CN110317735B - 生防寡雄腐霉菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治黄瓜幼苗腐霉根腐病、黄瓜灰色疫病、水稻根结线虫病的生防寡雄腐霉菌菌株及其分离和应用的方法，属于农作物病害防治技术领域。所述的生防菌菌株为寡雄腐霉菌(Pythium oligandrum)GAQ1，保藏号为CGMCC No.17470。本发明还公开了所述生防寡雄腐霉菌的分离方法和在防治黄瓜卵菌病害和水稻根结线虫病害中的应用。本发明寡雄腐霉菌CGMCC17470能够显著抑制群结腐霉菌、辣椒疫霉菌和水稻根结线虫对农作物的侵染。本发明所述菌株GAQ1是从土壤中分离获得，与生态环境和谐相融，且无毒、无致病性，可制成生物制剂，用于植物病害的生物防治。

Description

生防寡雄腐霉菌及应用
技术领域
本发明涉及生防菌，尤其涉及一种寡雄腐霉菌及应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)的果实具有水分含量高且低卡路里的特点，还具有抗糖尿病、降血脂、抗氧化、舒缓皮肤刺激和消肿等的潜在功效，因此黄瓜在世界范围内大面积种植，已成为世界上重要的经济作物，但是每年黄瓜的产量都会受到多种病原菌的威胁，其中就包括来自腐霉属和疫霉属的卵菌病原菌。
黄瓜在幼苗期受到群结腐霉菌(Pythium myriotylum)等的侵染后会引起黄瓜幼苗腐霉根腐病。群结腐霉菌属卵菌纲，霜霉目，腐霉科，腐霉属，是一类危害严重的土传性病原菌。该病原菌主要通过灌溉水或雨水等途径进行传播，当群结腐霉菌的游动孢子随水流接触到黄瓜的根部及茎部时，会在寄主表面形成休止孢，休止孢萌发后产生芽管，芽管顶端与植物表面接触时形成附着胞，随后在附着胞下方形成侵染钉进入寄主体内。初侵染时寄主呈水浸状，后于茎基或根部产生褐斑，逐渐扩大后凹陷，严重时病斑绕茎基部或根部一周，致地上部逐渐枯萎。在环境适宜的条件下，病害会在短期内爆发成灾，严重时可造成黄瓜绝收。
黄瓜在结瓜生长期受到辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)的侵染后会引起黄瓜灰色疫病。辣椒疫霉菌属卵菌纲，霜霉目，腐霉科，疫霉属，也是一类破坏力极强的土传性病原菌。疫霉菌的菌丝体、孢子囊和游动孢子在土壤中存活的时间较短，而厚垣孢子、卵孢子等休眠结构在土壤中存活期长。疫霉菌多以直接侵入的方式侵入寄主。辣椒疫霉主要侵染黄瓜的叶片、茎和瓜条，叶片染病时会产生圆形暗绿色病斑，后呈软腐状下垂。茎部发病时茎变细、发霉或呈暗绿色软腐。瓜条发病时出现暗绿色圆形水浸状病斑，病斑凹陷，病部逐渐产生密集的白色霉状物。辣椒疫霉菌再侵染的主要结构是孢子囊和游动孢子，主要传播途径是风和雨水、带病种苗、土壤及灌溉水。
水稻是世界上重要的农作物之一，然而由于现在新栽培技术-旱育秧的大面积推广，全球范围内的土传病原菌(包括线虫)的数量正在逐年增加，这些病原菌的存在极大地威胁了水稻的产量。其中对水稻破坏性最强的线虫之一是水稻根结线虫(Meloidogyneoryzae)，水稻根结线虫以二龄幼虫的形式侵染植物，二龄幼虫侵入根的伸长区后，通过细胞间隙向根尖迁移，线虫进入维管束后会用口针穿刺细胞壁并向内注射分泌物，诱导产生巨细胞，随着根的膨大而形成明显的根瘤。雌虫在寄主组织内发育为膨大虫体，卵产于虫体后部的卵囊中，卵囊多数外露于根表皮，在适宜条件下卵又可以孵化成二龄幼虫，进入下一个侵染循环，导致水稻根结数不断增多，最终影响水稻的正常生长发育，造成水稻产量的损失。此外，水稻根结线虫还可以侵染小麦等多种禾本科作物。
目前针对黄瓜幼苗腐霉根腐病和灰色疫病的防治方法主要有以下两方面：(1)栽培措施：实行轮作，选用抗病的品种，高温雨季注意排除积水；(2)药剂防治：常用药剂有杜邦克露、杜邦新万生等，但是这些防治效果并不显著且存在生态安全隐患问题，现阶段化学农药的黄金时期已然逝去，近年来人们对于生物防治的研究热度不断升温。另一方面，目前针对水稻根节线虫的防治依然以化学杀虫剂为主，但是这些杀虫剂多为高毒或中毒产品，对人类和环境安全造成威胁，且很多产品已被禁用或是限制使用。因此研究防治卵菌病害和根结线虫病害的生防制剂具有深远的意义。但是尽管人们迫切地想要寻求化学农药的替代品，目前也只有14种真菌、卵菌、细菌微生物用于生物防治，其中假单胞菌属、木霉菌属和尖孢镰刀菌是研究最多的，另外，寡雄腐霉菌(Pythium oligandrum)在最近十年里受到越来越多的关注。
