CN108315268B - 一种淡紫拟青霉菌株及其应用 - Google Patents

一种淡紫拟青霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉菌株及其应用。本发明所提供的淡紫拟青霉菌株F26，它在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2017446。实验证明，以本发明的淡紫拟青霉菌株F26为主要功能菌的微生物菌剂具有显著的抗病虫害功效，该菌剂是以菌株为主要成分的生物制剂，替代了现有的化学农药制剂，可减少关于土壤的农药残留伤害；同时，淡紫拟青霉F26能够促进植物根系与植株的生长，对种子的萌发与生长也有促进作用，因此，本发明的淡紫拟青霉F26可应用于作物防虫防害及促生长相关产品的制备中。

Description

一种淡紫拟青霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉菌株及其应用。
背景技术
随着农业产业结构调整，以温室、大棚为主的设施农业发展迅速，由于多种原因作物重茬日益严重，有些保护地集中的地区，几年甚至十几年连续栽种同种作物，导致土传病害十分严重。土传病害是以土壤为媒介进行传播的植物病害的统称，指生活在土壤中的病原体，如真菌、细菌、线虫和病毒等在条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害，其中由线虫卵寄生引起的作物病害一直被广受关注。
淡紫拟青霉是土壤中多种植物根系的习居菌，是目前应用最广泛的线虫卵寄生真菌，能够有效防治根结线虫和胞囊线虫，对南方根结线虫的卵寄生率高达60％～70％。已有研究证明，淡紫拟青霉对多种线虫都有防治效果，包括根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫。
淡紫拟青霉对线虫卵的防治机理：线虫卵在胚胎发育早期最易受感染，菌丝或分生抱子可直接穿刺进入，菌丝能顺利地在根结线虫卵囊内生长，包围卵粒进而侵染卵，菌丝与卵接触后在线虫表面产生特殊的结构一附着胞，利用机械压力和真菌胞外分泌儿丁质酶和蛋白酶将卵壳的儿丁质层消解，蛋白降解，进而进行侵染，侵入卵内并向四周扩展,直到胚胎完全被菌丝取代。由于该菌可适应不同的气候条件，对线虫卵具有较高的寄生率，可以有效控制土壤线虫数量，明显减少危害。
淡紫拟青霉不仅能够防治线虫寄生引起的病害，而且其发酵过程中产生的衍生物，如类似吲哚乙酸产物，具有类似生长素和细胞分裂素的作用，能够促进植物根系与植株的生长，因此在植物根系施菌不仅能明显抑制线虫侵染，而且能促进植株营养器官的生长，同时对种子的萌发与生长也有促进作用。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种具有生防和促生长功能的淡紫拟青霉F26，本发明另一方面提供了一种以上述淡紫拟青霉F26为主要功能菌的微生物菌剂，此菌剂具有生物防病防虫的功能，田间试验证实，此菌剂还具有促进作物生长以及提高产量的功效。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的淡紫拟青霉菌株，具有生防和促进作物生长的特性。该淡紫拟青霉菌株在2017年8月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其提议的分类命名为淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)，保藏编号为CCTCC NO：M2017446。保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)。
进一步地，所述淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)的28SrRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种具有生防和促进作物生长功能的菌剂，所述菌剂以上述的淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)为主要功能菌。
进一步地，所述菌剂中淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)的活菌含量为5.0×108～5.0×1010CFU/g。
