CN113151118A - 一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用 - Google Patents

一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物病虫害防治技术领域，尤其涉及一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用。本发明筛选到的目标菌株为嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)，该目标菌株来源于重楼茎干内部，和重楼自身循环系统具有良好的兼容性；菌剂制作简单且成本低，无毒、无害及无环境污染，有利于安全有效的控制重楼灰霉病，提高其产量和品质，同时有利于重楼的绿色栽培，保护农田生态系统，促进重楼产业的可持续发展。该菌剂有利于增加重楼叶片的微生物多样性。

Description

一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用
技术领域
本发明属于植物病虫害防治技术领域，尤其涉及一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用。
背景技术
重楼(Paris polyphylla)是百合科重楼属植物，广泛分布于湖北、湖南、四川等地，具有抑制病菌、清热解毒和消肿止痛等功效，临床可用于镇定镇痛、治疗毒蛇咬伤、治疗惊风抽搐、抗癌及保护心血管系统等。此外，重楼是云南白药、宫血宁、季德胜蛇药等中成药的主要原材料，其主要药效成分包括蚤休甙、薯蓣皂甙、甾体及生物碱等。由于重楼生长缓慢，加之人们长期滥采乱挖，野生重楼资源濒临枯竭，已不能满足市场需求，导致重楼市场价格逐年上升，近年亩效益近20万元。随着各级政府对生物医药、大健康产业的重视，中药材重楼因为诸多功效，成为其道地产区的主打产业。近年来，重楼人工种植面积逐年扩大，随之而来的病害问题逐渐突出，尤其在湖北、湖南、四川等地发现重楼灰霉病(Botrytiscinerea)呈现爆发趋势，其中湖北省各个基地平均发病率达55％左右，严重可达100％。每年3-5月，重楼田间湿度较大气温适宜，是重楼灰霉病发生最严重的时段。
对于灰霉病防治目前主要为化学防治，异菌脲、环酰菌胺、对甲抑菌灵、咯菌腈等是防治灰霉病常用药剂。由于中药材登记药剂较少，无药可用现象严重，造成了农药违规使用事件频发。实际生产中农药药剂的滥用和单一药剂的长期使用导致农残超标、环境污染、致病菌抗药性的问题突出，严重威胁重楼的品质。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2017520，名称为嗜麦芽窄食单孢菌PJ4(Stenotrophomonas maltophiliaPJ4)。于2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
本发明还提供了如上述的一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌在制备具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂或链霉素抗性制剂中的应用。
本发明还提供了一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂，包含如上述的嗜麦芽窄食单孢菌。
本发明还提供了如上述的一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂的制备方法，包括将嗜麦芽窄食单孢菌接种于LB液体培养基中，28℃条件下有氧发酵，得到抑菌发酵液。
进一步地，还包括将抑菌发酵液离心，收集上清液，滤膜过滤后，将滤液与LA混合。
进一步地，所述制备方法包括将嗜麦芽窄食单孢菌涂布于LA培养基活化；将活化好的嗜麦芽窄食单孢菌接种于LB液体培养基中进行有氧发酵，制备发酵种子液；之后将发酵种子液接种于LB液体培养基中进行有氧发酵，得到抑菌发酵液。
进一步地，抑菌发酵液中活菌体浓度达到1×108CFU/ml以上。
进一步地，抑菌发酵液中活菌体浓度达到1×1010CFU/ml以上。
本发明还提供了如上述的嗜麦芽窄食单孢菌在防治重楼灰霉病中的应用。
本发明还提供了如上述的嗜麦芽窄食单孢菌在调控重楼产量和/或重楼叶片细菌群落结构中的应用。
进一步地，重楼产量包括单株根鲜重、重楼皂苷Ⅰ含量及重楼皂苷Ⅱ含量中的至少一种。
