CN110218685B

CN110218685B - 生防放线菌及应用

Info

Publication number: CN110218685B
Application number: CN201910577009.1A
Authority: CN
Inventors: 魏利辉; 张琪梦; 周冬梅
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110218685A

Abstract

本发明公开了一种生防放线菌及应用。所述生防放线菌的分类命名为娄彻链霉菌(Streptomyces rochei)，保藏编号为CGMCC NO.17115。本发明还公开了所述生防放线菌在防治植物卵菌病害中的应用。本发明娄彻链霉菌CGMCC 17115能够显著地抑制群结腐霉菌和大豆疫霉菌的生长，对其他多种病原也具有良好的抑制效果，其发酵液及活性提取物稳定性好，耐紫外线辐射、耐酸碱、耐热，可制成生物制剂，用于植物病害的生物防治。

Description

生防放线菌及应用

技术领域

本发明涉及生防菌，尤其涉及一种生防放线菌及应用。

背景技术

生姜是我国重要的经济作物且种植历史悠久，据统计其种植面积逐年增加，截至2018年我国生姜的种植面积达到439.13万亩。生姜茎基腐病最早于1907年在印度苏拉特发现，现普遍发生于世界范围内的生姜种植区。自二十世纪八十年代以来生姜茎基腐病在我国生姜种植区相继爆发且呈逐年加重的趋势。截至目前为止，已有10余种腐霉菌被报道能引起生姜茎基腐病。由于地理坏境及气候等的差异导致世界各国间引起该病病原菌的优势种类也存在差异，其中印度生姜腐霉病原菌以瓜果腐霉为主，澳大利亚以群结腐霉为优势病原菌，我国北方生姜主产区的致病菌以群结腐霉菌为主。

群结腐霉菌(Pythium myriotylum)可以在土壤中长期存活，其无性繁殖体游动孢子可随灌溉水或雨水进行传播，生长期的生姜植株茎基部及地下茎块易受到群结腐霉菌的侵染，在发病初期生姜茎基部会出现褐色的水渍状病斑，并逐渐扩大合并导致茎基部腐烂、塌陷；在叶部症状表现为从老叶的叶尖黄化开始沿叶部边缘逐渐移动至叶片的其余部分及叶鞘变黄，随之幼叶开始出现类似症状直至整个植株枯萎、死亡；患病植株的根茎一般呈棕褐色水渍状、变软后逐渐腐烂并伴有恶臭味。该病原菌引起的经济损失一般在5％到30％之间，但在水涝、高温等有利条件下其损失可达到100％。

大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫病是大豆生产上毁灭性的土传病害，对该病的报道可追溯到1948年，大豆疫霉菌可侵染大豆的各个生育期，出苗前染病会引起种子腐烂或死苗，苗期染病后会引起根腐病或茎基腐，成株期染病后茎基部变褐腐烂，造成植株萎蔫。在没有卵孢子的无性生殖阶段，大豆疫霉常常以菌丝体的形式存在于被侵染宿主组织中。若被侵染的宿主组织在收获时被遗留在田边地头，被侵染的宿主组织会产生孢子囊或在第二年春天发芽。在有风的天气下，孢子囊就会被传播到健康的宿主植株上，在有自由水的环境下，孢子囊会通过产生游动孢子间接萌发，在温暖的环境下，孢子囊会直接产生芽管，同时孢子囊也可以通过土壤传播。在适宜条件下，该病一旦发生便会迅速大量传播，严重时可造成大豆绝产。

生姜茎基腐病和大豆疫病都属于土传性病害，目前在防治方面主推的方法还是化学防治，但是化学药剂的防治效果有限，并且具有残效期长、对生态环境破坏性大的缺点。利用拮抗微生物来控制植物病害，尤其是对土传病害，已成为植物病害综合防治的一种重要措施。该措施可使拮抗微生物在植物根围定殖并形成优势群体，抑制植物病原菌在根围定殖与发展，从而减轻因过度使用化学农药造成的环境污染。但是目前对生姜茎基腐病和大豆疫病具有较优防效的微生物比较有限。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种新的生防放线菌菌株，对多种病原例如生姜茎基腐病、大豆疫病具有优异的防治效果；本发明的另一目的是提供该菌株的用途。

