涉及一株细菌及其应用，具体涉及一株阿氏芽孢杆菌GH-9及其应用。
背景技术
水体中氮素主要包括有机氮和无机氮，有机氮包括蛋白质、氨基酸和有机胺等，无机氮包括氨态氮、亚硝态氮和硝态氮，这些统称为总氮。氮的形态不同，其在水体中的危害性也是不一样的，如蛋白质在分解过程中会产生大量的氨氮，而氨氮又会对水体造成危害，污染水体，产生臭气。因此，水中的总氮含量是衡量水质的重要指标之一，总氮的测定有助于评价水体被污染状况以及水体自净程度。总氮还是反应水体富营养化的主要指标，当水体氮磷含量超标时，微生物大量繁殖，藻类及浮游生物生长旺盛，水体溶解氧下降，就会出现富营养化状态。据了解，《杂环类农药工业水污染物排放标准》规定，在环境承载能力开始减弱，或环境容量较小、生态环境脆弱，容易发生严重环境污染问题而需要采取特别保护措施的地区，现有企业和新建企业要执行总氮特别排放限值30mg/L。
传统理论认为，除氨工艺包括硝化反应和反硝化反应两个阶段，首先NH4 +_N在微生物作用下氧化为NO2 -_N(亚硝化作用)，再进一步氧化为NO3 -_N(硝化作用)，然后NO3 -_N经微生物作用还原为N2(反硝化作用)，即将氨氮经过硝化作用和反硝化作用最终生成氮气排出。而一般情况下，细菌经过硝化反硝化作用产生的气体是N2，而真菌经过硝化反硝化作用产生的气体是N2O，因此，从环境保护等方面考虑，采用细菌对氨氮进行降解更为有利。但是目前，筛选出的高效氨氮降解细菌只能降解低浓度氨氮，而降解高浓度氨氮并不理想。例如CN105255754A公开了一株具有降解氨氮及总氮的细菌，细菌名称为Pseudomonassp.ZXY-1，该菌株只对农田废水中的低浓度氨氮及总氮有一定的降解作用，却难以缓解因高浓度氨态氮和总氮引起的污水恶臭及臭气的污染。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，本发明人经过筛选，选育出一株细菌，该细菌为一株能够降解高氨氮同时又降解总氮的阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattaiGH-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：中国·北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.14519，保藏日期为2017年08月10日。
进一步，所述阿氏芽孢杆菌GH-9的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一株阿氏芽孢杆菌GH-9在治理高氨氮的污水、渗滤液或臭气污染中的应用。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种生物菌降解剂，包含阿氏芽孢杆菌GH-9。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种生物菌降解剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将阿氏芽孢杆菌GH-9接种到筛选培养基中进行发酵培养，制得生物菌降解剂母液；
(2)然后将生物菌降解剂母液按照0.5～1％的比例加入到发酵培养基中进行发酵培养，制得生物菌降解剂。
进一步，所述发酵条件为控制温度25～35℃，pH 6.5～8.5，转速150～200r/min，发酵时间36～72小时。
进一步，所述筛选培养基由以下含量组分配制而成：红糖9.51～19.02g/L，柠檬酸钠4.09～8.17g/L，K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水；所述发酵培养基由以下含量组分配制而成：红糖9.51～19.02g/L，柠檬酸钠4.09～8.17g/L，K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水。
进一步，所述筛选培养基中的C/N比(培养基中碳元素与氮元素的质量之比)为9～11:1；所述发酵培养基中的C/N比为9～11:1，可达到高效率降解。
硫酸铵为培养基的唯一氮源，红糖和柠檬酸钠均为培养基的碳源，进一步，所述筛选培养基中的红糖和柠檬酸钠的C元素添加比例为3～5:1时，所述发酵培养基中的红糖和柠檬酸钠的C元素添加比例为3～5:1时，氨氮降解效果最佳，红糖和柠檬酸钠的结合在提供碳源的基础上，对培养基的酸碱度还起一个调节作用，使得pH维持在7.0～8.0。
进一步，所述微量元素由以下含量组分配制而成：EDTA·2Na 5～57.1g/L，ZnSO4·7H2O 3.9g/L，CaCl2·2H2O 7g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L，其余为水。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种生物菌降解剂在治理高氨氮的污水、渗滤液或臭气污染中的应用，所述生物菌降解剂的接种量为0.5～1％。
本发明的优点在于:阿氏芽孢杆菌GH-9能够降解高氨氮同时又降解总氮，没有亚硝态氮和硝态氮积累，同步进行硝化与反硝化。试验证明，由阿氏芽孢杆菌GH-9制备的生物菌降解剂可以降解500mg/L浓度的氨氮，同时使氨氮降解效率达到77％，总氮降解效率可达到61％。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为阿氏芽孢杆菌GH-9革兰氏染色照片。