本发明最后提供了一种以淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)为主要功能菌的菌剂的应用，所述菌剂应用于作物的生物防病防虫和促进作物生长。
进一步地，所述菌剂是应用于防治根结线虫。
本发明的有益效果：本发明的紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)具有显著的抗病虫害功效，同时本发明的微生物菌剂是以菌株为主要成分的生物制剂，替代了现有的化学农药制剂，可减少关于土壤的农药残留伤害；本发明的淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)能够促进植物根系与植株的生长，对种子的萌发与生长也有促进作用，因此，本发明的淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)可应用于作物防虫防害及促生长相关产品的制备中。
附图说明
图1为初筛7株菌对根结线虫卵孵化的相对抑制率；
图2为初筛7株菌对根结线虫卵活性的校正死亡率；
图3为复筛3株菌不同浓度稀释发酵产物对根结线虫卵孵化的相对抑制率；
图4为紫拟青霉F26在培养基中培养3天后的菌落外观图；
图5为显微镜观察的紫拟青霉F26分生孢子的形态图；
图6为紫拟青霉F26的扩增片段示意图；
图7为紫拟青霉F26系统发育树示意图；
图8为紫拟青霉F26菌剂生产工艺路线图；
图9为实施例3中不同试验组稻田中线虫总数差异示意图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：
1.菌株的分离纯化
土壤样品来自武汉合缘绿色生物股份有限公司虾稻连作合作项目地。
多点采集患病水稻的地下部分，连带根系周围1cm范围的土壤，放入样品袋中。经阴干后，采用四分法将样品缩分至约50g左右，然后置于含有灭菌PB缓冲液的500ml三角瓶(装量200ml)中，加入2ml吐温-80；30℃、180rpm震荡30min，静置沉淀(或1500rpm～3000rpm离心5min)，取上清液；取10ml上清液，经15～25℃、8000rpm～20000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀悬浮于50ml灭菌PB缓冲液中再次15～25℃、8000rpm～20000rpm离心10min；重复两次以后，将沉淀悬浮于10ml的无菌水中，制得土壤悬浮液。将此悬浮液稀释至合适梯度后涂布于孟加拉红培养基平板上，28℃±2℃倒置培养；挑取菌丝生长迅速、产孢能力强的不同形态菌落分别进行分离纯化，将纯化后的菌株编号并保存于PDA斜面。此次共分离纯化出35株不同的菌株,分别编号为F1～F35。
菌株分离纯化所用的孟加拉红培养基配方为：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁(七水)0.5g/L，氯霉素0.1g/L，1/3000孟加拉红溶液100ml/L，琼脂15—20g/L，pH7.2；
PDA培养基配方为：200g马铃薯浸提液，蔗糖20g，琼脂15—20g，定容于1000ml。
2.防根结线虫菌株的初筛
收集分离纯化出的35株不同的菌株分别接种在1/4SDAY平板培养基上进行培养一周，收集在1/4SDAY上培养的成熟分生孢子，用色拉油分散，分别添加4％的与真菌活力兼容的乳化剂，配置成终浓度为5.0×108个孢子/mL的油孢子悬浮液，接种在线虫幼虫。按点滴法每头试虫用微量点滴器点滴药剂10μL，每组接种30头，接种后在室温28℃、湿度30-50％的条件下饲养，各处理设一对照，对照实验由同浓度的色拉油和乳化剂代替油孢子悬液接种。每天定时观察，记录根结线虫的孵化数和死亡数，从而计算每种菌株对根结线虫的相对抑制率和校正死亡率。其中根结线虫幼虫获得方式为：从水稻根部根结或者土壤中挑取根结线虫虫卵的卵囊，0.5％次氯酸钠消毒2min，无菌水冲洗3次；重复一次后，置于25℃无菌水中孵化2龄幼虫。每天及时更换处理液并收集新孵化出的2龄幼虫；相对抑制率和校正死亡率的计算公式如下：
Figure BDA0001643878490000051
Figure BDA0001643878490000052
经过初步筛选得到的7株菌对根结线虫卵孵化率的影响如图1所示，对根结线虫卵活性的影响如图2所示。经过处理24h后，对根结线虫校正致死率达到90％以上的菌株有F5、F13、F26和F12；处理48h后，菌株F5校正死亡率已达到100％，菌株F13次之达到99.38％，菌株F26为98.61％。