寡雄腐霉菌以其对50多种真菌和卵菌的强寄生性而闻名，对它的研究要追溯到1930年，但是它在很长时间里只被认为是一种非致病性微生物，自1986年以来，至少有44篇文献证明了寡雄腐霉菌可以直接或间接地保护植物，但是它在植物根结线虫方面的应用还未见报道。因寄主植物和目标病原菌以及应用方法的不同，寡雄腐霉菌对病原菌致病性的降低范围在15％到100％不等。由于我国对寡雄腐霉菌的研究和应用起步都晚于欧洲等发达国家，目前国内用于科学研究和市场生产应用的资源仍十分有限。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一株寡雄腐霉菌菌株，对多种病原菌例如黄瓜幼苗腐霉根腐病、黄瓜灰色疫病、水稻根结线虫病具有优异的生物防治效果；本发明的另一目的是提供该菌株的分离方法和用途。
技术方案：本发明所述的生防卵菌，分类命名为寡雄腐霉菌(Pythiumoligandrum)，保藏编号为CGMCC No.17470。
所述寡雄腐霉菌CGMCC 17470已于2019年4月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)登记保藏，保藏编号为CGMCC No.17470，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。
本发明提供了所述的生防寡雄腐霉菌的分离方法和在防治病原卵菌和根结线虫引起的植物病害中的应用。
本发明提供了一种寡雄腐霉菌的分离方法：
取50g过筛的土壤，加500ml水搅拌5min，上清液经孔径150、61、38微米的筛网过滤，将过滤液中的土壤颗粒分别均匀涂布于选择性培养基上，并使之完全淹没在悬浮液溶液内，25℃条件下培养12小时左右，倒去多余的水后用自来水缓慢小心地冲去表面的土壤颗粒，将平板上可见的微小菌落转移至新的选择性培养基上。选择性培养基的配制是将澄清的V8汁1ml，加水99ml，琼脂2g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度下降至50-60℃时，加入氨苄青霉素10mg、制霉素5mg、五氯硝基苯1mg。
本发明提供了一种生防菌剂，活性成分含有：
权利要求1的寡雄腐霉菌CGMCC 17470的菌丝体、孢子、次生代谢物中的一种或几种。其中所述菌丝体由寡雄腐霉菌CGMCC17470接种于V8或/和水琼脂培养基上制得，培养温度25℃。10％V8固体培养基的配制方法是将V8汁在5000rpm条件下离心10min，经四层纱布过滤后取1ml过滤液，加水99ml，琼脂1.5g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。1％水琼脂培养基的配制方法是在100ml自来水中加入1g琼脂，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
除活性成分外，生防制剂还可以添加相关助剂，制成有利的剂型或提高其稳定性、活性等，可根据实际需要进行配制。
本发明还提供一种植物病害的防治方法，包括：向植物幼苗的根系生长环境中施用所述的生防菌剂。
向植物幼苗的根系生长环境中施用时，例如种子包衣、拌种、灌根等。
本文所述植物病害，病原可以为卵菌的腐霉属如群结腐霉，疫霉属如辣椒疫霉，也可以为线形动物门如水稻根结线虫等。
本文中，植物可以为姜科如生姜；禾本科如小麦、大麦、水稻；葫芦科如黄瓜、西瓜、甜瓜、丝瓜、佛手瓜、苦瓜、南瓜、打瓜；茄科如辣椒、番茄、茄子等。
一些举例，所述植物病害为生姜茎基腐病、黄瓜幼苗腐霉根腐病、黄瓜灰色疫病、水稻根结线虫病等。
有益效果：
本发明对寡雄腐霉菌CGMCC 17470的分离方法与传统方法相比更快捷。