图2为阿氏芽孢杆菌GH-9在分离培养基上培养特征照片。
图3为阿氏芽孢杆菌GH-9显微镜形态照片。
图4为阿氏芽孢杆菌GH-9发育树。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
1、培养基
(1)富集培养基成分如下：红糖11.9～19.02g/L，K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水。
(2)分离培养基成分如下：红糖11.9～19.02g/L，K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，琼脂20g/L，其余为水。
(3)筛选培养基成分如下：红糖9.51～19.02g/L，柠檬酸钠4.09～8.17g/L，K2HPO414g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水。
(4)发酵培养基成分如下：红糖9.51～19.02g/L，柠檬酸钠4.09～8.17g/L，K2HPO414g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水。
其中，微量元素包括EDTA·2Na 5～57.1g/L，ZnSO4·7H2O 3.9g/L，CaCl2·2H2O7g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L，CuSO4·5H2O1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L，其余为水。
实施例1：阿氏芽孢杆菌GH-9的分离纯化与鉴定
取北京市南宫垃圾堆肥场垃圾渗滤液10ml，接种于装有100ml灭菌后的富集培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，在温度28℃、转速160r/min的条件下振荡培养，富集7天，每隔1天补充(NH4)2SO4，以淘汰不能利用NH4 +-N的微生物；然后将富集培养基中的菌液取1ml涂布在分离培养基平板上，于28℃培养箱倒置培养，挑取平板上长出的单菌落进行重复分离纯化，得到一株单一菌株，命名为GH-9。
该菌株GH-9具有下述形态特征：革兰氏染色反应为阳性，短杆状，能够产生芽孢，如图1；乳白色，在平板上凸起生长，边缘整齐，生长后期有淡黄色色素积累，菌体湿润光滑，正反颜色相同，较易挑出，如图2；呈短杆状，代谢快，繁殖快，体积比一般杆菌大，如图3。
挑取纯化的GH-9单菌落接种于筛选培养基中，在温度为30℃、摇床180r/min的条件下振荡培养24小时，然后以其菌液为模版做PCR扩增菌株的16S rDNA序列，进行测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，并将测序结果在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行序列比对，用MEGA 5.0做其发育树，见图4，发现GH-9的基因序列与已登记(阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai)的序列同源性最高，达到99％。因此，确定该菌株GH-9属于阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai，并将筛选得到的菌株命名为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai GH-9。
实施例2：生物菌降解剂的制备
(1)将阿氏芽孢杆菌GH-9接种到筛选培养基中进行发酵培养，控制温度32℃，pH7.0，转速200r/min，发酵时间48小时，制得生物菌降解剂母液；
(2)然后将生物菌降解剂母液按照1％的比例加入到发酵培养基中进行发酵培养，控制温度32℃，pH7.0，转速150r/min，发酵时间48小时，制得生物菌降解剂。
实施例3：阿氏芽孢杆菌GH-9的应用
将北京市南宫生物除臭塔的大塔取回的样品进行氨氮指标测定：大塔氨氮含量为514mg/L，总氮含量627mg/L，pH值5.42，出气口处氨气含量为2.31mg/m3。
将实施例2制备得生物菌降解剂按1％的接种量加入南宫大塔的污水中，32℃曝气环境下培养4d，大塔氨氮降解到124mg/L，氨氮降解率达75.9％，总氮降解效率达到61％，pH值6.53，出气口处氨气含量为0.79mg/m3，出气口氨气降解率达65.8％。
实施例4：阿氏芽孢杆菌GH-9的应用
将北京市南宫生物除臭塔的小塔取回的样品进行氨氮指标测定：小塔氨氮含量为479mg/L，总氮含量534mg/L，pH值6.14，出气口处氨气含量为3.06mg/m3。
将实施例2制备得生物菌降解剂按1％的接种量加入南宫小塔的污水中，32℃曝气环境下培养4d，小塔氨氮降解效率达到77％，总氮降解到213mg/L，总氮降解率达60.1％，pH值7.16，出气口处氨气含量为0.85mg/m3，出气口氨气降解率达72.2％。