利用生物防治的方法防治重楼灰霉病具有很好的推广价值和生态效益，目前国内外利用嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)防治灰霉病的研究未见报道。本发明提供的防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌可用于防治重楼灰霉病，且具有链霉素抗性，经验证，嗜麦芽窄食单孢菌对重楼灰霉病菌丝具有明显的抑制作用，可以导致重楼灰霉病菌丝膨大畸形，匮竭和原生质泄露。当所述菌株嗜麦芽窄食单孢菌的浓度达到1×1010CFU/mL时，防治效果达87.40％，和化学药剂相当。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、嗜麦芽窄食单孢菌来源于重楼茎干内部，可以有效地在重楼体内上下传导，和重楼自身循环系统有兼容性好。
2、菌剂制作简单且成本低，无毒、无害、无环境污染，有利于安全有效的控制重楼灰霉病。
3、该菌剂有利于增加重楼叶片微生物多样性。
4、本菌剂为生物制剂，无化学农药的弊端，也不会导致致病菌产生抗药性，种植户可以不用或减少其他化学农药使用量个使用频度，而且生防菌株制剂还有增产增效的功能，可为农民增加收入。
通过平板拮抗实验及不同浓度发酵上清液拮抗试验，表明：嗜麦芽窄食单孢菌菌剂对重楼灰霉病菌丝具有明显的抑制作用，可以导致重楼灰霉菌菌丝膨大畸形，匮竭和原生质泄露。田间防治实验证明，嗜麦芽窄食单孢菌在喷雾植株地上部分，当菌体浓度达到1×1010CFU/mL防治效果达87.40％，和化学药剂相当，和对照相比可以使重楼的块茎产量增加约6.26％，重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ对对照分别增加0.611％和1.09％。
附图说明
图1是嗜麦芽窄食单孢菌对重楼灰霉病菌丝生长的影响；左图为嗜麦芽窄食单孢菌和重楼灰霉病菌对峙图；右图为灰霉病菌对照；
图2是共培养中嗜麦芽窄食单孢菌对重楼灰霉病菌菌丝的影响；图中：A为共培养，对峙区域灰霉菌菌丝形态；B为对照；
图3是不同浓度的嗜麦芽窄食单孢菌发酵滤液对重楼灰霉病菌菌丝生长的影响；
图4是田间施用嗜麦芽窄食单孢菌防治效果；
图5目标菌株在叶片上的定殖情况；
图6是重楼叶片菌群微生物多样性指数表；
图7是重楼叶片微生物类群数统计表；
图8是重楼叶片细菌属水平分类热图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌及其应用。具体如下实施例所示。
实施例1目标菌株的分离、筛选和鉴定
目标菌株分离于湖北省恩施市华中药用植物园重楼基地重楼叶片内，取健康重楼茎干，用75％酒精表面消毒1min，用无菌水冲洗3次，无菌条件下风干，兑无菌水研磨，吸取混合液稀释后涂布于LA平板上，28℃，培养72小时，挑取单菌落纯化培养。灰霉病菌灰霉菌3cm处，按照十字交叉法放置分离得到的重楼叶片内生菌，3天后待对照长满皿，测量细菌菌落外缘到灰霉菌菌丝的距离，重复3次，选择距离最大的细菌作为后期研究使用。
菌株革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，能形成芽胞，在LA培养基上菌落淡黄色、半透明、表面湿润、易挑起、有较强臭味、菌落边缘不整齐，吲哚反应为阴性，M.R试验为阴性，V.P试验为阳性；在4％NaCl中不生长；最适生长温度为28～30℃。
取20μL目标菌株的发酵液涂布在含有10μg/mL链霉素的LA平板上，28℃培养2d后，挑取单菌落，再接入100mL含有10μg/mL链霉素的LB培养基中，28℃，200r/min培养2d，挑取单菌落，转入下一个浓度培养，依次经过含链霉素20、40、80、160、200、300μg/mL的LB培养基中诱导，直到筛选稳定生长的抗链霉素300μg/mL的突变菌株，将抗链霉素菌株在不含抗生素的LB培养基上连续传代5次后，再回接到含有链霉素的培养基检测，以确保耐药性的遗传稳定性。同时该菌株菌落形态、生理生化特性及对病原菌的拮抗作用保持稳定。
经生理生化及测序分析，鉴定该菌株为嗜麦芽窄食单孢菌PJ4(Stenotrophomonasmaltophilia PJ4)，于2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：M 2017520。
实施例2目标菌菌剂的制备
S1、将目标菌株用接种环取一环后涂布于LA培养基上，28℃培养72h。LA固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g/L、氯化钠10g、琼脂15g，纯净水1000mL，pH 7.2～7.4，在121℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
S2、将步骤S1活化好的目标菌株单菌落移入100ml LB液体培养基的250ml锥形瓶中，200rmp、28℃下培养72小时，获得发酵种子液。LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g/L、氯化钠10g、纯净水1000mL，pH 7.2-7.4，在121℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