技术方案：本发明所述的生防放线菌，分类命名为娄彻链霉菌(Streptomycesrochei)，保藏编号为CGMCC NO.17115。

娄彻链霉菌CGMCC 17115的形态特征：在高氏一号培养基上，气生菌丝丰富茂盛，干燥绒状，不透明，表面起粉，呈略白的乌贼灰色；基内菌丝呈芒果棕色，生长局限，无可溶性色素。光学显微镜下，菌丝纤细、无隔、分枝；孢子丝呈现直、柔曲、钩状、松敞螺旋形、轮生；孢子呈柱形或椭圆形。

所述娄彻链霉菌CGMCC 17115的培养特征：不产生可溶性色素，气生菌丝和基内菌丝的颜色在不同培养基上各不相同。

所述娄彻链霉菌CGMCC 17115的生理生化特性：不能利用来自山梨醇、蔗糖、松三糖、菊糖、柠檬酸钠的碳源，能利用来自赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸的氮源，可还原硝酸盐，不产生蛋白酶，能产生凝乳酶、酪氨基酸酶和淀粉酶。

所述娄彻链霉菌CGMCC 17115已于2019年1月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)登记保藏，保藏编号为CGMCC No.17115，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。

本发明提供了所述的生防放线菌在防治卵菌或/和真菌引起的植物病害中的应用。

本发明提供了一种生防菌剂，活性成分含有成分A或/和成分B：

成分A：权利要求1或2的娄彻链霉菌CGMCC 17115的菌丝体、孢子、发酵液中的一种或几种；

成分B：成分A的活性提取物。

其中，所述发酵液由娄彻链霉菌CGMCC 17115接种于发酵培养基中发酵制得，发酵液是指发酵结束后，基本滤去菌丝体后的液体，如利用纱布过滤或离心过滤等手段。发酵为生物领域比较通用的方法，较好的，发酵温度25～28℃，发酵时间为96～144h。发酵培养基可采用该种属病原常用的发酵培养基，一种选择，发酵培养基由玉米粉、糖、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙和水组成，pH为7.2-7.4，具体的，所述放线菌发酵培养基由玉米粉9～11g，糖8～11g，氯化钠1.5～2.5g，硫酸铵2.5～3.5g，碳酸钙1.5～2.5g组成，更进一步，所述放线菌发酵培养基由玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g组成。

所述活性提取物可以为乙酸乙酯提取物，即利用乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层，挥去溶剂。

除活性成分外，生防制剂还可以添加相关助剂，制成有利的剂型或提高稳定性、活性等，可根据实际需求进行配制。

本发明还提供了一种植物病害的防治方法，包括：向植物体地上部分或植物根系生长环境中施用所述的生防菌剂。

地上部分施用时，例如叶面喷施。

向植物根系生长环境中施用时，例如灌根、沟施。

本文中所述植物病害，病原可以为卵菌的腐霉属如群结腐霉、瓜果腐霉、钟器腐霉、华丽腐霉、刺腐霉、林栖腐霉，疫霉属如烟草疫霉、辣椒疫霉、柑橘褐腐疫霉、大豆疫霉，也可以为真菌的镰刀菌属如尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌，或丽赤壳属如冬青丽赤壳菌，等。

本文中，植物可以为姜科如生姜，豆科如大豆、花生，禾本科如小麦、水稻、大麦，葫芦科如黄瓜、甜瓜、西瓜，芸香科如柑橘，茄科如番茄、辣椒、烟草、马铃薯，等。

一些列举，所述植物病害为生姜茎基腐病、大豆疫病、辣椒疫病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病、花生黑腐病、大豆根腐病、柑橘褐腐病等。

有益效果：

本发明娄彻链霉菌CGMCC 17115能够显著地抑制群结腐霉菌和大豆疫霉菌的生长，对其他多种病原也具有良好的抑制效果。

本发明娄彻链霉菌CGMCC 17115分离自土壤，与生态环境和谐相融，具体表现为对人、畜和农作物无毒、无致病性，培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的应用前景。

