CN115747103B - 一种促进中药材生长的草木樨中华根瘤菌lqr-15、菌剂及应用 - Google Patents
一种促进中药材生长的草木樨中华根瘤菌lqr-15、菌剂及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种促进中药材生长的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)LQR‑15、菌剂及应用，涉及微生物技术领域，本发明公开的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LQR‑15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25509。本发明的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LQR‑15对促进中药材的生长具有良好效果，能够促进中药材的株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量的增长；同时，本发明的草木樨中华根瘤菌LQR‑15对中药材根腐病具有良好的防效。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种促进中药材生长的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LQR-15、菌剂及应用。
背景技术
氮素在植物生长过程中起着重要的作用，植物可以利用某些原核微生物来获取大气中的分子氮。这些微生物通过固氮酶的作用，将大气氮转化成植物可以直接利用的铵态氮。固氮酶是生物固氮的催化剂，由固氮基因nif所编码，是微生物固氮的遗传基础。根瘤菌是一类能与豆科植物共生固氮且广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，其能够将空气中的氮气通过生物固氮作用转化为氨，再由共生植物将氨进一步转化为氨基酸等氮源物质，满足其生长繁殖需要。接种根瘤菌能降低胁迫环境对宿主植物造成的伤害，在非生物胁迫环境下，根瘤菌可以通过固氮，提供给豆科植物细胞和组织生长发育所需要的氮素营养，而有效地促进豆科植物生长发育。利用豆科植物与根瘤菌共生固氮，不仅可以达到减肥固氮、增产保质的效果，还能修复土壤结构。黄芪作为一种常用的豆科药食两用植物，其与根瘤菌共生关系的建立为黄芪产量和品质的提高提供了可能。
微生物与药用植物在长期的互作过程中逐渐形成了复杂的互作关系，根际微生物可直接作用于植物，促进或抑制其生长，影响药用植物产量、质量及有效成分的变化。因此，药用植物与微生物间共生作用的研究，将有利于调控药用植物自身内或周围环境中的微生物区系，以促进药用植物优质高产目标的实现。豆科植物是植物界较大的一个科，大多数豆科植物可以与根瘤菌建立共生固氮体系。根瘤菌与豆科植物共生关系是细菌、植物及环境三方相互作用的结果，而不只是细菌与植物间的相互对话。但是目前可以促进根茎类中药材生长的根瘤菌菌肥较少，有必要开展适用于中药材生长的草木樨中华根瘤菌研究。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种促进中药材生长的草木樨中华根瘤菌LQR-15、菌剂及应用，对促进中药材生长和防治中药材根腐病有良好的效果。
根据本发明的第一个方面，提供了一种草木樨中华根瘤菌LQR-15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCCNO.25509。
根据本发明的第二个方面，提供了一种菌剂，包含本发明的第一个方面所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15。
可选择地，所述菌剂为所述草木樨中华根瘤菌LQR-15的培养液。
可选择地，所述菌剂为以下任一种菌剂：
用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；
或，用于促进中药材生长的菌剂；
或，用于防治中药材根腐病的菌剂。
可选择地，所述中药材为根茎类中药材。
根据本发明的第三个方面，如本发明的第一个方面所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15或如本发明的第二个方面所述的菌剂在促进中药材生长中的应用。
根据本发明的第四个方面，如本发明的第一个方面所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15或如本发明的第二个方面所述的菌剂在防治中药材根腐病中的应用。
根据本发明的第五个方面，提供了一种中药材的培育方法，包括将本发明的第一个方面所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15或本发明的第二个方面所述的菌剂施用于中药材。
可选择地，所述中药材为根茎类中药材。
本发明的有益效果是：本发明的草木樨中华根瘤菌LQR-15及其菌剂对促进中药材的生长具有良好效果，能够促进中药材的株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量的增长；同时，本发明的草木樨中华根瘤菌LQR-15及其菌剂对中药材根腐病具有良好的防效。
保藏信息