S3、将步骤S2中发酵种子液接种量按照1:150(V:V)的比例接种于含有100ml LB的锥形瓶，然后置于振荡器中，28℃，200rmp，发酵72h，保证活菌体浓度达到1×1010CFU/ml以上即可，然后生产后的菌剂置于4℃冰箱保存。
平板对峙拮抗试验：
按照方中达《植病研究方法》中的平板对峙培养试验方法，评价目标菌株对重楼灰霉病菌的抑制效果，同时灭菌蒸馏水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计。抑菌率(％)＝(对照组致病菌菌落直径－处理组致病菌菌落直径)/对照组致病菌菌落直径×100％。
结果证明目标菌株对重楼灰霉病菌菌丝生长抑制率为90.59％(如图1所示)。
对峙区重楼灰霉菌菌丝显微观察：
在目标菌株和重楼灰霉病菌菌丝对峙区域，用显微镜观察灰霉菌菌丝形态。结果显示对峙区域重楼灰霉病菌菌丝生长缓慢、菌丝细化、畸形、原生质泄露(如图2所示)。
实施例3目标菌株发酵上清液对重楼灰霉病菌的影响
取活化好的目标菌株菌液500μL注入100mL NB中，28℃，180r/min培养72h，得到发酵原液。取发酵原液12000r/min离心10min，收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤得发酵滤液。取滤液和约45℃的PDA混合，使滤液的终浓度为5％和10％，待冷却后在平板中央接种灰霉菌菌丝块(直径0.5cm)，设置空白对照，每个处理三个重复，置于21℃培养箱中培养。待对照长满皿(4天)后测量菌落的直径，计算抑制率。抑制率(％)＝(对照组致病菌菌落直径－处理组致病菌菌落直径)/对照组致病菌菌落直径×100％。
结果证明目标菌株发酵滤液在5％和10％两个浓度下均可显著抑制灰霉菌的生长，二者的抑制率分别为37.65％和52.94％，二者抑制率之间存在显著性差异(如图3所示)。
实施例4目标菌株对重楼灰霉病田间防效
试验点设于湖北省恩施市新塘乡华中药用植物园重楼资源圃。海拔1600m，上年有灰霉病发生，分离的致病菌主要为灰葡萄孢，种植过程中各项操作均一致，不使用其他化学药剂，重楼为4年生植株，可正常开花结果。试验时间为2018年3月10日，天气晴，重楼出苗率95％，重楼刚出土。
将目标菌株的发酵原液稀释为1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL和1×108CFU/mL备用，化学药剂50％异菌脲可湿性粉剂1000倍液、生物药剂1000亿孢子/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂800倍液作为阳性对照，清水作为阴性对照。于2018年3月10日、3月16日、3月22日，3月28日中午9点，按照各药剂推荐浓度喷雾整个植株和土壤表面，连续施用4次，用药期间及药后12小时无雨。2018年4月17日调查上述处理对重楼的影响，每小区五点取样，每点取5株，统计根茎鲜重及重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量，计算平均根茎重和含量。根据分级标准计算各处理的防效。分级标准：0级，无病；1级，染病面积占果实总面积25％以下；3级，染病面积占果实总面积25-50％；5级，染病面积占果实总面积50-75％；7级，染病面积占果实总面积75％以上(Zhang J etal,Mycoscience,2010,51(6):421.)。病情指数＝100×Σ(各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高病级代表值)；防效(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。
实验结果证明，在药后20d时，重楼内生目标菌株的三个浓度中，1×1010CFU/mL处理的防效达到87.40％，1×109CFU/mL的处理防效为79.84％，1×108CFU/mL的处理防效为74.42％(图4所示)，其中商品菌剂枯草芽孢杆菌的防效为58.91％，所有处理中化学药剂异菌脲的防效最高，达到了88.37％。在各个处理对重楼根茎重量影响中，目标菌株的1×1010CFU/mL处理鲜重最高为18.37g，其次为1×109CFU/mL处理，鲜重为18.26g，和对照相比分别增产6.26％和6.03％。在各处理含量检测中，目标菌株的1×1010CFU/mL处理，重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量分别为0.1799％和0.4317％，均高于对照处理，在目标菌株的1×109CFU/mL处理中，重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量分别为0.1791％和0.4313％，同样高于对照，有差异，但是差异未达到极显著水平。总体看施用目标菌株菌剂后能一定程度提高产量，提高重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量。具体实验数据如表1所示。