相较于化学制剂，生防菌剂可减少环境污染。

本发明娄彻链霉菌CGMCC 17115的发酵液及活性提取物稳定性好，耐紫外线辐射、耐酸碱、耐热。

附图说明

图1为菌株JK1的发酵液对不同病原菌的菌丝生长的抑制效果，培养皿直径为6cm；

图2为菌株JK1的乙酸乙酯提取物对不同病原菌的菌丝生长的抑制效果，培养皿直径为9cm；

图3为菌株JK1的发酵液稳定性测定结果；

图4为菌株JK1的乙酸乙酯提取物在离体叶片上对群结腐霉和大豆疫霉的抑制效果；

图5为菌株JK1的发酵液在离体叶片上对群结腐霉和大豆疫霉菌的抑制效果；

图6为菌株JK1的发酵液对生姜茎基腐病的盆栽防治效果；

图7为菌株JK1发酵液对大豆疫病的盆栽防治效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

实施例1拮抗放线菌的分离

采用平板稀释法进行分离。具体方法包括：分别取3g采集自江苏省不同地区的土壤样品放入盛有27ml质量体积比0.85％氯化钠溶液的无菌三角瓶中，置于摇床上150rpm，28℃条件下震荡培养30min后静置5min，此时的悬浮液被认为是10^-1的稀释液，然后用质量体积比0.85％氯化钠溶液依次稀释10倍，分别配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释液，分别吸取10^-4、10^-5、10^-6三个梯度的稀释液0.1ml涂布于高氏1号培养基上(每300ml培养基中加入质量体积比3％重铬酸钾1ml)，每个梯度3个重复，置于28℃条件下培养3天左右，选取菌落形态不同的单菌落在高氏一号培养基上连续划线分离纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，置于4℃保存备用，共分离得到143株放线菌。

实施例2放线菌株JK1的鉴定

利用平板对峙试验在上述143株放线菌中筛选对群结腐霉或瓜果腐霉菌丝生长有抑制效果的放线菌，利用平板对峙试验对筛选出的菌再次验证后，获得一株对群结腐霉和瓜果腐霉抑制效果最好的菌株，命名为JK1。

1、形态特征观察

将放线菌菌株JK1划线接种于高氏一号培养基上，以45°斜插于无菌盖玻片，28℃培养10天后，取出盖玻片在光学显微镜下观察菌丝的形态特征。

结果发现，气生菌丝丰富茂盛，干燥绒状，不透明，表面起粉，呈略白的乌贼灰色；基内菌丝呈芒果棕色，生长局限，无可溶性色素。光学显微镜下，菌丝纤细、无隔、分枝；孢子丝呈现直、柔曲、钩状、松敞螺旋形、轮生；孢子呈柱形或椭圆形。

2、培养特征

将放线菌菌株JK1接种于《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基上，28℃培养7-10天后观察菌体生长状况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。

表1菌株JK1在不同培养基上的培养特征

结果发现菌株JK1在以上8种培养基上均不产生可溶性色素，且气生菌丝和基内菌丝的颜色各不相同(表1)。

3、生理生化特征

(1)碳源或氮源利用：将放线菌JK1分别接种在各碳源或氮源培养基上，设置空白对照，28℃培养7-14天后观察，阳性为菌株生长，阴性为菌株不生长或与空白对照相同。

(2)硝酸盐还原：将放线菌JK1接于硝酸盐还原培养液，28℃培养7天和14天时，取培养液并加入格里斯氏A液、B液各1滴；阳性呈红色，否则再加1-2滴二苯胺溶液，阴性呈蓝色，如果不呈蓝色则表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已经还原成其他物质，仍按阳性处理。

(3)明胶液化：用于测定放线菌产生蛋白酶的能力，菌株穿刺接种后28℃培养，分别于5天、10天、20天、30天(观察观察前需将试管放入4℃冰箱冷却30min左右)如果菌落周围明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如果明胶凝块部分或全部变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。

