CN113862156B - 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)K2018-1418及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)K2018‑1418及其应用。本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，其保藏号为CGMCC No.22445。该菌株对南方根结线虫有明显的抑制作用，同时能够抑制致病性尖孢镰刀菌，且不影响寄主黄瓜的正常生长，具有良好的生防效果。

Description

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)K2018-1418及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)K2018-1418及其应用。

背景技术

南方根结线虫(Meloidogyne incognita Chitwood)是一种植物根系定居性内寄生物，属于线形动物门、线虫纲、垫刃目、根结线虫科。该线虫在我国绝大多数省市均有分布，可侵染数百种作物，其中蔬菜和果树是受害最严重的作物。南方根结线虫主要危害植株根部，一是直接破坏寄主根部的表皮细胞，二是通过分泌唾液破坏寄主细胞的正常代谢功能而使根部发生病变。植物根系受害后形成大小和形状不同的瘤状根结，最初呈白色，后期变为淡褐色。植株发病后根系吸收、输送养分和水分的能力下降，使植株生长衰弱，地上部分表现为矮小、黄化、萎蔫，严重者全株枯死。

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科等多种植物发生枯萎病。尖孢镰刀菌属于半知菌类、从梗孢目、瘤座孢科、镰刀菌属。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养，菌落突起絮状，菌丝白色质密。菌落粉白色，浅粉色至肉色。菌落高3～5mm，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。作为常见的致病菌，尖孢镰刀菌常在不同设施果蔬中引起枯萎病。例如，尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Hiveum(E.F.Smith)Wollen.)可通过破坏西瓜根系的膜系统，造成西瓜地上部分失水萎蔫；尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum,FOC)可侵入黄瓜的根颈部并寄生于维管束内，阻止水和养分的吸收，导致黄瓜植株萎蔫枯死；尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)可引起番茄的土传枯萎病。

由南方根结线虫(Meloidogyne incognita)引起的根结线虫病以及由致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的枯萎病严重危害设施果蔬生产，在实际生产中多依赖于化学手段对其进行防治，随之而来的抗药性、农药残留、环境污染等问题使得化学防治的弊端日益凸显。生物防治有着绿色、环保、可持续等诸多优点，而且在国家倡导“双减”的背景下，鼓励发展和运用生物防治的方法控制病害的发生。因此，为了适应绿色农业以及农业可持续发展的需求，筛选和应用有益微生物及其制剂来替代化学农药，成为当务之急。

发明内容

为满足上述领域存在的需求，本发明提供一株尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，该菌株对南方根结线虫和致病性尖孢镰刀菌均有很好的防治效果，具有较大的生防潜力和研究价值。

本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，菌株号为K2018-1418，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)的保藏号为CGMCC No.22445。下文简称为尖孢镰刀菌K2018-1418或K2018-1418菌株。

K2018-1418菌株具有序列表中SEQ ID NO:1所示的ITS序列。ITS(InternalTranscribed Spacer)是内转录间隔区，是位于真菌核糖体RNA(rRNA)基因转录区或对应多顺反子rRNA前体中大、小亚基rRNA之间的核酸序列。本发明采用通用引物ITS1/ITS4(SEQID NO:2和SEQ ID NO:3)扩增K2018-1418菌株的ITS区并进行序列分析，结果显示K2018-1418菌株的ITS序列与Fusarium oxysporum的ITS序列的同源性为99.81％。

在马铃薯-蔗糖固体培养基上28℃培养尖孢镰刀菌K2018-1418，第3天菌落直径为2.9±0.2cm，第4天菌落直径为3.9±0.6cm，第5天菌落直径为4.5±0.8cm，第6天菌落直径为5.2±1.0cm。培养7天后观察，尖孢镰刀菌K2018-1418的菌落突起絮状；气生菌丝呈白色至淡粉色，菌丝质密，培养皿背面呈橘黄色。尖孢镰刀菌K2018-1418在马铃薯-蔗糖固体培养基上28℃培养5天(16h光照：8h黑暗)后，制备分生孢子悬浮液并在显微镜下观察，可以看到较多的大型分生孢子和较少的小型分生孢子。其中大型分生孢子无色，镰刀形，略微弯曲，两端稍尖，多胞，大小为22.36～35.47μm×3.48～4.39μm；小型分生孢子无色，单胞，卵圆形或长椭圆形，大小为4.91～8.46μm×2.03～4.79μm。