表1不同处理对重楼灰霉病田间防治效果
Figure BDA0003096109090000061
表中数据同列中不同小写字母表示差异显著P＜0.05
实施例5目标菌株在叶片上的定殖情况
2018年3月10和3月16日，将1×1010CFU/mL的目标菌株发酵液，均匀喷雾重楼叶片2次，分别在接种后1、3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、80d取被喷雾叶片，每个样品在无菌水中冲洗6次，取0.5g样品，用75％酒精消毒30S，再用1％次氯酸钠消毒3min，然后用无菌水冲洗5次，在无菌操作台内晾干，再于无菌研钵中加1mL水进行研磨，静置10min后吸取上清液100μL，稀释10、100和1000倍后依次涂布于300μg/mL链霉素的NA平板上，重复3次，28℃培养48h，统计菌落数，根据每皿出现菌落数折算每克组织中的细菌个数(CFU/g)。同时随机挑取长出的菌落进行形态学、生理生化和16SrDNA鉴定，确认其为嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
经过统计，目标菌株在重楼叶片上直到第60d依然可以检测到，喷施后第7天出现一次定殖高峰，菌体量达到4.2×105CFU/g，后面呈现下降趋势，第80天叶片菌量约3×103CFU/g，可见目标菌株在重楼叶片上能够很好的定殖。(具体分布图见图5)。
实施例6目标菌株对重楼叶片细菌群落结构的影响
将目标菌株发酵液1×1010CFU/mL喷雾重楼叶片后，10天后取样，在2017年5月利用以Illumina MiSeq测序平台检测叶片细菌菌群结构。测序结果证明，使用目标菌株后，重楼叶片Simpson指数、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数均高于空白对照(图6所示)。同时经过目标菌株处理后，种水平数量高于空白对照，其他指标对照相对较高(图7所示)，针对不同处理在属水平进行热图分析，证明目标菌株处理后，Pseudomonadaceae属、Moraxellaceae属，Flavobacteriaceae属、Enterobacteriaceae属和Staphylococcaceae属含量占有绝对优势，而清水对照中几乎没有。在所展示的前50个细菌属分类热图中，目标菌占有优势的为25种，占了50％，可见目标菌株具有激发某些细菌增长的特性，(图8)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2017520，名称为嗜麦芽窄食单孢菌PJ4(Stenotrophomonas maltophilia PJ4)。
2.如权利要求1所述的一株防治重楼灰霉病的嗜麦芽窄食单孢菌在制备具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂或链霉素抗性制剂中的应用。
3.一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂，其特征在于：包含如权利要求1中所述的嗜麦芽窄食单孢菌。
4.如权利要求3中所述的一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂的制备方法，其特征在于：包括将嗜麦芽窄食单孢菌接种于LB液体培养基中，28℃条件下有氧发酵，得到抑菌发酵液。
5.根据权利要求4中所述的一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂的制备方法，其特征在于，还包括将抑菌发酵液离心，收集上清液，滤膜过滤后，将滤液与LA混合。
6.根据权利要求4中所述的一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将嗜麦芽窄食单孢菌涂布于LA培养基活化；将活化好的嗜麦芽窄食单孢菌接种于LB液体培养基中进行有氧发酵，制备发酵种子液；之后将发酵种子液接种于LB液体培养基中进行有氧发酵，得到抑菌发酵液。
7.根据权利要求4中所述的一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂的制备方法，其特征在于，抑菌发酵液中活菌体浓度达到1×108CFU/ml以上。
8.根据权利要求7中所述的一种具有链霉素抗性的灰霉病防治菌剂的制备方法，其特征在于，抑菌发酵液中活菌体浓度达到1×1010CFU/ml以上。
9.如权利要求1中所述的嗜麦芽窄食单孢菌在防治重楼灰霉病中的应用。
10.如权利要求1中所述的嗜麦芽窄食单孢菌在调控重楼产量和/或重楼叶片细菌群落结构中的应用。
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