(4)牛奶凝固胨化：将放线菌JK1穿刺接种于脱脂牛奶中，设置空白对照，28℃培养，分别于3天、6天、10天、20天和30天时观察，如果培养基中有凝块形成则为牛奶凝固(说明放线菌能产生凝乳酶)；继续培养后如果凝块又呈透明或半透明的液体状则为牛奶胨化(说明放线菌又产生蛋白酶)。

(5)黑色素的产生：在酪氨酸固体平板上接种放线菌JK1后28℃培养并观察。

(6)淀粉水解：将生防放线菌JK1接种于固体平板上，28℃培养后，在平板上滴加卢哥氏碘液，如果菌落周围出现不变色透明圈则表明放线菌可产生淀粉酶；否则呈阴性。

表2菌株JK1在不同培养条件下的生理生化特征

结果发现，碳源利用的实验发现JK1不能利用来自山梨醇、蔗糖等的5种碳源；氮源利用的实验发现JK1可利用赖氨酸、苏氨酸等的4种氮源；硝酸盐还原实验说明JK1可还原硝酸盐；明胶化实验说明JK1不产生蛋白酶；牛奶凝固胨化实验说明JK1能产生凝乳酶；黑色素的产生实验说明JK1能产生酪氨基酸酶；淀粉水解实验说明JK1能产生淀粉酶。

4、菌株的16S rRNA分子的鉴定

以菌株JK1基因组总DNA为模板，以引物对27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492-R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)对菌株JK1的16S rRNA进行PCR扩增，分别经过PCR清洁回收、连接、转化、鉴定、阳性克隆送生工生物公司(上海)有限公司测序获得核苷酸序列信息。其中回收用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒，连接用TransGen公司的

-Blunt Cloning Kit试剂盒，将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对。

表3与Genbank中已登录的链霉菌菌株的比对结果

整理测序结果得到16S rRNA序列，核苷酸序列如下：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCCTCGCAGGCATCTGCGAGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA

16S rRNA的总长度为1490bp，且与链霉菌属(Streptomyces sp.)或彻链霉菌(Streptomyces rochei)完全相同(表3)，同时结合该菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征结果，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology有关研究论文，将放线菌菌株JK1初步鉴定为娄彻链霉菌(Streptomyces rochei)。

实施例3菌株JK1的发酵液和乙酸乙酯提取物的平板拮抗效果测定

(1)将放线菌JK1接种在高氏一号培养基中活化，在28℃恒温培养箱中黑暗培养，培养2-4d后备用。高氏一号培养基由可溶性淀粉20g，氯化钠0.5g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂15-20g组成，pH为7.2，用蒸馏水定容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min；

(2)将活化的放线菌接种于1L的发酵培养基中进行发酵，在转速为160-180r/min、温度为28℃黑暗条件下振荡培养96h，发酵结束后，其中一种方式，将发酵物在5000r/min转速下离心10min，上清液在超净台中用0.22μm的细菌过滤器过滤制得JK1的发酵液，4℃保存备用；另一种方式，用纱布过滤发酵物后，将滤液与乙酸乙酯按体积比1:1混合萃取3次，取乙酸乙酯层浓缩挥去溶剂合并后得到JK1的乙酸乙酯提取物，4℃保存备用。所述放线菌发酵培养基由玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g组成，pH为7.2-7.4，用蒸馏水容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min。

(3)将群结腐霉(Pythium myriotylum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、钟器腐霉(Pythium vexans)、华丽腐霉(Pythium splendens)、刺腐霉(Pythium spinosum)、林栖腐霉(Pythium sylvaticum)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae,异名：寄生疫霉Phytophthora parasitica)、柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)、冬青丽赤壳菌(calonectria illcicola)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)分别在10％V8固体培养基中培养1-4天备用。所述10％V8固体培养基按照1：100(w/v)的比例在V8蔬菜汁中加入CaCO₃，然后5000r/min离心10min，取上清弃沉淀，在上清液中加入9倍体积的蒸馏水，配制成10％的V8蔬菜汁培养基，固体培养基按照1.5％的比例加入琼脂。在121℃条件下灭菌20min。

