CN103484399B - 一株植物内生细菌sh-1及其应用 - Google Patents

一株植物内生细菌sh-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株植物内生细菌SH-1及其应用，属植物保护技术领域。本发明的生产菌株变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）SH-1，已于2013年8月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2013367。该植物内生细菌SH-1作为制备用于防治由链格孢引起的烟草赤星病、甘蓝黑斑病、番茄早疫病制剂的应用。本发明具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点，对烟草赤星病菌、甘蓝黑斑病菌、番茄早疫病菌的生长有显著抑制效果，对由链格孢菌引起的烟草赤星病、甘蓝黑斑病、番茄早疫病有显著地防治效果。

Description

一株植物内生细菌SH-1及其应用
技术领域：
本发明涉及一株植物内生细菌SH-1及其应用，属植物保护技术领域。
背景技术：
链格孢，是半知菌的一个属，是全球分布最广，经济上重要的半知菌类真菌之一。95%以上的种类兼性寄生于植物上，引起多种植物病害，造成田间和产后巨大的经济损失是一些植物主要病害之一，如烟草赤星病，番茄早疫病，白菜黑斑病等都是由链格孢属真菌引起。
烟草赤星病（Alternaria alternata(Fries)Keissler）是烟草上的一个重要真菌性病害，在各烟草区均有发生，该病具有潜育期短、流行速度快的特点，主要在大田生长后期发生流行，是威胁各地烟叶生产的一个主要病害之一。病菌以菌丝体在病残体上越冬，翌年产生分生孢子，借气流传播进行初侵染，种子和移栽苗也能成为田间初侵染源。受初侵染病部长出分生孢子进行再侵染。烟株有明显的抗病阶段，幼苗期较抗病，叶片在旺长期至成熟期较感病。烟草赤星病发病适温25—30℃，雨日多、湿度大是病害流行的重要因素。种植密度大、田间通风透光不良、采收不及时发病重，过多施用氮肥、追肥过晚、移栽迟也会发病较重。
甘蓝黑斑病由半知菌亚门链格孢（Alternaria oleracea M.Ibrath）真菌所致。病菌分生孢子的萌发适温为28－31℃，菌丝生长适温为25－27℃。病菌主要以菌丝体及分生孢子在病残体上、土壤中、采种株上以及种子表面越冬，成为田间发病的初侵染来源。分生孢子借风雨传播扩大蔓延为害。土壤瘦瘠、耕作粗放、田园卫生管理差，杂草丛生、尤其是在生长中后期肥力不足，植株长势差，抗病性削弱，都能诱发病害的流行。
番茄早疫病又称为“轮纹病”，在番茄上普遍发生。早疫病是由茄链格孢菌(Alternaria solani)侵染所致，菌丝可在1-45℃的广泛温度范围中生长，在26－28℃时，生长最快。侵入寄主后，2－3天就能形成病斑。形成病斑后3－4天，在病斑上就能形成大量的分生孢子。由此而进行多次重复再侵染。肥力差、管理粗放的地块发病重。另外土质粘重者比土质砂性强的地块发病重。
目前对有链格孢引起的病害防治方法使用化学药剂，如纹枯利、多菌灵、多抗霉素、菌核净及扑海因、百菌清等。长期施用这类化学药品，病原产生抗药性，导致防治效果差，甚至难以控制病原菌危害与发展。另外过多施用化学药剂，造成农药残留和环境污染，对人畜极不安全，甚至直接危害非靶标微生物，直接影响生态环境。而生物防治对烟草及蔬菜安全生产及可持续性发展具有极大的应用前景，是有前途的方法。
发明内容：
本发明的在于提供一株植物内生细菌SH-1及其应用。
本发明的生产菌株变栖克雷伯菌SH-1（Klebsiella variicola SH-1），已于2013年8月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2013367。保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心。
本发明的植物内生细菌SH-1作为制备用于防治由链格孢引起的烟草赤星病、甘蓝黑斑病、番茄早疫病制剂的应用。
本发明的植物内生细菌SH-1，用常规方法分离自铁皮石斛茎秆，经形态、生理生化特征鉴定及16S rDNA序列分析，确定SH-1克雷伯氏菌属变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。