3.防根结线虫菌株的复筛
对初筛得到的3株菌(F5、F13、F26)进一步发酵处理，并将发酵液按一定比例稀释接种于线虫幼虫，测定发酵液对线虫的活性影响，结果如表1所示，发酵液进行稀释后对线虫虫卵孵化的影响如图3所示。
表1菌株不同稀释度发酵产物对根结线虫的致死率
Figure BDA0001643878490000061
表1显示随着稀释倍数的增加，各菌株的杀根结线虫活性逐渐下降，但菌株F13和F26下降不明显；在处理48h稀释20倍条件下，菌株F5对根结线虫的校正死亡率由原液条件下的100％下降至87.81％，而菌株F13和F26仍维持在93％以上；在处理24h稀释20倍条件下，菌株F5对根结线虫的校正死亡率由原液的100％降至71.15％，相对略高于菌株F13和F26。
图3为菌株不同稀释度的发酵产物对根结线虫虫卵孵化的影响示意图，随着稀释倍数的增加，三株菌(F5、F13、F26)发酵产物对根结线虫卵孵化的抑制率逐渐下降，其中F26菌株下降趋势最小，菌株F13下降趋势最明显。对根结线虫卵孵化抑制率最高的菌株为F26，其原液的相对抑制率达到96.67％，在20倍稀释条件下，抑制率仍达到86.67％，具有较大的生防潜力。
4.菌株F26的形态及ITS鉴定
(1)形态学鉴定
从图4可知，菌株F26在PDA培养基平板上培养7d后，直径可到1.5-2.5cm；菌落初期为白色，菌丝质地疏松，后由白色渐变为淡紫色至灰紫色，有渗出液；菌落背面为紫红色。
显微镜下观察(如图5)菌株F26菌丝有隔，自气生菌丝生出，单个小梗或一簇小梗直立于菌丝上，小梗基部膨大，上部较为尖细，约1.5-2.0μm×9.0-15.0μm；其上产生分生孢子，在分生孢子梗上呈长链状，3.0-5.0μm×10.0-13.5μm。孢子光滑，卵圆形或球形，2.5-3.0μm。
(2)分子生物学鉴定
挑取菌株F26菌丝0.5g于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉倒入离心管中。CTAB法提取菌株F26的DNA。利用真菌通用引物ITS4和ITS5进行PCR特异扩增，获得ITS序列产物经电泳检测，其目的片段大小约为550bp(见图6)。经过测序，根据测序结果可知菌株F26的序列全长为545bp，符合预期长度。通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.bov/BLAST)同源性比对，菌株F26与GeneBank中的淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)序列同源性最高。从NCBI中选取6个已知菌属作为外围群和同属的9个菌株做同源性分析，利用Cluxtal X和MEGA4软件采用Neighbor-Joining(N-J)法构建系统发育树，结果显示(见图7)菌株F26与7株淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)处于同一分支，可行度高达100％。结合形态学观察结果，判定菌株F26为淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)。并于2017年8月21日送交湖北省武汉市武汉大学内中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：M2017446。
实施例2：淡紫拟青霉F26的微生物菌剂的制备
淡紫拟青霉对营养条件要求不高，所以在发酵条件优化的时候采用农副产品作为发酵的主要原料。本研究以麸皮、玉米粉、豆饼粉为主要原料，以米糠为辅料，无机盐选择碳酸钙、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰以及硝酸钠。采用3因子4水平和6因子2水平的混合正交来设计试验，从试验结果得出，影响发酵结果主要因素排序为玉米粉＞豆饼粉＞麸皮＞米糠＞硫酸铵＞硫酸锰。磷酸二氢钾、硝酸钠对发酵的影响不是很大，而硫酸锰添加后会抑制孢子的产生。通过分析得出培养基的优化组合为：玉米粉5％，麸皮10％，豆饼粉10％，硫酸铵0.5％，米糠74.5％。采用液体接种方法，以2％的接种量进行发酵，最终的孢子产量可以达到1.33×1010CFU/g。
将发酵料过振动筛，收集孢子，阴干水分，与处理好的河沙混合，最终制成50亿/g的微生物菌剂成品，淡紫拟青霉F26的微生物菌剂工艺路线如图8所示。