本发明寡雄腐霉菌CGMCC 17470能够显著地抑制群结腐霉菌、辣椒疫霉菌、水稻根结线虫对植物的侵染。
本发明寡雄腐霉菌CGMCC 17470分离来自土壤，对人、畜和环境无毒、无害，培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的应用前景。
相较于化学制剂，生防菌剂可减少环境污染。
本发明寡雄腐霉菌CGMCC 17470是一株从我国新分离到的生防菌，可为今后的科学研究和实际应用提供资源。
附图说明
图1为寡雄腐霉菌GAQ1与群结腐霉菌的平板对峙；
图2为寡雄腐霉菌GAQ1对群结腐霉菌在黄瓜幼苗上的平板防治效果；
图3为寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜幼苗腐霉根腐病的盆栽防治效果；
图4为寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜灰色疫病的防治效果；
图5为为寡雄腐霉菌GAQ1能有效地抑制水稻根结线虫对水稻幼根的侵染；
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1生防寡雄腐霉菌的分离
具体过程如下：
1、土壤样品的采集
从山东省莱芜市莱城区平里镇李家寨村生姜病田里采集10-20cm深处的土壤，分装标记后带回实验室进行分离。
2、寡雄腐霉菌的分离
(1)取采集的土样用粗筛筛去石子和植物未腐败残体。
(2)秤取过筛的土壤50g，加水500ml，用玻璃棒搅拌5min，立即将上清液经孔径150、61、38微米的筛网过滤，收集滤过液。
(3)用少量的水冲洗38微米的筛网，将网上滤得的残留物收集在三角瓶。
(4)取5ml残留物悬浮液加在选择性培养基平板上，将其中的土壤颗粒均匀涂布于平板上，并使之完全淹没在悬浮液溶液内。选择性培养基的配制是将澄清的V8汁1ml，加水99ml，琼脂2g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度下降至50-60℃时，加入氨苄青霉素10mg、制霉素5mg、五氯硝基苯1mg。
(5)将培养皿在25℃下过夜培养12小时左右，倒去选择性培养基平板的水，用缓慢自来水小心冲去平板表面的土壤颗粒，将平板上可见的微小菌落转移至新的选择性培养基上，12℃保存备用。
实施例2寡雄腐霉菌GAQ1的分子鉴定
利用CTAB法提取分离得到的5个菌株基因组DNA后，使用Vazyme公司的
Figure BSA0000188034680000041
MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase高保真酶和引物对ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对真核生物的ITS区域进行扩增，送生工生物公司(上海)有限公司测序获得核苷酸序列信息，将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现分离到的一株菌株GAQ1有可能为寡雄腐霉菌。
为了进一步验证该菌株是否为寡雄腐霉菌，使用Vazyme公司的
Figure BSA0000188034680000042
MaxSuper-Fidelity DNA Polymeras高保真酶和腐霉菌的2个持家基因的引物对TUBUF2(5’-CGGTAACAACTGGGCCAAGG-3’)/TUBUR1(5’-CCTGGTACTGCTGGTACTC-3’)及FM66(5’-TAGGATTTCAAGATCCTGC-3’)/FM58(5’-CCACAAATTTCACTACATTGA-3’)对β-tubulin基因和CoxII基因进行扩增。分别经过PCR清洁回收、连接、转化、鉴定、阳性克隆送生工生物公司(上海)有限公司测序，获得该菌株的核苷酸序列信息。其中回收用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒，连接用TransGen公司的
Figure BSA0000188034680000054