实施例5：阿氏芽孢杆菌GH-9的应用
对北京市阿苏卫垃圾堆肥场菌液池取回的水样以及生物除臭塔采集的进气口和出气口处氨气进行指标测定：氨氮含量为523mg/L，总氮含量556mg/L，pH值7.65，生物除臭塔的进气口处氨气含量为11.15mg/m3，出气口处氨气含量为8.48mg/m3。
将实施例2制备得生物菌降解剂按1％的接种量加入阿苏卫菌液池的菌液中，30℃曝气环境下培养4d，氨氮降解到134mg/L，降解效率达到74.38％，总氮降解到236mg/L，降解效率达到57.55％，pH值7.16，进气口处氨气含量为10.13mg/m3，但出气口处氨气含量为3.02mg/m3，出气口氨气降解率达64.4％。
综上，阿氏芽孢杆菌GH-9优势在于可降解氨氮含量为500mg/L以上的渗透液、污水或除臭，其氨氮降解效率可达到77％，同时还可以使总氮降解效率达到61％，出气口氨氮降解率达72.2％，有效缓解因氨态氮和总氮引起的污水恶臭及臭气的污染，从而不仅在生产上降解了无机氮，同时还降解了有机氮。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京农学院 北京环氧环保科技发展有限公司
<120> 一株阿式芽孢杆菌GH-9及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1396
<212> DNA
<213> Bacillus aryabhattai
<400> 1
ctccaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc 60
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gcaggttgcc cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaacg tcatagaagc aagcttctaa 1380
tcagttcgct cgactt 1396
Claims (10)
1.一株阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai GH-9，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.14519，保藏日期为2017年08月10日。
2.根据权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GH-9在治理高氨氮的污水、渗滤液或臭气污染中的应用。
3.一种生物菌降解剂，其特征在于，包含权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GH-9。
4.一种如权利要求3所述的生物菌降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GH-9接种到筛选培养基中进行发酵培养，制得生物菌降解剂母液；
(2)然后将生物菌降解剂母液按照0.5～1％的比例加入到发酵培养基中进行发酵培养，制得生物菌降解剂。
5.根据权利要求4所述的生物菌降解剂的制备方法，其特征在于，所述发酵条件为控制温度25～35℃，pH 6.5～8.5，转速150～200r/min，发酵时间36～72小时。
6.根据权利要求4或5所述的生物菌降解剂的制备方法，其特征在于，所述筛选培养基由以下含量组分配制而成：红糖9.51～19.02g/L，柠檬酸钠4.09～8.17g/L，K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水；所述发酵培养基由以下含量组分配制而成：红糖9.51～19.02g/L，柠檬酸钠4.09～8.17g/L，K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2.36～4.72g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量元素2mL/L，其余为水。
7.根据权利要求6所述的生物菌降解剂的制备方法，其特征在于，所述筛选培养基中的C/N比为9～11:1；所述发酵培养基中的C/N比为9～11:1。
8.根据权利要求6所述的生物菌降解剂的制备方法，其特征在于，所述筛选培养基中的红糖和柠檬酸钠的C元素添加比例为3～5:1，所述发酵培养基中的红糖和柠檬酸钠的C元素添加比例为3～5:1。
9.根据权利要求6～8之一所述的生物菌降解剂的制备方法，其特征在于，所述微量元素由以下含量组分配制而成：EDTA·2Na 5～57.1g/L，ZnSO4·7H2O 3.9g/L，CaCl2·2H2O7g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L，CuSO4·5H2O1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L，其余为水。
10.根据权利要求3所述的生物菌降解剂在治理高氨氮的污水、渗滤液或臭气污染中的应用，其特征在于，所述生物菌降解剂的接种量为0.5～1％。
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