(4)制备成含菌株JK1发酵液和乙酸乙酯提取物的培养基：一种方式，按照1:6(v/v)的比例将步骤(2)制备的JK1发酵液与冷却好的V8固体培养基均匀混合，制成含JK1发酵液的平板(以等比例的未接种JK1的发酵培养基上清液作为对照组)；另一方面秤取JK1的乙酸乙酯提取物10mg，加入1ml DMSO配制成母液，将其加到融化好的V8培养基中，制成终浓度为25μg/mL的含药平板(对照组需加相同体积的DMSO)。

(5)用打孔器(d＝6mm)打取13种植物病原菌的菌丝外边缘制成菌碟，将菌碟的菌丝面朝下分别接种于上述培养基的正中央，每组处理设置3个重复，25℃黑暗培养1-4天，用十字交叉法测量菌落直径，抑菌率用以下公式计算：抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-6)×100％

表4 JK1的发酵液和乙酸乙酯提取物对植物病原菌的抑菌活性

抑菌活性的结果表明菌株JK1的发酵液对以上13种植物病原菌均有明显的抑制效果，其中对钟器腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、大豆疫霉的抑制率达到了100％，对其他腐霉属和疫霉属的效果次之，抑制率大于79％，对真菌的抑制效果最差但抑制率也在46％以上(图1)。与之相似的是菌株JK1的25μg/mL乙酸乙酯提取物对群结腐霉菌、瓜果腐霉菌、大豆疫霉菌和辣椒疫霉菌的菌丝生长也呈现明显的抑制效果(图2)，其中对大豆疫霉菌的抑菌效果稳定在100％，对群结腐霉菌的抑菌效果稳定在90％以上(表4)，对瓜果腐霉菌和辣椒疫霉菌的抑制效果稳定在75％以上(表4)，而且乙酸乙酯提取物产量达到了118.6mg/L，但是与JK1的发酵液相比，25μg/mL乙酸乙酯提取物对真菌的抑制效果显著降低或丧失，这说明在对JK1发酵液用乙酸乙酯萃取的过程中丢失了一些对真菌有抑菌活性的物质。

实施例4菌株JK1的发酵液稳定性检测

将放线菌JK1接种在高氏一号培养基中生长，在28℃恒温培养箱中黑暗培养，培养2-4d后备用。将备用的放线菌JK1接种于1L的发酵培养基(发酵培养基由玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g组成，pH为7.2-7.4，用蒸馏水容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min。)中进行发酵，在转速为160-180r/min、温度为28℃黑暗条件下振荡培养96h，发酵结束后在5000r/min转速下离心10min，上清液在超净台中用0.22μm的细菌过滤器过滤制得JK1的发酵液，分别进行热处理、酸碱处理、紫外处理。将群结腐霉菌在10％V8固体培养基中培养1-3天备用。制备成含JK1的菌剂的培养基：按照1:6(v/v)的比例将各处理的JK1发酵液与冷却好的V8培养基均匀混合，制成含JK1发酵液的平板(以等比例的发酵培养基上清液作为对照组)。用打孔器(d＝6mm)打取群结腐霉菌的菌丝外边缘制成菌碟，将菌碟的菌丝面朝下分别接种于上述培养基的正中央，每组处理设置3个重复，25℃黑暗培养，待对照组的菌落直径长至6cm左右时用十字交叉法测量菌落直径，抑菌率用以下公式计算：抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-6)×100％

1发酵液的热处理

将生防放线菌JK1发酵液于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃分别处理60min，3次重复。待自然冷却后，以原发酵液为对照，测定对群结腐霉菌的抑菌活性。

2发酵液的酸碱处理

将发酵液用1M HCl和1M NaOH分别调整PH至3、5、7、9、11，静置6h后，再分别将各发酵液的PH慢慢调至原发酵液7.2的值，每处理重复3次，测定对群结腐霉菌的抑菌活性。