本发明分离鉴定的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，命名为草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LQR-15，己于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.25509。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15在LB培养基平板上的菌落形态。
图2是草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15基于16S rDNA测序的系统发育进化树。
图3是草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15的发酵培养液与尖孢镰孢菌295拮抗作用的图片。
图4是草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15的代谢产物与镰刀菌拮抗作用的图片。
图5是草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15促进中药材生长的图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征向量可以相互任意组合。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一种草木樨中华根瘤菌LQR-15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25509。
根据一示例性实施例，本实施例提供了一种菌剂，包含上述实施例中的草木樨中华根瘤菌LQR-15。
其中，菌剂为草木樨中华根瘤菌LQR-15的培养液。
其中，菌剂为以下任一种菌剂：用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；或，用于促进中药材生长的菌剂；或，用于防治中药材根腐病的菌剂。
具体的，中药材为根茎类中药材。
根据一示例性实施例，提供了一种草木樨中华根瘤菌LQR-15或其菌剂在促进中药材生长中的应用。
根据一示例性实施例，提供了一种草木樨中华根瘤菌LQR-15或其菌剂在防治中药材根腐病中的应用。
根据一示例性实施例，提供了一种中药材的培育方法，包括将上述实施例中的草木樨中华根瘤菌LQR-15或上述实施例中的菌剂施用于中药材。
具体的，中药材为根茎类中药材。
下面详细说明本发明的草木樨中华根瘤菌LQR-15及其菌剂。
实施例1草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15的分离纯化
草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15的分离：选取2年生黄芪，于7～8月份进行样品采集，采集生长健壮的根际土壤，采样深度15～20cm，装入样品袋中封口、编号，低温(4℃)保存备用。称取新鲜土样1g，振荡制成10-2菌悬液，梯度稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度，将各梯度菌液于无氮固体培养基上涂布，28℃培养5d，选择分离较好的典型单一菌落反复划线纯化至纯种，摇菌富集培养，将富集培养的菌液与终浓度40％的甘油混合，超低温(-80℃)保存备用。
无氮液体培养基：葡萄糖10g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.2g，CaSO40.1g，CaCO35 g，双蒸水1000mL，pH值为7.0；固体培养基加2％的琼脂粉，半固体培养基加0.5％琼脂粉。
实施例2草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15的鉴定
形态学鉴定依据《常见细菌系统鉴定手册》，结果见图1。结合分子生物学技术16SrDNA测序对筛选出的拮抗菌进行种类鉴定，草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15鉴定为草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，结果见图2。
如图1所示，草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15在无氮培养基平板上的菌落形态：菌落呈圆形，凸起，透明，光滑湿润。
实施例3草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15的发酵培养液对镰孢菌的抑菌试验
液体菌剂制备：将草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15进行平板划线纯化，得到单菌落。然后将纯化菌株分别在装有50mL无氮液体培养基的150mL三角瓶中，于30℃，转速180r/min下扩大培养15h。吸取活化菌悬液20mL加入装有300mL无氮液体培养基的500mL三角瓶中，在30℃，180r/min转速下暗培养96h。