尖孢镰刀菌K2018-1418的培养物或代谢产物也属于本发明的保护范围。所述培养物是将尖孢镰刀菌K2018-1418接种到培养基(固体培养基或液体培养基)中培养得到的物质，包含菌体及其代谢产物。所述代谢产物是指尖孢镰刀菌K2018-1418在代谢过程中产生的多种代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。

在本发明的一些实施例中，所述培养物是将尖孢镰刀菌K2018-1418接种到液体培养基中培养得到的发酵液；所述代谢产物是将所述发酵液过滤除菌后所得的滤液。将微生物接入液体培养基中培养一段时间后，微生物利用培养基中的营养成分合成菌体并分泌产物，这种经微生物代谢后的液体叫发酵液(包含菌体及其代谢产物)。

本发明还提供一种产品，含有尖孢镰刀菌K2018-1418或尖孢镰刀菌K2018-1418的培养物或代谢产物。

所述产品是预防和/或治疗植物根结线虫病的产品，或抑制致病性尖孢镰刀菌的产品。所述植物可以是双子叶植物或单子叶植物。在本发明的一些实施例中，所述植物是黄瓜。在本发明的一些实施例中，所述根结线虫病由南方根结线虫引起。

所述产品可以是固体菌剂或液体菌剂。所述产品的剂型可以是粉剂型、颗粒剂型或液体剂型。所述产品可以包含载体；所述载体为固体载体或液体载体；所述固体载体可以是矿物材料，例如草炭、粘土、滑石或高岭土，也可以是生物材料，例如秸秆、稻草、花生壳、玉米粉或豆粉；所述液体载体可以是水。所述产品中可以添加表面活性剂、稳定剂或pH调节剂。

制备所述产品的方法也属于本发明的保护范围。所述方法包括培养尖孢镰刀菌K2018-1418并将所述尖孢镰刀菌或其培养物或代谢产物作为活性成分制备所述产品。

在本发明的一些实施例中，按照如下方法培养尖孢镰刀菌K2018-1418：将尖孢镰刀菌K2018-1418接种到马铃薯-蔗糖固体培养基上，25～27℃培养6～8天，长出菌块；再从菌块上取菌饼，接种到YEPD液体培养基中，25～27℃振荡培养4～6天，得到发酵液。优选地，将尖孢镰刀菌K2018-1418接种到马铃薯-蔗糖固体培养基上，26℃培养7天，从长出的菌块上取5块7mm菌饼，接种到YEPD液体培养基中，26℃、150rpm振荡培养5天，得到发酵液。优选地，所述YEPD液体培养基含有蛋白胨10g/L、酵母提取物3g/L、葡萄糖20g/L。以上培养条件以及培养基配方有利于尖孢镰刀菌K2018-1418菌株正常生长，尽可能保持菌株的活性，从而提高其促生及抑菌代谢产物的产量。

在本发明的一些实施例中，所述产品为液体菌剂，其制备方法为：在液体培养基中培养尖孢镰刀菌K2018-1418，得到发酵液；用水稀释所述发酵液，得到液体菌剂。

尖孢镰刀菌K2018-1418或其培养物或代谢产物或所述产品在预防和/或治疗植物根结线虫病中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明的一些实施例中，所述植物为黄瓜；所述根结线虫病由南方根结线虫引起。

尖孢镰刀菌K2018-1418或其培养物或代谢产物或所述产品在抑制致病性尖孢镰刀菌中的应用也属于本发明的保护范围。

所述致病性尖孢镰刀菌包括但不限于尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporium f.sp.cucumerinum)和尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)。

本发明提供的尖孢镰刀菌K2018-1418，对南方根结线虫有明显的抑制作用，同时能够抑制致病性尖孢镰刀菌，且不影响寄主黄瓜的正常生长，具有良好的生防效果。经试验证明，K2018-1418菌株的发酵滤液对南方根结线虫的根结减退率达到96.44％，效果优于生防商品-淡紫拟青霉，与化学杀线剂-氟吡菌酰胺的防效相当；对致病性尖孢镰刀菌的防效为70.0％，效果优于生防商品-哈茨木霉，与氟环·咪鲜胺效果相当。

