CN115491335B - 一种防治中药材根腐病的阿氏芽孢杆菌lhqr2-2、菌剂及应用 - Google Patents
一种防治中药材根腐病的阿氏芽孢杆菌lhqr2-2、菌剂及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种防治中药材根腐病的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LHQR2‑2、菌剂及应用，属于微生物技术领域。本发明的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LHQR2‑2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25507。本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LHQR2‑2对促进中药材的生长具有良好效果，能够促进中药材的株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量的增长；同时，本发明的阿氏芽孢杆菌LHQR2‑2对中药材根腐病具有良好的防效。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种防治中药材根腐病的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LHQR2-2、菌剂及应用。
背景技术
枸杞、板蓝根、甘草、黄芪、党参和银柴胡等大宗中药材，既可以为农民致富增收，也有利于当地的生态环境。根腐病是发生于中药材栽植区的一种常见土传病害，由多种致病菌复合侵染引起，主要包括镰刀菌(Fusarium)和链格孢菌(Alternaria)等，严重制约了道地药材产业可持续发展，素有“植物癌症”之称。枸杞根腐病导致每年枯死的枸杞树达5％，病株率15％，严重地区的病株率37.6％，枯死株率达到26.5％；在低洼排水不良的地块，黄芪根腐病发病率为32％～41％，重病田达55％；板蓝根根腐病发病轻的药材区减产11.2％～21.6％，发病较重的减产35％以上，严重年份减产50％；银柴胡根腐病田间发病率在15％～30％，严重地块高达60％以上。
中药材发生根腐病后，其根部细胞和维管束组织受到破坏，植株无法从土壤中吸收水分和营养物质，致使地上部黄化、枯死，严重影响产量和品质。根腐病还会导致中药材根系化感自毒物质增加，根际微生态环境失去平衡，土壤养分和土壤酶活性降低，进而增加连作障碍危害，已成为制约中药材产业可持续发展的瓶颈问题。种植抗病品种和化学农药是防治中药材根腐病的最主要措施，由于抗病品种选育周期较长，化学农药的残留对生态环境和人类健康构成威胁。因此，探索环境友好、高效的中药材根腐病生物防控技术对于中药材产业高质量发展具有重要科学价值。
根际土壤中的生防细菌可以在根的表面定殖，随着根的生长，菌落逐渐逐渐增大，最后连接起来包围在根的外面形成黏质层或黏胶。微生物都埋存于黏胶内，黏胶会阻止后来微生物的定殖。在这种物质屏障的保护下，一些植物病原菌很难跨越这道屏障从而侵入植物根系，因此植物根系可以在一个相对稳定的环境中生长。用于中药材根腐病防治的细菌主要包括芽孢杆菌(Bacillus)，其中芽孢杆菌具有与环境兼容性好、抑菌活性高、抗逆境能力强、对人畜无害等优点，是使用最为广泛的生防细菌。芽孢杆菌的生防机制包括竞争作用、拮抗作用、诱导抗病性、解磷作用等。芽孢杆菌可以产生各种广谱性的抗菌活性物质，与病原菌竞争营养物质和生存位点，也可以诱导寄主产生抗病性和增强抵抗盐碱、干旱、寒冷等逆境胁迫的能力。但是目前可以促进根茎类中药材生长和有效防治根腐病的芽孢杆菌菌剂较少，有必要开展适用于中药材生长和根腐病防治的芽孢杆菌研究。
发明内容
为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种阿氏芽孢杆菌LHQR2-2，对促进中药材的生长具有良好效果，并且对中药材根腐病具有良好的防效。
根据本发明的第一个方面，提供一种阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LHQR2-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25507。
根据本发明的第二个方面，提供一种菌剂，包含如本发明的第一个方面所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2。
可选择地，所述菌剂为所述阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的培养液或所述阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的发酵液。
可选择地，所述菌剂为以下任一种菌剂：
用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；
或，用于促进中药材生长的菌剂；
或，用于防治中药材根腐病的菌剂。
可选择地，所述中药材为根茎类中药材。
根据本发明的第三个方面，提供了一种如本发明的第一个方面所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或如本发明的第二个方面所述的菌剂在促进中药材生长中的应用。
根据本发明的第四个方面，提供了一种如本发明的第一个方面所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或如本发明的第二个方面所述的菌剂在防治中药材根腐病中的应用。
根据本发明的第五个方面，提供一种中药材的培育方法，包括将如本发明的第一个方面所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或如本发明的第二个方面所述的菌剂施用于中药材。
可选择地，所述中药材为根茎类中药材。