代谢产物(无菌上清液)制备：将已活化48h的供试菌株LQR-15单菌落分别接种至无氮液体培养基中，30℃、180rpm/min振荡培养96h后，发酵培养液在4℃、10000rpm/min离心20min去除沉淀物，上清液经过滤(0.22μm)除菌，即得无菌上清液。
菌株的拮抗作用：尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)295、轮枝镰孢菌(F.verticilliodes)173、串珠镰刀菌(F.moniliforme)N19-2-2和茄病镰刀菌(F.solani)N18-1-2等病原菌菌饼(1cm)置于PDA培养基平板中央，病原菌菌落边缘相距2cm处采用无菌牙签挑取供试菌株单菌落划线(2cm)，未划线的培养皿为空白对照，所有培养皿在28℃黑暗培养，4次重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，筛选拮抗作用明显的菌株，结果见表1。
发酵液的拮抗作用：在马铃薯琼脂平板培养基上中央放置尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)295、轮枝镰孢菌(F.verticilliodes)173、串珠镰刀菌(F.moniliforme)N19-2-2和茄病镰刀菌(F.solani)N18-1-2的菌饼，菌饼两侧相距2cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15发酵液作对峙培养，以无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图3。
代谢产物的拮抗作用：将代谢产物(无菌上清液)按照1:30比例与灭菌并冷却至50℃的PDA培养基混匀，制成带有无菌上清液平板，待平皿凝固后，在带有无菌上清液平板中央放置病原菌菌饼(1cm)，然后培养皿置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图4。
表1LQR-15培养液对2种镰刀菌的拮抗作用
实施例4草木樨中华根瘤菌LQR-15菌剂在温室条件下对中药材的促生试验
种子处理：将黄芪、黄芩、银柴胡种子放置于1％的次氯酸钠溶液中表面消毒30min，然后用无菌水冲去种子表面残留的次氯酸钠，在超净工作台上吹干表面水分。
温室促生试验：将表面消毒后的中药材种子浸泡在草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15培养液中28℃催芽48h，空白对照组浸泡在无菌水中。温室种植黄芪、黄芩和银柴胡，每个处理50g种子，种植面积约20m2。微生物菌剂CK和噁霉灵可湿性粉剂的处理方法与供试菌株相同。空白对照不施用药剂。试验设计包括：⑴空白对照CK：⑵草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15；⑶噁霉灵可湿性粉剂YCK；⑷微生物菌剂对照MCK。种植30d调查黄芪、黄芩和银柴胡的生长情况，测量株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量，结果见表2、表3和表4。
表2LQR-15在温室条件下对黄芪的促生效果
| 处理 | 株高cm | 根长cm | 生物量g | 地上部生物量g | 地下部生物量g |
| CK | 5.33 | 6.07 | 0.15 | 0.11 | 0.02 |
| YCK | 8.98 | 8.77 | 0.25 | 0.15 | 0.03 |
| MCK | 8.76 | 6.52 | 0.25 | 0.14 | 0.03 |
| LQR-15 | 6.95 | 7.70 | 0.29 | 0.19 | 0.05 |
表3LQR-15在温室条件下对黄芩的促生效果
| 处理 | 株高cm | 根长cm | 生物量g | 地上部生物量g | 地下部生物量g |
| CK | 4.27 | 3.20 | 0.08 | 0.09 | 0.01 |
| YCK | 5.49 | 4.04 | 0.15 | 0.11 | 0.02 |
| MCK | 4.96 | 5.09 | 0.12 | 0.11 | 0.02 |
| LQR-15 | 5.67 | 5.95 | 0.34 | 0.21 | 0.10 |
表4LQR-15在温室条件下对银柴胡的促生效果
| 处理 | 株高cm | 根长cm | 生物量g | 地上部生物量g | 地下部生物量g |
| CK | 4.78 | 3.88 | 0.15 | 0.16 | 0.01 |
| MCK | 5.21 | 5.86 | 0.22 | 0.17 | 0.03 |
| LQR-15 | 8.03 | 6.27 | 0.41 | 0.26 | 0.04 |
噁霉灵可湿性粉剂YCK催芽的银柴胡种子在培育过程中枯死，因此，表4中没有YCK对银柴胡的促生数据。
实施例5草木樨中华根瘤菌LQR-15菌剂在大田条件下对中药材的促生试验
田间试验地点在宁夏隆德县葆易圣药业有限公司黄芪育苗基地，试验设计3组处理：CK为清水对照；B为草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15发酵液；MCK为抗重茬微生态制剂[中农绿康(北京)生物技术有限公司]。每组处理试验面积约30m2，药剂量约20L。2022年7月24日、7月30日和8月7日进行LQR-15发酵液灌根，9月5日采样调查根长、株高、地下部生物量，结果见表5。