本发明提供的尖孢镰刀菌K2018-1418的保藏信息如下：

参椐的生物材料(株)：K2018-1418

分类命名：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)

保藏日期：2021年06月01日

保藏编号：CGMCC No.22445

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为尖孢镰刀菌K2018-1418的菌落形态图；其中A为菌落正面，B为菌落反面(培养皿底面)。

图2为尖孢镰刀菌K2018-1418的分生孢子形态图；其中呈镰刀形的是大型分生孢子，呈卵圆形或长椭圆形的是小型分生孢子；Bar＝50μm。

图3为尖孢镰刀菌K2018-1418对南方根结线虫的盆栽抑制试验结果，显示了不同处理下黄瓜苗的根结形成情况；图中从左到右依次为清水对照、尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液处理、氟吡菌酰胺悬浮剂处理、淡紫拟青霉菌液处理。

图4为尖孢镰刀菌K2018-1418对致病性尖孢镰刀菌的盆栽防效测试结果，显示了不同处理下黄瓜苗的植株状态；图中“只接清水”表示加入灭菌水100mL的处理(阴性对照)、“病原+哈茨木霉”表示接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和哈茨木霉菌液各50mL的处理、“病原+淡紫拟青霉”表示接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和淡紫拟青霉菌液各50mL的处理、“病原+K2018-1418”表示接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和K2018-1418发酵滤液各50mL的处理、“只接病原”表示接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和灭菌水各50mL的处理、“病原+多菌灵”表示接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和多菌灵溶液各50mL的处理、“病原+氟环·咪鲜胺”表示接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和氟环·咪鲜胺溶液各50mL的处理。

图5为尖孢镰刀菌K2018-1418对寄主黄瓜的安全性评价结果；图中“清水对照”表示用清水浸泡黄瓜幼苗的根部、“K2018-1418”表示用尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液浸泡黄瓜幼苗的根部、“致病-黄化萎蔫”和“致病-干枯”显示黄瓜幼苗黄化萎蔫和干枯的状态。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案进行详细描述。

以下实施例中的供试黄瓜品种为“中农6号”，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供。该品种记载在中华人民共和国农业行业标准NY/T 1857.8-2010中，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

以下实施例中使用的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)采集自河北省廊坊市，原生寄主为黄瓜，经“北卡罗来纳”鉴别寄主试验鉴定为1号小种，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

以下实施例中使用的菌株如下：

淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson)B2a菌株，购买自中国农业科学院中保绿农集团，农药登记证号：PD20152015。公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T-22菌株，购买自山东绿陇生物技术有限公司。公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

致病性尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporiumf.sp.cucumerinum)菌株，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所茆振川研究员提供。公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

以下实施例中使用的主要试剂：

氟吡菌酰胺悬浮剂：购买自拜耳作物科学公司，商品名为路富达，含41.7％氟吡菌酰胺。多菌灵：购买自中国农业科学院中保绿农集团，农药登记证号为PD85150-2。氟环·咪鲜胺杀菌剂：购买自中国农业科学院中保绿农集团，农药登记证号为PD20160066。

以下实施例中使用的培养基如下：

马铃薯-蔗糖固体培养基(PSA)，其配方为：马铃薯浸粉7.0g，蔗糖20.0g，琼脂20.0g，用蒸馏水定容至1L。

YEPD培养基，其配方为：蛋白胨10g、酵母提取物3g、葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1L。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1、尖孢镰刀菌K2018-1418的分离、纯化和鉴定

1、真菌的分离纯化

本发明的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)K2018-1418菌株是从河北省邯郸市的土壤样品中采用稀释平板法分离获得的。分离纯化的方法如下：

配制马铃薯-蔗糖固体培养基(PSA)，高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃、20min。配制氯霉素(用于抑制革兰氏阳性菌)母液和链霉素(用于抑制革兰氏阴性菌)母液，浓度分别为40mg/mL和300mg/mL。将两种抗生素母液按1:1的体积比混匀备用。待高压蒸汽灭菌后的PSA培养基温度降至50℃时，按1:1000的体积比将抗生素混合液加入PSA培养基内，摇匀后制作PSA抗性平板。