实施例3：微生物菌剂的应用效果
1.淡紫拟青霉F26菌剂对稻田中线虫的防治效果
本试验在武汉合缘绿色生物股份有限公司合作农户水稻田里面进行，该土地水稻连作，其基本理化指标如表2：
表2试验地基本理化指标
Figure BDA0001643878490000081
水稻品种为丰两优1号，为中稻品种。稻田施肥如下述：每亩施用复合肥料75kg，有机肥100kg。每个试验小组的面积为200m2，水稻种植采用人工插秧的方式进行。株密度为28cm×16cm，亩插秧丛数1.8万丛。单质化肥分基肥、分蘖肥和穗肥施入，施入比例为6:3:1。有机肥和复合肥作为基肥形式一次性施入。
本试验中，实验组使用“实例2”中制备的淡紫拟青霉F26菌剂成品(50亿/g)。试验分为五个小组，不同量的淡紫拟青霉F26菌剂均以和基肥混合的方式施入稻田，S1实验组施入5kg/亩；S2实验组施入10kg/亩；S3实验组施入20kg/亩；S4实验组施入40kg/亩；S5实验组为对照组，不施用菌剂产品。除了使用菌剂与否以及菌剂用量区别外，五个实验组的田间管理均相同。
统计稻田中土壤线虫总数(如图9所示)，最少的S4实验组为247条，最多的S5实验组多达376条。施用不同用量的淡紫拟青霉F26菌剂以后，均表现出了线虫数量减少的趋势，并且随着施用量的增加，减少的趋势愈发明显。如果能够连续的使用淡紫拟青霉F26菌剂进行预防，可以进一步的减少土壤中的线虫数量。
2.淡紫拟青霉F26菌剂对番茄根结线虫的防治效果
本试验中，实验组使用“实例2”中制备的淡紫拟青霉F26菌剂成品(50亿/g)，每亩施用2kg，对照组不施用。两组使用同样的基肥和田间管理。
植株分级方法：
0级：根系无根结 1级：有根结数占比0％—25％
3级：有根结数占比26％—50％ 5级：有根结数占比51％—75％
7级：有根结数占比76％—100％
试验分别在三个临近的乡镇(a乡、b乡和c乡)进行。结果如表3：
表3施用淡紫拟青霉菌剂产品对番茄根结线虫的效果
Figure BDA0001643878490000091
Figure BDA0001643878490000101
从上表中可以看出，施用淡紫拟青霉F26菌剂的实验组中，0级的番茄苗数量增加明显，说明施用淡紫拟青霉F26菌剂可以有效抑制根结线虫侵染番茄苗。
3.淡紫拟青霉F26菌剂对水稻种子发芽的促进作用
将淡紫拟青霉F26菌剂用无菌水制成不同浓度的稀释液(1:1000，1:500，1:300，1:100，1:50)，加到平皿内的滤纸上至饱和，每种浓度设三次重复，对照组采用清水保湿。
表4不同浓度淡紫拟青霉F26菌剂对水稻种子发芽的影响
Figure BDA0001643878490000102
从表中可以看出，不同浓度的淡紫拟青霉F26菌剂对于水稻种子的发芽速度和发芽率均和CK组无明显差异，说明淡紫拟青霉F26菌剂不影响水稻种子的发芽速度和发芽率。但是淡紫拟青霉F26菌剂对芽的伸长速度有明显的作用，1:1000，1:500，1:300实验组对芽的伸长有促进作用，其中浓度为1:1000和1:500两个实验组最明显，而后随着稀释度的降低，这种促进作用逐渐降低，至1:50实验组中则有明显的抑制芽伸长效果。说明淡紫拟青霉F26菌剂在低浓度的时候有利于芽的生长伸长，而高浓度则会对芽的生长产生抑制作用。
4.淡紫拟青霉F26菌剂对水稻生长的促进作用
本试验在武汉合缘绿色生物股份有限公司合作农户水稻田里面进行，该土地水稻连作，其基本理化指标如表5所示。
表5试验地基本理化指标
Figure BDA0001643878490000111
试验水稻品种为丰两优1号，为中稻品种。稻田施肥如下述：每亩施用复合肥料75kg，有机肥100kg。每个试验小组的面积为200m2，水稻种植采用人工插秧的方式进行。株密度为28cm×16cm，亩插秧丛数1.8万丛。单质化肥分基肥、分蘖肥和穗肥施入，施入比例为6:3:1。有机肥和复合肥作为基肥形式一次性施入。
试验分为五个小组，不同量的淡紫拟青霉菌剂均以和基肥混合的方式施入稻田，S1实验组施入5kg/亩；S2实验组施入10kg/亩；S3实验组施入20kg/亩；S4实验组施入40kg/亩；S5实验组为对照组，不施用菌剂产品。除了使用菌剂与否以及菌剂用量区别外，五个实验组的田间管理均相同。
表6不同实验组水稻农艺性状的差异
Figure BDA0001643878490000112
Figure BDA0001643878490000121