-Blunt Cloning Kit试剂盒，将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对。
表1与Genbank中已登录的寡雄腐霉菌株的比对结果
Figure BSA0000188034680000051
整理测序结果得到ITS区域的序列，核苷酸序列如下：
Figure BSA0000188034680000052
整理测序结果得到β-tubulin基因的序列，核苷酸序列如下：
Figure BSA0000188034680000053
Figure BSA0000188034680000061
整理测序结果得到COXII基因的序列，核苷酸序列如下：
Figure BSA0000188034680000062
经分析发现，该菌株不论是ITS区域序列还是两个保守的看家基因β-tubulin基因和COXII基因的序列都与已报道的寡雄腐霉菌(Pythium oligandrum)的同源性最高，且相似度都在99.7％以上，其中β-tubulin基因序列与已知寡雄腐霉菌的菌株3和Sil3的序列完全一致(表1)。因此确定了本次从土壤中分离得到的菌株确实为寡雄腐霉菌，并将其命名为寡雄腐霉菌GAQ1。
实施例3寡雄腐霉菌GAQ1的平板拮抗检测
1、平板对峙试验
(1)将分别在10％V8固体平板上生长1天的寡雄腐霉菌GAQ1和群结腐霉菌分别用直径为6mm的打孔器沿菌落边缘打孔。其中10％V8固体培养基的配制方法是将V8汁在5000rpm条件下离心10min，经四层纱布过滤后取1ml过滤液，加水99ml，琼脂1.5g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
(2)在距离9cm大小的10％V8固体平板的边缘处接种群结腐霉菌菌碟，平板另一端种接寡雄腐霉菌GAQ1菌碟，置于25℃条件下培养。
(3)分别在两菌株接触前、部分覆盖、完全覆盖三个不同阶段用5ml 0.1％台盼蓝覆盖对峙平板，轻轻转动保证染料与菌丝充分接触，室温下放置10min，然后用无菌水反复冲洗菌丝去除残留染料，观察菌丝染色变化并拍照，并且挑取接触菌丝，显微镜下观察菌丝颜色变化，分析细胞完整性(图1)。
根据图1显示的结果发现，寡雄腐霉菌GAQ1与群结腐霉菌对峙培养1天后，其菌丝边缘未接触，此时群结腐霉菌菌丝完整，不能染成蓝色；对峙培养2天后，GAQ1菌丝与群结腐霉菌丝部分接触，群结腐霉菌的菌丝遭到破坏，此时与GAQ1接触部分的群结腐霉菌丝被染成蓝色，显微镜观察结果显示，寡雄腐霉菌GAQ1与群结腐霉菌未接触部分两者菌丝均呈透明状，而两者接触部分群结腐霉菌丝死亡，台盼蓝进入其菌丝内部呈现蓝色；对峙培养3天后，GAQ1菌丝与群结腐霉菌丝接触面积进一步扩大，此时群结腐霉菌丝全部被成蓝色。以上结果说明，寡雄腐霉菌GAQ1能杀死群结腐霉菌的菌丝。
实施例4寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜幼苗腐霉根腐病的防治效果
1、黄瓜幼苗猝倒前的离体测试
(1)将分别在10％V8固体平板上生长2天的寡雄腐霉菌菌株GAQ1或群结腐霉菌分别用直径为6mm的打孔器沿菌落边缘打孔菌碟接种于1％的WA固体平板的中央位置，25℃条件下倒置培养一周(以接种空白的V8固体的平板作为对照组，处理组为先接种寡雄腐霉菌和群结腐霉菌的平板)。其中10％V8固体培养基的配制方法是将V8汁在5000rpm条件下离心10min，经四层纱布过滤后取1ml过滤液，加水99ml，琼脂1.5g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min；1％WA固体培养基的配制方法是在100ml自来水中加入1g琼脂，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
(2)将中央的菌碟去除，分别在相同的位置接种直径为6mm的群结腐霉菌或寡雄腐霉菌的菌碟，每个实验组设置3个生物学重复，25℃条件下倒置培养一周(处理组为先接种寡雄腐霉菌后接种群结腐霉菌和先接种群结腐霉菌后接种寡雄腐霉菌的平板；对照组为先接种空白V8固体后接种群结腐霉菌和先接种空白V8固体后接种寡雄腐霉菌的平板)。