称取土壤样品10g，置入400mL烧杯中，加入90mL无菌水，充分搅拌，制备土壤悬浮液母液，然后制备200倍、400倍、1000倍稀释液，依次吸取200μL梯度稀释液，分别涂布于PSA平板上，将平板置于26℃恒温培养箱中，第4天开始调查记录菌落数，以菌落呈单个菌落状分布、数量在30～50之间、互不重叠为标准来确定最佳稀释倍数。结果显示，最佳稀释倍数为400倍。

将土壤悬浮液母液稀释400倍，吸取200μL土壤稀释液涂布于PSA抗性平板上，置于26℃培养箱中培养，待菌落长出，及时挑取单菌落于PSA抗性平板上，采用稀释涂布法和单菌落挑取法进行真菌的分离和纯化培养，共获得2402株待测菌株。分别测定待测菌株对南方根结线虫和致病性尖孢镰刀菌的防效，筛选到了一株能够明显抑制南方根结线虫、抑制致病性尖孢镰刀菌并且不影响寄主黄瓜正常生长的菌株，命名为K2018-1418菌株。

2、K2018-1418菌株的形态观察

菌株生长速度的测定：采用直径0.5cm打孔器取K2018-1418菌株的菌丝块，接种在马铃薯-蔗糖固体培养基(PSA)上，28℃倒置培养。设置3个重复。分别在第3天、第4天、第5天、第6天测定菌落直径，求平均数。如表1所示，培养到第3天，菌落直径为2.9±0.2cm；培养到第4天，菌落直径为3.9±0.6cm；培养到第5天，菌落直径为4.5±0.8cm；培养到第6天，菌落直径为5.2±1.0cm。培养7天后观察菌落形态，如图1所示，K2018-1418菌株的菌落突起絮状，气生菌丝呈白色至淡粉色，菌丝质密，培养皿背面均呈橘黄色。

表1 K2018-1418菌株的菌落生长情况

分生孢子形态的观察：采用直径0.5cm打孔器取K2018-1418菌株的菌丝块，接种在马铃薯-蔗糖固体培养基(PSA)上，28℃培养5天，每天16h光照：8h黑暗。用灭菌水涂洗菌落表面，得到分生孢子与菌丝的混合液，使用Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，滤液即为分生孢子悬浮液。用Olympus DP80显微镜观察分生孢子形态并拍照。结果如图2所示，K2018-1418菌株的大型分生孢子较多，小型分生孢子较少。其中大型分生孢子无色，镰刀形，略微弯曲，两端稍尖，多胞，大小为22.36～35.47μm×3.48～4.39μm；小型分生孢子无色，单胞，卵圆形或长椭圆形，大小为4.91～8.46μm×2.03～4.79μm。

3、K2018-1418菌株的分子鉴定

(1)K2018-1418菌株的DNA提取

将K2018-1418菌株接种到YEPD液体培养基中，25℃、160r/min摇床培养5d，发酵液经Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，收集滤液，12000r/min离心10min，收集菌体，然后采用Spin柱式DNA回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)按照试剂盒说明书记载的操作步骤提取菌体的基因组DNA。

(2)PCR扩增ITS区

以提取的基因组DNA为模板，利用引物ITS1/ITS4扩增K2018-1418菌株的ITS(Internal Transcribed Spacer)，对ITS进行DNA测序，将测序得到的ITS序列与已知真菌的ITS序列比对，从而获得K2018-1418菌株的种属信息。引物ITS1/ITS4的核苷酸序列如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR反应体系(50μL)为：10×Buffer 5μL、2.5mol/L dNTP 4μL、正向引物(10μmol/L)和反向引物(10μmol/L)各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板2μL，用灭菌水补足至50μL。PCR试剂均购自TaKaRa公司。

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

反应结束后，取8μL PCR产物，在1％琼脂糖凝胶内100V电泳30min，用紫外凝胶成像系统观察、拍照。

(3)测序和比对

使用DNA回收试剂盒(天根，DP209)进行PCR产物的回收和纯化，并将回收产物送中国农业科学院作物科学研究所进行测序。登陆NCBI网站，将测序结果(SEQ ID NO:1)与已知真菌的ITS序列进行BLAST分析。结果显示，K2018-1418菌株的ITS序列与Fusariumoxysporum的ITS序列的同源性为99.81％，因此将其鉴定为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