由表6可以看出，淡紫拟青霉F26菌剂有助于增加穗长、穗粒数、实粒数和千粒重，降低空秕粒。其中S3实验组与对照S5实验组相比，穗长增加了5.85％，株高增加了1.67％，穗粒数增加了6.91％，实粒数增加了18.35％，千粒重增加了2.78％。
表7不同实验组水稻成熟期地上部分干物质的差异
Figure BDA0001643878490000122
从表7中可知，对比秸秆生物产量和籽粒生物产量数据后可以发现，施用淡紫拟青霉F26菌剂的实验组均高于对照实验组，说明淡紫拟青霉F26菌剂对水稻的生长有促进作用，并且可以通过提高秸秆物质累计和籽粒物质累计来实现的。同时我们发现，淡紫拟青霉F26菌剂不同用量对水稻产量也很有影响，随着施用量的增加，总生物产量呈增加趋势，但是超过一定量以后，总生物产量反而降低。
序列表
<110> 武汉合缘绿色生物股份有限公司
<120> 一种淡紫拟青霉菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 545
<212> DNA
<213> 淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)
<400> 1
aacccactgt gaaccttacc tcagttgcct cggcgggaac gccccggccg cctgcccccg 60
cgccggcgcc ggacccaggc gcccgccgca gggaccccaa actctcttgc attacgccca 120
gcgggcggaa tttcttctct gagttgcaca agcaaaaaca aatgaatcaa aactttcaac 180
aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga 240
attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagcattctg 300
gcgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcgagcc cccccggggg cctcggtgtt 360
gggggacggc acaccagccg cccccgaaat gcagtggcga ccccgccgca gcctccctgc 420
gtagtagcac acacctcgca ccggagcgcg gagccggtca cgccgtaaaa cgcccaactt 480
tcttagagtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcca tatcaataaa 540
gccgc 545

Claims (5)

1.一种淡紫拟青霉菌株，其特征在于：所述淡紫拟青霉菌株在2017年8月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其提议的分类命名为淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinusF26)，保藏编号为CCTCC NO：M2017446。
2.根据权利要求1所述的一种淡紫拟青霉菌株，其特征在于：所述淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)的28SrRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种具有防治根结线虫和促进水稻生长功能的菌剂，其特征在于：所述菌剂以权利要求1所述的淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)为主要功能菌。
4.根据权利要求3所述的具有防治根结线虫和促进水稻生长功能的菌剂，其特征在于：所述菌剂中淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)的活菌含量为5.0×108～5.0×1010CFU/g。
5.一种以淡紫拟青霉F26(Paecilomyces lilacinus F26)为主要功能菌的菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂应用于防治根结线虫和促进水稻生长。
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