(3)选取饱满的“露丰”黄瓜种子，在75％的酒精中浸泡2min后，用灭菌自来水洗3遍，将种子放入盛有1％的NaClO的离心管中，水平放置于转速为200rpm的25℃摇床上30min，在超净台中用灭菌自来水洗6-7遍，将洗好的种子置于灭菌滤纸上，然后在每个WA固体培养板的表面放置10颗黄瓜种子，置于25℃条件下培养一周。
(4)黄瓜幼苗病情指数统计，培养7天后对黄瓜幼苗的病情指数进行统计并拍照(图2)，其中黄瓜幼苗的病情分级标准和计算公式如下：
病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)
0级：种子萌发且种苗健康；1级：种子萌发且种苗根部有轻微的棕色病斑；2级：种子萌发且种苗根部有较大的棕色病斑；3级：种子萌发后死亡；4级：种子未萌发且死亡。
其中调查总株数×最高级代表值＝10×4＝40
相对防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
表2 寡雄腐霉菌GAQ1对群结腐霉菌的防治效果
Figure BSA0000188034680000081
根据图2和表2显示的结果发现，与阳性对照组空白+群结腐霉相比，当先接种寡雄腐霉菌GAQ1后接种群结腐霉菌时，GAQ1能显著降低群结腐霉菌对黄瓜幼苗的致病力，其防治效果达到39.51％，而当先接种群结腐霉菌后接种寡雄腐霉菌GAQ1时，GAQ1对群结腐霉菌的拮抗效果不佳，相对防效只有2.47％。以上结果说明，在利用寡雄腐霉菌GAQ1对群结腐霉菌进行防控时，需要提前施用寡雄腐霉菌GAQ1使其占据绝对优势时防治效果显著。
2、寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜幼苗腐霉根腐病的盆栽防效试验
(1)将分别在10％V8固体平板上生长2天的寡雄腐霉菌菌株GAQ1用直径为6mm的打孔器沿菌落边缘打孔，菌碟接种于1％WA固体平板的中央位置，25℃条件下倒置培养一周(以接种空白的V8固体的平板作为对照组，处理组为接种寡雄腐霉菌的平板)。其中10％V8固体培养基的配制方法是将V8汁在5000rpm条件下离心10min，经四层纱布过滤后取1ml过滤液，加水99ml，琼脂1.5g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min；1％WA固体培养基的配制方法是在100ml自来水中加入1g琼脂，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
(2)选取饱满的“露丰”黄瓜种子，在75％的酒精中浸泡2min后，用灭菌自来水洗3遍，将种子放入盛有1％的NaClO的离心管中，水平放置于转速为200rpm的25℃摇床上30min，在超净台中用灭菌自来水洗6-7遍，然后在每个直径为9cm的WA固体培养板表面放置4颗种子，置于25℃条件下培养7天。
(3)群结腐霉菌游动孢子悬浮液的制备：将保存的群结腐霉菌株在10％V8培养基上活化生长，在25℃恒温培养箱中黑暗放置进行培养，一般培养的时间为1-2天备用；将备用的菌株用手术刀切成10mm×15mm大小的菌丝块；将10-20块上述菌丝块置于15ml的灭菌自来水中，菌丝块的菌丝面朝上，每隔30min换一次水，重复3次；最后加8ml左右的灭菌自来水，25℃恒温培养箱中放置培养，培养24h左右即可诱导产生游动孢子；用无菌自来水将浓度调节至1000个/ml左右。
(4)将WA固体平板去培养皿后转移至盛有灭菌蛭石的一次性塑料碗中，一方面在每个碗中接种80ml浓度为1000个/ml的孢子悬浮液，25℃的光照培养箱中培养10天后拍照并统计黄瓜幼苗的健康株数和死亡株数。
其中各参数的计算公式如下所示：
发病率(％)＝(发病植株数/总植株数)×100
防治效果(％)＝[(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率]×100
表3 寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜幼苗腐霉根腐病的防治效果