3发酵液的紫外处理

将生防放线菌JK1发酵液置于30W紫外灯下(距灯管20cm)分别照射30min、45min、60min、75min、90min后测定对群结腐霉菌的抑菌活性。

发酵液的热处理结果显示，放线菌JK1发酵产物中的活性物质具有较强的热稳定性。其对群结腐霉菌丝生长的抑制作用影响不大，在100℃处理1h时，其对群结腐霉菌的菌丝生长抑制率仅下降了2.2％；发酵液的酸碱处理结果显示，放线菌JK1发酵液在酸性、中性条件处理后，其活性物质具有较好的酸碱稳定性，而经碱性条件处理后，其活性物质的稳定性略差。PH值调到11处理后，菌株JK1对群结腐霉菌丝生长的抑制率下降了6.6％；发酵液的紫外线照射处理结果显示，放线菌JK1的发酵液对紫外线敏感，UV稳定性较差，随着紫外线照射时间的增长，JK1发酵液对群结腐霉菌菌丝生长的抑制率呈下降趋势，当照射时间为90min时，菌株JK1对群结腐霉菌丝生长的抑制率下降了15.7％(表5和图3)。以上结果证明，放线菌JK1发酵液的活性成分对温度和酸碱变化不敏感，对紫外线照射较敏感，但抑菌率也在80％以上。

表5 JK1的发酵液稳定性测定

实施例5菌株JK1的乙酸乙酯提取物和发酵液在离体叶片上对群结腐霉和

大豆疫霉菌防治效果的测定

(1)将所述放线菌JK1接种在高氏一号培养基中生长，在28℃恒温培养箱中黑暗培养，培养2-4d后备用。

(2)将备用的放线菌JK1接种于1L的发酵培养基(发酵培养基由玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g组成，pH为7.2-7.4，用蒸馏水容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min。)中进行发酵，在转速为160-180r/min、温度为28℃黑暗条件下振荡培养96h，发酵结束后，一种方式，用纱布过滤发酵液制得JK1的发酵液，4℃保存备用；另一种方式，用纱布过滤发酵液后，将滤液与乙酸乙酯1:1混合萃取3次，取乙酸乙酯层浓缩挥去溶剂合并后得到JK1的乙酸乙酯提取物，秤取JK1的乙酸乙酯提取物10mg，加入1ml DMSO配制成母液，4℃保存备用。

(3)选取相同叶位的生姜和大豆叶片各60片左右，先用质量分数为0.5％的吐温20分别浸泡大豆叶片和生姜叶片约10s，接着用无菌水轻轻漂洗，取出后在超净工作台中晾干，然后平均分为四组分别在菌株JK1的发酵液(对照组为未接种放线菌JK1的发酵培养基上清液)和终浓度为25μg/mL的菌株JK1乙酸乙酯提取物水溶液(对照组为相同浓度的DMSO水溶液)中浸泡1min，再次取出在超净工作台中晾干。

(4)将分别在10％V8固体培养基中培养1-3天的群结腐霉菌和大豆疫霉菌，用打孔器(d＝6mm)打取菌落外边缘制成菌碟，将菌碟的菌丝面朝下分别接种于生姜叶片和大豆叶片上，各处理设置14个重复，25℃黑暗培养。分别在24h、48h测量生姜(24h)和大豆叶片(48h)上的病斑直径，最后计算菌株JK1的发酵液和乙酸乙酯提取物在离体叶片上对群结腐霉和大豆疫霉菌的防治效果，其中防效的计算公式是：

防效(％)＝(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径×100％

从病斑统计的结果来看，不论是用25μg/mL的乙酸乙酯提取物还是用发酵液处理生姜或大豆的离体叶片，都对对应接种的卵菌病原菌群结腐霉或大豆疫霉菌有显著地抑制作用，具体表现为JK1发酵液的抑制效果要明显高于25μg/mL的乙酸乙酯提取物，其中用JK1发酵液处理过的大豆叶片对大豆疫霉菌的防效最为显著，达到了95％以上，显著高于专利CN201510827830公开的放线菌菌株JSX-1的防效。另外，用25μg/mL乙酸乙酯提取物处理过的离体叶片表现为对群结腐霉菌的防效高于对大豆疫霉菌的防效(表6，图4和图5)。以上结果说明菌株JK125μg/mL的乙酸乙酯提取物或发酵液具有作为生姜和大豆叶面喷施生物药剂的潜力。