尖孢镰刀菌K2018-1418已于2021年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏号为CGMCC No.22445。

实施例2、尖孢镰刀菌K2018-1418对根结线虫病的盆栽防效测试

尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液的制备：在250mL锥形瓶中加入150mL马铃薯蔗糖液体培养基(PSB)(海博生物，货号：HB0233-8)。用直径0.5cm打孔器在尖孢镰刀菌K2018-1418的菌落近边缘处打孔，取4个菌饼加入锥形瓶中，26℃、150r/min摇床培养5d，发酵液经Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，收集滤液；取滤液100mL，加入300mL灭菌水稀释至4倍。

淡紫拟青霉菌液的制备：取淡紫拟青霉菌剂(农药登记证号：PD20152015)加入灭菌水稀释至500倍。

氟吡菌酰胺悬浮剂：拜耳-路富达，含41.7％氟吡菌酰胺。

卵液的制备：简单冲洗由南方根结线虫侵染黄瓜根部形成的黄瓜根结样品，切成1-2cm左右的小段，放入蓝盖瓶中，加入0.5％次氯酸钠溶液浸泡，剧烈摇晃3min；或者放入榨汁机中点动搅打3s，间隔5-10s，再次点动搅打，共3-5次；过套筛(20、60、200、500目)，因为500目筛选孔径小，网筛需要提前超声波处理，否则容易堵塞；将500目网筛移至流动的水下，冲洗掉次氯酸钠；收集500目网筛上的卵，加入无菌水制成卵液；在体视显微镜下调整卵液到指定浓度200-300卵/mL。

接卵：将河沙和营养土分别灭菌后按2:1的质量比混匀，得到灭菌土。将灭菌土装入透明塑料杯中，每个塑料杯装100mL。设置四种处理，分别使用清水(对照)、尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液、氟吡菌酰胺悬浮剂、淡紫拟青霉菌液浇灌灭菌土，浇灌量为40mL，浸润2-3h后移栽黄瓜苗，覆一层土；移栽黄瓜苗后，喷水定殖；在根系周围打三个孔，近根，深度为1-2cm；三个孔共接卵600-800卵/株，每个处理设置10个重复。

结果调查：依据清水对照的根结形成数量，在接卵后约30-40d后统计根结数量。计算各处理组的根结减退率。根结减退率＝[(对照根结数－处理根结数)/对照根结数]×100％。

表2 K2018-1418菌株对根结线虫病的盆栽防效测试

不同处理	根结数(个)	根结减退率(％)
			尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液	5	96.44
氟吡菌酰胺悬浮剂	2	98.58
			淡紫拟青霉菌液	10	92.88
清水对照	140.5	——

由表2可以看出，尖孢镰刀菌K2018-1418的发酵滤液对南方根结线虫的根结减退率达到96.44％，有明显的抑制作用，效果优于生防商品-淡紫拟青霉，略低于化学杀线剂-氟吡菌酰胺。不同处理下黄瓜苗的根结形成情况如图3所示。

实施例3、尖孢镰刀菌K2018-1418对致病性尖孢镰刀菌的抑菌活性及盆栽防效测定

1、K2018-1418菌株无菌发酵滤液抑菌活性测定

将90mL PSA培养基置于250mL三角瓶中，灭菌备用。将K2018-1418菌株接种到YEPD液体培养基中，25℃、160r/min摇床培养5d，发酵液经Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，收集滤液，12000r/min离心10min，取上清，使用0.22μm过滤器过滤得到K2018-1418无菌发酵滤液。以10mg/L多菌灵(农药登记证号：PD85150-2)和10mg/L氟环·咪鲜胺杀菌剂(农药登记证号：PD20160066)作为药剂对照。分别取10mL无菌发酵滤液/10mg/L多菌灵/10mg/L氟环·咪鲜胺杀菌剂，加入到90mL冷却至40℃的PSA培养基中，充分混匀后制成平板，并以添加等量无菌水的普通PSA培养基作为空白对照。