Figure BSA0000188034680000091
根据图3和表3显示的结果发现，对照组中黄瓜幼苗的发病率为66.7％，处理组中黄瓜幼苗生长健康且发病率为0，经计算可得寡雄腐霉菌GAQ1对群结腐霉菌的盆栽防治效果达到了100％。温室盆栽实验结果说明，提前施用寡雄腐霉菌GAQ1确实可以实现对黄瓜幼苗腐霉根腐病的防治，且防治效果可达到100％。由此可以得出结论，寡雄腐霉菌GAQ1及以上施用的方法对黄瓜腐霉根腐病的防治具有很好的应用潜力。
实施例5寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜灰色疫病的防治效果
(1)将在10％V8固体平板上生长2天的寡雄腐霉菌菌株GAQ1用直径为6mm的打孔器沿菌落边缘打孔，菌碟接种于1％WA固体平板的中央位置，25℃条件下倒置培养一周(以接种空白的V8固体的平板作为对照组，处理组为接种寡雄腐霉菌的平板)。其中10％V8固体培养基的配制方法是将V8汁在5000rpm条件下离心10min，经四层纱布过滤后取1ml过滤液，加水99ml，琼脂1.5g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min；1％WA固体培养基的配制方法是在100ml自来水中加入1g琼脂，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
(2)选取饱满的“露丰”黄瓜种子，在75％的酒精中浸泡2min后，用灭菌自来水洗3遍，将种子放入盛有1％的NaClO的离心管中，水平放置于转速为200rpm的25℃摇床上30min，在超净台中用灭菌自来水洗6-7遍，然后在每个直径为9cm的WA固体培养板表面放置4颗种子，置于25℃条件下培养7天。
(3)将WA固体平板去培养皿后转移至盛有灭菌蛭石的一次性塑料碗中，待黄瓜幼苗在25℃的光照培养箱中培养20天左右后取相同叶位的黄瓜叶片，在离体叶片上接种辣椒疫霉菌的菌碟，分别在接种2天后统计病斑直径并拍照。其中上述菌碟的制备方法为将辣椒疫霉菌在10％V8固体培养基中培养3天后备用，然后用打孔器(d＝6mm)打取的菌落外边缘制成菌碟。
其中各参数的计算公式如下所示：
防治效果(％)＝100×(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径
表4 寡雄腐霉菌GAQ1对黄瓜灰色疫病的防治效果
Figure BSA0000188034680000101
由图4和表4可以得出，与对照组相比处理组的病斑直径显著减小，通过计算发现与对照组相比处理组对辣椒疫霉菌引起的黄瓜灰色疫病的防治效果达到了66.8％，以上结果说明用寡雄腐霉菌GAQ1处理黄瓜幼苗后，可以间接地实现对黄瓜灰色疫病的防治。由于该实例中提到的群结腐霉菌和辣椒疫霉菌均属于卵菌，所以认为寡雄腐霉菌GAQ1对病原卵菌的防效具有持效性。
实施例6寡雄腐霉菌GAQ1能显著抑制水稻根结线虫对水稻幼根的侵染
(1)将在10％V8固体平板上生长2天的寡雄腐霉菌菌株GAQ1用直径为6mm的打孔器沿菌落边缘打孔，菌碟接种于1％WA固体平板的中央位置，25℃条件下倒置培养一周(以接种空白的V8固体的平板作为对照组，处理组为接种寡雄腐霉菌的平板)。其中10％V8固体培养基的配制方法是将V8汁在5000rpm条件下离心10min，经四层纱布过滤后取1ml过滤液，加水99ml，琼脂1.5g，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min；1％WA固体培养基的配制方法是在100ml自来水中加入1g琼脂，培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
(2)选取饱满的“日本晴”水稻种子，在75％的酒精中浸泡2min后，用灭菌自来水洗3遍，将种子放入盛有1％的NaClO的离心管中，水平放置于转速为200rpm的25℃摇床上30min，在超净台中用灭菌自来水洗6-7遍，然后在每个直径为9cm的WA固体培养板表面放置10颗种子，25℃条件下斜60度角培养2天。