表6 JK1的乙酸乙酯提取物和发酵液在离体叶片上对群结腐霉和大豆疫霉菌的防治效果

实施例6菌株JK1的发酵液对生姜茎基腐病的盆栽防治效果测定

(1)将放线菌JK1接种在高氏一号培养基中生长，在28℃恒温培养箱中黑暗培养，培养2-4d后备用。

(2)将备用的放线菌JK1接种于100ml发酵培养基(发酵培养基由玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g组成，pH为7.2-7.4，用蒸馏水容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min。)中，在转速为160-180r/min、温度为28℃黑暗条件下振荡培养96h，然后用四层纱布过滤发酵物，制得JK1发酵液。

群结腐霉菌游动孢子悬浮液制备方法步骤如下：

(1)将保存的群结腐霉菌株在10％V8培养基上活化生长，在25℃恒温培养箱中黑暗放置进行培养，一般培养的时间为1-2d。

(2)将上述培养1-2d的群结腐霉菌株，用手术刀切取10mm×15mm大小的菌丝块。

(3)将10-20块上述菌丝块置于15ml的灭菌自来水中，菌丝块的菌丝面朝上，每隔30min换一次水。

(4)如此重复3次后加8ml左右的灭菌水，让灭菌水刚刚淹过菌丝面

(5)在25℃恒温培养箱中放置培养，培养时间为20-24h，即可诱导产生游动孢子。

(6)将游动孢子悬浮液用无菌水调节至浓度约为1×10⁴个/ml。

菌株JK1发酵液盆栽防治效果的测定

用于盆栽实验的生姜植株来源于组织培养，向出瓶一周、高度为7.5cm的组培苗根部灌入放线菌JK1发酵液，每株生姜苗灌5ml(以根部位置灌入等体积的未接种JK1的发酵培养基上清液的幼苗为对照)。灌根1d后，再向生姜根部灌入群结腐霉菌的游动孢子，每株生姜苗灌2ml，各处理重复3组、每组12株苗、共接种36株生姜苗。置于25℃恒温培养箱中培养，接种11d后计算植株的病情指数和防治效果。各参数计算公式如下：

病情指数＝100×∑(各级病植株数×各级代表值)/(调查总植株数×最高级代表值)；

0＝植株保持绿色和健康；1＝叶鞘环变色并且下部叶片变黄；2＝植株存活，但叶片完全黄化或死亡；3＝整个植株死亡。

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

结果如图6、表7，在接种群结腐霉菌的游动孢子11天后，对照组的姜苗全部死亡，而经JK1发酵液处理后的姜苗病情指数为13.89，经计算得出JK1放线菌发酵液对群结腐霉菌的防治效果达到了86.11％；表中不同的字母表示在0.01水平上差异显著，以上结果说明菌株JK1的发酵液可以用灌根的方式实现对生姜茎基腐病的防治。

表7放线菌JK1发酵液对生姜茎基腐病的盆栽防治效果测定

实施例7菌株JK1的发酵液对大豆疫病的盆栽防治效果测定

(1)将放线菌JK1接种在高氏一号培养基中上生长，在28℃恒温培养箱中黑暗培养，培养2-4d后备用。

(2)将备用的放线菌JK1接种于100ml发酵培养基(发酵培养基由玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g组成，pH为7.2-7.4，用蒸馏水容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min。)中，在转速为160-180r/min、温度为28℃黑暗条件下振荡培养96h，然后用四层纱布过滤发酵物，制得JK1发酵液，以未接种的发酵培养基的四层纱布过滤液作为对照。

(3)在每个盛有灭菌蛭石的组培瓶中播种3颗饱满的品种为合丰47的大豆种子，在处理组中加入30ml JK1发酵液，在对照组中加入相同体积的未接种的发酵培养基过滤液，放置在25℃光照培养箱中生长12天备用。

(4)将在10％V8固体培养基中培养3天的大豆疫霉菌，用打孔器(d＝6mm)打取菌落外边缘制成菌碟，通过创伤接种的方法将菌碟塞入到生长期为12天的大豆植株中，接种位置约在子叶下方2-3cm处，将接种后的大豆在温室中培养2d后观察大豆的倒伏情况。