本发明的有益效果如下：本发明的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2对促进中药材的生长具有良好效果，能够促进中药材的株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量的增长；同时，本发明的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2对中药材根腐病具有良好的防效。
保藏信息
本发明分离鉴定的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LHQR2-2，已于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.25507。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2在LB培养基上的菌落形态图片。
图2是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2基于16S rDNA测序的系统发育进化树。
图3是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2与串珠镰孢菌的拮抗作用的平板图片。
图4是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2与茄病镰孢菌的拮抗作用的平板图片。
图5是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2与轮枝镰孢菌的拮抗作用的平板图片。
图6是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2与尖孢镰孢菌的拮抗作用的平板图片。
图7是阿氏芽孢杆菌LHQR2-2促进中药材生长的图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征向量可以相互任意组合。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一株阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)LHQR2-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25507。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一种菌剂，包含上述实施例中的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2。
具体的，菌剂为阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的培养液或阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的发酵液。
具体的，菌剂为以下任一种菌剂：用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；或，用于促进中药材生长的菌剂；或，用于防治中药材根腐病的菌剂。
具体的，中药材为根茎类中药材。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一种上述实施例中的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或其菌剂在促进中药材生长中的应用。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一种上述实施例中的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或其菌剂在防治中药材根腐病中的应用。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一种中药材的培育方法，包括将上述实施例中的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或其菌剂施用于中药材。
具体的，中药材为根茎类中药材。
下面详细说明本发明的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2及其菌剂。
实施例1阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的分离纯化
采集宁夏回族自治区盐池县和隆德县中药材根际土壤。称取10g土壤，放入90mL无菌水的三角瓶中，常温下振荡混匀0.5h，按照10、102和103梯度稀释，然后涂布于NutrientAgar(NA)培养基平板上，30℃倒置培养48h。挑取单菌落，在NA平板上梯度划线，将再次获得的单菌落用40％甘油保存于–80℃冰箱。
Nutrient Agar(NA)培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH7.3±0.1，121℃灭菌20min。
发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25507。
实施例2阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的鉴定
形态学鉴定依据《常见细菌系统鉴定手册》，结果见图1。结合分子生物学技术16SrDNA测序对筛选出的拮抗菌进行种类鉴定，菌株LHQR2-2鉴定为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)，结果见图2。
如图1所示，菌株LHQR2-2的形态特征如下：革兰氏阳性，产生椭圆形芽孢、桃菌落在NA培养基上呈红色，边缘整齐，圆形，扁平。