采用生长速率法测定K2018-1418菌株发酵滤液的抑菌活性：待PSA平板培养基冷凝后，将直径5mm的致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)的菌饼分别接种到含有K2018-1418无菌发酵滤液/多菌灵/氟环·咪鲜胺杀菌剂的平板中央，每种处理设置3个重复，置于26℃培养，每天16h光照：8h黑暗，第5天测量菌落直径(普通PSA对照菌落直径达到40mm以上时)，按下面的公式计算相对抑菌率。相对抑菌率(％)＝100×(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)。

表3 K2018-1418无菌发酵滤液抑菌活性的测定结果

不同处理	菌丝直径(cm)	相对抑菌率(％)
			K2018-1418无菌发酵滤液	4.93±1.29b	24.9
多菌灵	1.23±0.75a	90.6
			氟环·咪鲜胺	1.85±0.57a	79.6
PSA对照	6.33±0.25c	——

由表3可以看出，尖孢镰刀菌K2018-1418的无菌发酵滤液对致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)有一定的抑制作用，抑制率为24.9％。

2、K2018-1418菌株的发酵滤液对致病性尖孢镰刀菌的盆栽防效测定

K2018-1418发酵滤液的制备：将K2018-1418菌株接种在灭菌的YEPD液体培养基中，26℃、150r/min摇床培养5d，发酵液经Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，收集发酵滤液，稀释至4倍备用。

致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液的制备：活化致病性尖孢镰刀菌FO(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)并接种在灭菌的YEPD液体培养基中，26℃、150r/min摇床培养5d，发酵液经Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，收集滤液，3000r/min离心5min，弃上清液，用无菌水重悬孢子，获得孢子悬浮液，调整孢子浓度至10⁷CFU/mL。

哈茨木霉菌液的制备：取哈茨木霉菌剂(T-22菌株，绿陇生物)，加入灭菌水稀释至300倍。

淡紫拟青霉菌液的制备：取淡紫拟青霉菌剂(B2a菌株，农药登记证号：PD20152015)，加入灭菌水稀释至300倍。

多菌灵溶液的制备：取多菌灵(农药登记证号：PD85150-2)，加入灭菌水稀释至10000倍。

氟环·咪鲜胺溶液的制备：取氟环·咪鲜胺(农药登记证号：PD20160066)，加入灭菌水稀释至10000倍。

将长出两片真叶、长势健康的黄瓜幼苗，移栽至装有灭菌土的花盆中。移栽黄瓜幼苗5-7d后，将生长健康的黄瓜苗分为7组，每组10株。对7组黄瓜苗分别进行如下处理：(1)接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和K2018-1418发酵滤液，各50mL；(2)接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和淡紫拟青霉菌液，各50mL；(3)接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和哈茨木霉菌液，各50mL；(4)接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和多菌灵溶液，各50mL；(5)接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和氟环·咪鲜胺溶液，各50mL；(6)接种致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液和灭菌水，各50mL，作为阳性对照；(7)加入灭菌水100mL，作为阴性对照。

处理方法如下：采用灌根法，将致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液以及其他液体按照上述处理方式浇灌至黄瓜根部。30d后观察黄瓜苗的根部病情，并计算病情指数。评价标准：0级，根系生长健壮，无病症；1级，主根斜切面有褐色环，侧根颜色变深；2级，主根萎蔫，颜色变黑褐色且出现坏死，侧根大部分腐烂；3级，根系大部分坏死，颜色黑褐色，植株枯萎死亡。计算方法：病情指数＝100×∑(各级发病数×相应级别)/(调查总数×最高级数)。防治效果(％)＝100×(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数。

表4 K2018-1418发酵滤液对致病性尖孢镰刀菌的盆栽防效测定

处理方式	病情指数	防治效果(％)
			(1)病原+K2018-1418发酵滤液	14.3	70.0
(2)病原+淡紫拟青霉(PL)	9.5	80.0
			(3)病原+哈茨木霉(TH)	19.0	60.1
(4)病原+多菌灵(Car)	9.5	80.0
			(5)病原+氟环·咪鲜胺(Pro)	14.3	70.0
(6)只接病原(阳性对照)	47.6	——
			(7)只接清水(阴性对照)	0	——