(3)水稻根结线虫的准备：选取有明显根结的水稻根，用自来水洗去泥沙。用组织破碎仪将根组织进行破碎后用1％的NaClO充分漂洗5min。将混合物依次通过20目、100目和500目筛，期间用自来水不断冲洗根组织，最后用自来水轻轻漂洗500目筛子中的虫卵，并收集至50ml离心管中，5000rpm离心5min，弃上清保留沉淀。用10ml 35％的蔗糖溶液悬浮沉淀，3000rpm离心5min；向离心管中轻轻滴加1ml无菌水，5000rpm离心5min，移液枪吸取上层虫卵至新的15ml离心管，加入7ml1％的NaClO，振荡涡旋后3000rpm离心5min，弃上清后加入灭菌去离子水，振荡涡旋后3000rpm离心5min，弃上清，重复漂洗2-3次去除多余的NaClO。超净台中将表面消毒后的虫卵滴加到灭菌的孵化器上，每天收集孵化的幼虫，一般收集到第4天即可获得活性良好的二龄幼虫，置于12℃冰箱备用。
(4)选取根长约2cm的水稻排成一排，根部朝下，在根部覆盖一层尼龙膜用于接种。在超净台中将活性良好的二龄水稻根结线虫的幼虫用1％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)漂洗2次，并定容至浓度为100头/10μl虫液，然后用移液枪滴加10μl的虫液至水稻根尖，60度角放置，25℃避光12h，之后恢复12h/12h光周期。分别在接种后24h和48h选取30棵水稻用于线虫的侵染观察。
(5)将整个水稻幼苗浸泡于含有25ml 1％NaClO的50ml离心管中5min，再用自来水漂洗15min去除NaClO残留。向盛有40ml自来水的玻璃组培瓶(200ml)中加入1ml配制好的酸性品红母液，再将水稻放入瓶中，盖上盖子，在微波炉中最大火力加热1min，待自然将至室温后，倒掉染液，用镊子将染色后的水稻苗放到吸水纸上吸去多余的染液，再转移至一次性培养皿上，滴加2-3滴脱色液(乳酸∶甘油∶水＝1∶1∶1)，用镊子挤压水稻幼根使根中的线虫全部破根而出，然后在体视镜下观察和统计根部线虫的侵染情况。
表5 寡雄腐霉菌GAQ1对水稻根结线虫的防治效果
Figure BSA0000188034680000111
根据图5和表5显示的结果发现，不论是在24h还是48h，对照组中水稻根部侵入的线虫数量都明显多于处理组中的线虫数量，具体表现为，在24h时，空白组水稻根中侵入的线虫数量为38头，而处理组水稻根中侵入的线虫数量只有1头；在48h时，空白组水稻根中侵入的线虫数量增加为51头，而处理组水稻根中侵入的线虫数量与24h相比变化不大为2头。以上实验结果说明，用寡雄腐霉菌GAQ1提前处理水稻幼苗可以显著抑制水稻根结线虫对水稻的侵染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
Figure ISA0000188034700000011
Figure ISA0000188034700000021
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Figure ISA0000188034700000041

Claims (5)

1.一株生防卵菌菌株，其特征在于，分类命名为寡雄腐霉菌（Pythium oligandrum），保藏号为CGMCC No.17470。
2.权利要求1所述的生防卵菌菌株在防治黄瓜幼苗腐霉根腐病、黄瓜灰色疫病和/或水稻根结线虫病中的应用。
3.一种生防菌剂，其特征在于，活性成分含有权利要求1的寡雄腐霉菌CGMCC No.17470的菌丝体、孢子中的一种或两种。
4.根据权利要求3的生防菌剂，其特征在于，所述菌丝体由寡雄腐霉菌CGMCC No.17470接种于V8或/和水琼脂培养基制得，培养温度为25℃。
5.一种植物病害的防治方法，其特征在于，包括向植物根系生长环境中施用权利要求3中的生防菌剂，所述植物病害为黄瓜幼苗腐霉根腐病、黄瓜灰色疫病和/或水稻根结线虫病。
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