实施例3阿氏芽孢杆菌LHQR2-2发酵培养液对镰孢菌的抑菌试验
菌株的拮抗作用：尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)295、轮枝镰孢菌(F.verticilliodes)173、串珠镰刀菌(F.moniliforme)N19-2-2和茄病镰刀菌(F.solani)N18-1-2等病原菌菌饼(1cm)置于PDA培养基平板中央，病原菌菌落边缘相距2cm处采用无菌牙签挑取供试菌株单菌落划线(2cm)，未划线的培养皿为空白对照，所有培养皿在28℃黑暗培养，4次重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，筛选拮抗作用明显的菌株，结果见表1和图3、图4、图5、图6。
发酵液的拮抗作用：在马铃薯琼脂平板培养基上中央放置尖孢镰孢菌295、轮枝镰孢菌173、串珠镰刀菌N19-2-2和茄病镰孢菌菌饼(1cm)，菌饼两侧相距2cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入阿氏芽孢杆菌LHQR2-2发酵液作对峙培养，以无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。
无菌上清液的拮抗作用：将无菌上清液按照1:30比例与灭菌并冷却至50℃的PDA培养基混匀，制成带有无菌上清液平板，待平皿凝固后，在带有无菌上清液平板中央放置病原菌菌饼(1cm)，然后培养皿置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。
相对抑菌率(％)＝(对照菌落直径―处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。
表1LHQR2-2培养液对2种镰刀菌的拮抗作用
实施例4阿氏芽孢杆菌LHQR2-2在温室条件下对中药材的促生试验
种子处理：将黄芪、黄芩、银柴胡种子放置于1％的次氯酸钠溶液中表面消毒30min，然后用无菌水冲去种子表面残留的次氯酸钠，在超净工作台上吹干表面水分。
温室促生试验：将表面消毒后的中药材种子浸泡在阿氏芽孢杆菌LHQR2-2培养液中28℃催芽48h，空白对照组浸泡在无菌水中。温室种植黄芪、黄芩和银柴胡，每个处理50g种子，种植面积约20m2。微生物菌剂CK和噁霉灵可湿性粉剂的处理方法与供试菌株相同。空白对照不施用药剂。试验设计包括：⑴空白对照CK：⑵阿氏芽孢杆菌LHQR2-2；⑶噁霉灵可湿性粉剂YCK；⑷微生物菌剂对照MCK。种植30d调查黄芪、黄芩和银柴胡的生长情况，测量株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量，结果见表2、表3和表4。
表2LHQR2-2在温室条件下对黄芪的促生效果
| 处理 | 株高cm | 根长cm | 生物量g | 地上部生物量g | 地下部生物量g |
| CK | 5.33 | 6.07 | 0.15 | 0.11 | 0.02 |
| YCK | 8.98 | 8.77 | 0.25 | 0.15 | 0.03 |
| MCK | 8.76 | 6.52 | 0.25 | 0.14 | 0.03 |
| LHQR2-2 | 7.73 | 9.07 | 0.39 | 0.26 | 0.07 |
表3LHQR2-2在温室条件下对黄芩的促生效果
| 处理 | 株高cm | 根长cm | 生物量g | 地上部生物量g | 地下部生物量g |
| CK | 4.27 | 3.20 | 0.08 | 0.09 | 0.01 |
| YCK | 5.49 | 4.04 | 0.15 | 0.11 | 0.02 |
| MCK | 4.96 | 5.09 | 0.12 | 0.11 | 0.02 |
| LHQR2-2 | 5.11 | 5.30 | 0.12 | 0.10 | 0.02 |
表4LHQR2-2在温室条件下对银柴胡的促生效果
噁霉灵可湿性粉剂YCK催芽的银柴胡种子在培育过程中枯死，因此，表4中没有YCK对银柴胡的促生数据。
实施例5阿氏芽孢杆菌LHQR2-2在大田条件下对中药材的促生试验
田间试验地点在宁夏隆德县隆源中药材科技有限公司黄芪种植基地和葆易圣药业有限公司党参种植基地，试验设计4组处理：CK为清水对照；LHQR2-2发酵液；YCK为20％噁霉灵可湿性粉剂；MCK为抗重茬微生态制剂[中农绿康(北京)生物技术有限公司]。每组处理试验面积约30m2，药剂量约20L。2022年7月24日、7月30日和8月7日进行阿氏芽孢杆菌LHQR2-2发酵液灌根，9月5日采样调查根长、株高、地下部生物量，结果见表5和表6。
表5LHQR2-2在大田条件下对黄芪的促生效果
| 处理 | 根长cm | 根粗cm | 鲜重g | 干重g |
| LHQR2-2 | 25.21 | 0.59 | 7.31 | 3.38 |
| YCK | 28.82 | 0.57 | 8.12 | 3.62 |
| MCK | 24.29 | 0.47 | 5.43 | 2.59 |
| CK | 20.47 | 0.47 | 4.85 | 2.12 |
表6LHQR2-2在大田条件下对党参的促生效果
| 处理 | 根长cm | 根粗cm | 鲜重g | 干重g |
| LHQR2-2 | 36.89 | 0.76 | 14.67 | 9.27 |
| YCK | 35.04 | 0.72 | 17.57 | 9.05 |
| MCK | 41.68 | 0.76 | 18.32 | 9.59 |
| CK | 29.35 | 0.69 | 15.75 | 7.81 |
实施例6阿氏芽孢杆菌LHQR2-2对中药材根腐病的田间防效