注：表4中记载的“病原”代表致病性尖孢镰刀菌FO孢子悬浮液。

由表4可知，只接种致病性尖孢镰刀菌，黄瓜枯萎病的病情指数为47.6；接种致病性尖孢镰刀菌和多菌灵的处理，黄瓜枯萎病的病情指数为9.5，防效为80.0％；接种致病性尖孢镰刀菌和氟环·咪鲜胺的处理，病情指数为14.3，防效为70.0％；接种致病性尖孢镰刀菌和淡紫拟青霉的处理，病情指数分别为9.5，防效为80.0％；接种致病性尖孢镰刀菌和哈茨木霉的处理，病情指数为19.0，防效为60.1％；接种致病性尖孢镰刀菌和K2018-1418发酵滤液的处理，病情指数为14.3，防效为70.0％，效果优于哈茨木霉，与氟环·咪鲜胺效果相当。不同处理下黄瓜苗的植株状态如图4所示。

实施例4、尖孢镰刀菌K2018-1418对寄主黄瓜的安全性评价

1、发酵滤液的制备

将尖孢镰刀菌K2018-1418用无菌牙签接种到马铃薯-蔗糖固体培养基上，置于28℃培养7天；将培养好的尖孢镰刀菌K2018-1418接种至灭菌的YEPD液体培养基中，接种量为5块直径7mm的菌饼，26℃、150rpm培养5天，发酵液经Miracloth(Millipore，美国)过滤除去菌丝，得到尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液。

2、安全性评价

采用发酵液泡根法检测K2018-1418菌株对黄瓜的安全性。具体操作步骤如下：将长出两片真叶的黄瓜幼苗从穴盘中取出，流水冲净根部浮土，用剪刀剪下根部7-8mm造成伤口；将黄瓜幼苗的根部浸入发酵滤液中，同时以清水浸泡黄瓜幼苗的根部作为对照，5d后观察黄瓜幼苗症状，并拍照。评价标准：根据真叶状态，以萎蔫、黄化、干枯等为标准，将结果分为安全、致病-黄化萎蔫型、致病-干枯型等3个等级。

结果如图5所示，经过清水浸泡的黄瓜苗生长健康，无任何黄化、萎蔫或干枯现象；经过尖孢镰刀菌K2018-1418发酵滤液浸泡的黄瓜苗叶片颜色、状态正常，无任何黄化、萎蔫或干枯现象，与清水对照一致，因此尖孢镰刀菌K2018-1418不影响黄瓜正常生长，为安全菌株。

以上实施例只是本发明的部分实施例，而非全部实施例。上述实施例仅用于对本发明的技术方案进行解释和说明，而非用于限制本发明的保护范围。任何熟悉本领域技术的人员在本发明公开的技术范围内对上述实施例所做的修饰或改变，均应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）K2018-1418及其应用

<130> P210376-ZWB

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 672

<212> DNA

<213> 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)

<400> 1

gtcggggatc tacctgatcc gaggtcaaca ttcagaagtt ggggtttaac ggcgtggccg 60

cgacgattac cagtaacgag gtgtatgatt actacgctat ggaagctcga cgtgaccgcc 120

aatcgatttg gggaacgcgg gttaccgcga gtcccaacac caagctgagc ttgagggttg 180

aaatgacgct cgaacaggca tgcccgccag aatactggcg ggcgcaatgt gcgttcaaag 240

attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacttat cgcattttgc tgcgttcttc 300

atcgatgcca gaaccaagag atccgttgtt gaaagttttg atttatttgt ttgttttact 360

cagaagttcc actaaaaaca gagtttaggg gtcctcgggc gggccgtccc gttttacggg 420

gcgcgggctg atccgccgag gcaacgtata ggtatgttca caggggtttg ggagttgtaa 480

actcggtaat gatccctccg ctggttcacc aacggagacc ttgttacgat tttttacttc 540

ccacgagggg tgatgatctc tacaacgtgg ggggagatgg atttttgagc gtgccataca 600

cttacttgat tatgaatgat cccttccgca ggctcacgta acgtaacctt ggtacccttt 660

ttcaaattca aa 672

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (1)

1.尖孢镰刀菌K2018-1418在预防和/或治疗植物根结线虫病中的应用，其特征在于，所述尖孢镰刀菌K2018-1418的保藏号为CGMCC No. 22445，所述植物为黄瓜；所述根结线虫病由南方根结线虫引起。

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