倒伏率(％)＝倒伏的株数/实验总株数×100％

结果显示(图7和表8)，用放线菌JK1发酵液处理的大豆植株与对照相比表现出显著的抗倒伏性，其中用放线菌JK1发酵液处理的大豆植株创伤接种大豆疫霉2天后未出现倒伏的症状，对照组的倒伏率达到了72.3％。由此可以得出结论，放线菌JK1发酵液可有效地防治大豆疫病。

表8 JK1发酵液对大豆疫病的盆栽防治效果测定

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序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 生防放线菌及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1490

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60

gatgaaccac ttcggtgggg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc 120

ctgcactctg ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggatactgat cctcgcaggc 180

atctgcgagg ttcgaaagct ccggcggtgc aggatgagcc cgcggcctat cagctagttg 240

gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac 300

actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 360

tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc 420

tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac 480

gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540

gagctcgtag gcggcttgtc acgtcggttg tgaaagcccg gggcttaacc ccgggtctgc 600

agtcgatacg ggcaggctag agttcggtag gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga 660

aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc cgatactgac 720

gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacggtgggc actaggtgtg ggcaacattc cacgttgtcc gtgccgcagc taacgcatta 840

agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc 900

gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt accaaggctt 960

gacatacacc ggaaaaccct ggagacaggg tcccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc 1020

atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ttgtcccgtg ttgccagcag gcccttgtgg tgctggggac tcacgggaga ccgccggggt 1140

caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200

cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgc gaggtggagc gaatctcaaa 1260

aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag 1320

taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440

gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1490

Claims

1.一种生防放线菌，其特征在于，分类命名为娄彻链霉菌（Streptomyces rochei），保藏编号为CGMCC NO.17115。

2.根据权利要求1所述的生防放线菌，其特征在于，具有如下特征：在高氏一号培养基上，气生菌丝干燥绒状，不透明，表面起粉，呈略白的乌贼灰色；基内菌丝呈芒果棕色，生长局限，无可溶性色素；菌丝纤细、无隔、分枝；孢子丝呈现直、柔曲、钩状、松敞螺旋形、轮生；孢子呈柱形或椭圆形。

3.根据权利要求1所述的生防放线菌在防治卵菌或/和真菌引起的植物病害中的应用。

4.根据权利要求3所述的生防放线菌在防治卵菌或/和真菌引起的植物病害中的应用，其特征在于：植物病害为生姜茎基腐病和大豆疫病。

5.根据权利要求3所述的生防放线菌在防治卵菌或/和真菌引起的植物病害中的应用，其特征在于：卵菌病原菌为群结腐霉和大豆疫霉菌。

6.根据权利要求3所述的生防放线菌在防治卵菌或/和真菌引起的植物病害中的应用，其特征在于：适用对象为生姜和大豆。

7.一种生防菌剂，其特征在于，活性成分含有成分A和成分B：

成分A：权利要求1或2中的娄彻链霉菌CGMCC 17115的菌丝体、孢子、发酵液中的一种或几种；

成分B：成分A的活性提取物。

8.根据权利要求7所述的生防菌剂，其特征在于，所述发酵液由娄彻链霉菌CGMCC17115接种于发酵培养基中发酵制得，发酵温度25~28℃，发酵时间为96~144h。

9.根据权利要求7所述的生防菌剂，其特征在于，所述活性提取物为乙酸乙酯提取物。

10.一种植物病害的防治方法，其特征在于，包括：向植物体地上部分或植物根系生长环境中施用权利要求7~9任一项所述的生防菌剂。

11.根据权利要求10所述的植物病害的防治方法，其特征在于，植物病害的病原为腐霉属、疫霉属、镰刀菌属或丽赤壳属的病原菌。

12.根据权利要求10所述的植物病害的防治方法，其特征在于，植物为姜科、豆科、禾本科、葫芦科、芸香科或茄科的植物。

13.根据权利要求10所述的植物病害的防治方法，其特征在于，植物病害为生姜茎基腐病、大豆疫病、辣椒疫病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病、花生黑腐病、大豆根腐病或柑橘褐腐病。