田间试验地点在宁夏隆德县隆源中药材科技有限公司黄芪种植基地和葆易圣药业有限公司党参种植基地，试验设计4组处理：CK为清水对照；LHQR2-2发酵液；YCK为20％噁霉灵可湿性粉剂；MCK为抗重茬微生态制剂[中农绿康(北京)生物技术有限公司]。每组处理试验面积约30m2，药剂量约20L。2022年7月24日、7月30日和8月7日进行阿氏芽孢杆菌LHQR2-2发酵液灌根，9月5日采样调查根腐病的危害状况，调查标准见表7；计算病情指数和防治效果，结果见表8和表9。
表7根茎类中药材根腐病严重度分级标准表
| 级别 | 发病程度 | 代表数值 |
| 1 | 不发病 | 0 |
| 2 | 病斑面积占根表面积1％～5％ | 1 |
| 3 | 病斑面积占根表面积6％～10％ | 2 |
| 4 | 病斑面积占根表面积11％～20％ | 3 |
| 5 | 病斑面积占根表面积21％～40％ | 4 |
| 6 | 病斑面积占根表面积41％～60％ | 5 |
| 7 | 病斑面积占根表面积61％～80％ | 6 |
| 8 | 病斑面积占根表面积80％以上 | 7 |
计算公式：防效(％)＝[(空白对照区病株率－处理区病株率)/空白对照区发病率]×100；发病率(％)＝[Σ(每个病级的植株数×相对级数值)/(调查总植株数×最高级数值)]×100。
表8LHQR2-2对黄芪根腐病的田间防效
| 处理 | 发病率/％ | 病情指数 | 防效/％ |
| LHQR2-2 | 89.66 | 33.49 | 38.75 |
| MCK | 82.61 | 40.99 | 25.04 |
| YCK | 93.94 | 32.03 | 41.42 |
| CK | 100 | 54.68 | / |
表9LHQR2-2对党参根腐病的田间防效
| 处理 | 发病率/％ | 病情指数 | 防效/％ |
| LHQR2-2 | 20.00 | 3.43 | 86.79 |
| MCK | 13.33 | 2.86 | 88.98 |
| YCK | 18.18 | 2.86 | 88.98 |
| CK | 81.82 | 25.97 | / |
实施例6阿氏芽孢杆菌LHQR2-2菌株在LB平板上活化后，接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养36h–48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体NFM培养液中，每个菌株3个重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min培养7d后，采用凯氏定氮法测定各培养液固氮率，结果见表10。
阿氏芽孢杆菌LHQR2-2菌株在LB平板上活化后接入于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养4d后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体PKO无机磷、蒙金娜有机磷培养液中，每菌株3重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min摇床培养10d后，采用钼锑抗比色法测定溶磷率，结果见表10。
阿氏芽孢杆菌LHQR2-2菌株在LB平板上活化后，接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养36h–48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体钾长石培养液中，每个菌株3个重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min培养7d后，采用火焰原子吸收光谱法测定各培养液的解钾率，结果见表10。
表10LHQR2-2的固氮、溶磷和解钾效能
| 菌株编号 | 固氮率/％ | 溶磷率/％ | 解钾率/％ |
| LHQR2-2 | 0.170 | 0.043 | 0.041 |
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一株阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）LHQR2-2，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCCNO.25507。
2.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为所述阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的培养液或所述阿氏芽孢杆菌LHQR2-2的发酵液。
4.如权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或如权利要求2所述的菌剂在促进中药材生长中的应用，所述中药材为黄芪、黄芩、银柴胡或党参。
5.如权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或如权利要求2所述的菌剂在防治中药材根腐病中的应用，引起所述中药材根腐病的致病菌为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、轮枝镰孢菌（F.verticilliodes）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）、茄病镰刀菌（F.solani）中的一种或多种。
6.一种中药材的培育方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌LHQR2-2或如权利要求2所述的菌剂施用于中药材，所述中药材为黄芪、黄芩、银柴胡或党参。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115491335A (zh) | 2022-12-20 |
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