表5LQR-15在大田条件下对黄芪的促生效果
| 处理 | 根长cm | 根粗cm | 鲜重g | 干重g |
| CK | 26.29 | 0.31 | 2.67 | 2.14 |
| MCK | 26.63 | 0.47 | 5.86 | 3.67 |
| LQR-15 | 23.23 | 0.44 | 4.13 | 1.93 |
实施例6草木樨中华根瘤菌LQR-15菌剂对黄芪根腐病的田间防效
田间试验地点在宁夏隆德县葆易圣药业有限公司黄芪育苗基地，试验设计3组处理：CK为清水对照；B为草木樨中华根瘤菌菌株LQR-15发酵液；MCK为抗重茬微生态制剂[中农绿康(北京)生物技术有限公司]。每组处理试验面积约30m2，药剂量约20L。2022年7月24日、7月30日和8月7日进行LQR-15发酵液灌根，9月5日采样调查根腐病的危害状况，调查标准见表6；计算病情指数和防治效果，结果见表7。
表6根茎类中药材根腐病严重度分级标准表
| 级别 | 发病程度 | 代表数值 |
| 1 | 不发病 | 0 |
| 2 | 病斑面积占根表面积1％～5％ | 1 |
| 3 | 病斑面积占根表面积6％～10％ | 2 |
| 4 | 病斑面积占根表面积11％～20％ | 3 |
| 5 | 病斑面积占根表面积21％～40％ | 4 |
| 6 | 病斑面积占根表面积41％～60％ | 5 |
| 7 | 病斑面积占根表面积61％～80％ | 6 |
| 8 | 病斑面积占根表面积80％以上 | 7 |
计算公式：防效(％)＝[(空白对照区病株率－处理区病株率)/空白对照区发病率]×100；发病率(％)＝[Σ(每个病级的植株数×相对级数值)/(调查总植株数×最高级数值)]×100。
表7LQR-15对黄芪根腐病的田间防效
| 处理 | 发病率/％ | 病情指数 | 防效/％ |
| LQR-15 | 84.29 | 15.78 | 12.12 |
| MCK | 75.00 | 10.12 | 43.65 |
| CK | 97.06 | 17.96 | / |
实施例7草木樨中华根瘤菌LQR-15菌剂的固氮、溶磷和解钾效能测试
菌株LQR-15在LB平板上活化后，接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养36h–48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体NFM培养液中，每个菌株3个重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min培养7d后，采用凯氏定氮法测定各培养液固氮率，结果见表8。
草木樨中华根瘤菌菌株菌株LQR-15在LB平板上活化后接入于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养4d后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体PKO无机磷、蒙金娜有机磷培养液中，每菌株3重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min摇床培养10d后，采用钼锑抗比色法测定溶磷率，结果见表8。
草木樨中华根瘤菌菌株菌株LQR-15在LB平板上活化后，接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养36h–48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体钾长石培养液中，每个菌株3个重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min培养7d后，采用火焰原子吸收光谱法测定各培养液的解钾率，结果见表8。
表8LQR-15的固氮、溶磷和解钾效能
| 菌株编号 | 固氮率/％ | 溶磷率/％ | 解钾率/％ |
| LQR-15 | 0.010±.01 | 0.011 | 0.008 |
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LQR-15，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCC NO.25509。
2.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为所述草木樨中华根瘤菌LQR-15的培养液。
4.如权利要求1所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15或如权利要求2所述的菌剂在促进黄芪、黄芩和银柴胡生长中的应用。
5.如权利要求1所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15或如权利要求2所述的菌剂在防治黄芪根腐病中的应用。
6.一种中药材的培育方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的草木樨中华根瘤菌LQR-15或如权利要求2所述的菌剂施用于黄芪、黄芩和银柴胡的生长区域。
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