本发明的优点在于：具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点；对烟草赤星病菌、甘蓝黑斑病菌、番茄早疫病菌的生长有显著抑制效果；对由链格孢菌引起的烟草赤星病、甘蓝黑斑病、番茄早疫病有显著地防治效果。
具体实施方式：
一、菌株的获得
本发明菌株的获得方法为常规方法，具体如下：
新鲜铁皮石斛茎秆采自德宏，灭菌水洗净晾干后切成小段（1cm），用70%乙醇表面消毒5min，然后灭菌水漂洗3次，采用无菌操作技术纵向剖开茎秆，将剖开的茎秆置于马铃薯葡萄糖液体培养基中30℃培养7天，取培养所得的菌液1mL，加到盛有9mL无菌水的试管中，30℃摇床振荡培养20min，制成样品悬浮液。取1mL悬浮液加入盛有9mL无菌水的试管中进行10倍系列稀释，选择10-5-10-7的稀释液分别取0.1mL，在PDA平板上采用稀释涂布法分离纯化，30℃培养12-24h，挑取菌落形态不同的单菌落于PDA培养基平板上培养并保存备用。
筛选：将病原接种在PDA培养基平板中心，用已分离纯化出的细菌做成菌悬液，取100uL菌悬液置于中心四周，28℃培养观察对峙培养抑菌情况。将抑制效果明显的细菌进行形态、生理生化鉴定和16S rDNA分析。
形态鉴定：LB固体培养基上纯化培养细菌，观察菌落形态、菌体形态。
生理生化鉴定：参照常用细菌鉴定手册，采用吲哚试验、V-P试验、H2S试验等对分离出的细菌进行生理生化检测。
16S rDNA序列测定：采用CTAB/NaCl法提取SH-1基因组DNA。用于扩增的引物为16S rDNA扩增通用引物，27F：5′-AGAGTTTTATCNTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增所得PCR产物有上海生工测序，测得的序列与Genbank中已有的16S rDNA序列进行同源性比对。
表1.SH-1菌株鉴定的形态及生理生化特征
通过提取SH-1菌株基因组DNA，16S rRNA基因扩增及测序分析，SH-1的DNA序列与Klebsiella variicola strain ALK036（KC456523.1）、Klebsiellavariicola strain ALK032（KC456522.1）、Klebsiella variicola strain h-8（KC139428.1）16S rRNA基因具有的99%核苷酸序列同源性，结合生理生化试验，我们将该菌株鉴定为Klebsiella variicola SH-1。
二、生防菌剂的制备
生防菌剂的获得方法为常规方法，具体如下：
1、将SH-1菌株接种到LB培养液中30℃培养200rpm振荡培养，12小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2、当培养至OD值在0.65～0.75之间时，将种子菌液以1：100体积比加入LB培养液中，30℃250rpm振荡培养24小时。然后6000rpm离心10min，每1000mL培养液获得约15g菌体，每克菌体含4×1013～1015个菌。取菌体与保藏液按1g：40ml配成菌剂。菌体保藏液为0.5%吐温-80生理盐水。
上述生防菌剂用于防治烟草赤星病、甘蓝黑斑病、番茄早疫病等真菌性病害。
三、实施方法
（1）SH-1平板拮抗试验
选择供试病原菌烟草赤星病菌、甘蓝黑斑病菌、番茄早疫病菌。将PDA培养基（葡萄糖20g/L，去皮马铃薯200g/L，琼脂18g/L,pH自然）每20mL倒入9cm直径的培养皿中。待冷却凝固后，接种病原菌于PDA平板中央，牙签接种SH-1均匀置于距离平板中心2cm的四周，72h后记录观察抑菌圈环径。
（2）温室试验
培养基质中播种烟，甘蓝，番茄，选长势一致的植株移栽到花盆进行试验。盆栽试验共设三个处理：A、生防菌剂SH-1；B、40%菌核净可湿性粉剂（河南倍尔农化有限公司）；C、空白对照。重复4次。将SH-1菌剂稀释浓度至1x108CFU/mL后喷雾使用，7天后，将病原菌分生孢子稀释浓度为1x107CFU/mL喷雾接种。
（3）温室大棚试验
田间试验共设三个处理：A、生防菌剂SH-1；B、40%菌核净可湿性粉剂（河南倍尔农化有限公司）；C、空白对照。每个小区14m2，小区间设三行隔离区，各处理按完全随机区组排列，重复4次，全试验共12个小区。试验前按试验方案分好小区，开好隔离沟，每亩使用量为1000毫升109CFU/ml的生防菌剂SH-1。分别统计各种病害的病害严重度，并且计算防效。
试验结果：
（1）生防菌SH-1拮抗病原菌试验结果：生防SH-1菌对烟草赤星病、甘蓝黑斑病以及番茄早疫病显示较好的平板抑制效果。
（2）温室试验表明：生防菌SH-1在温室内对对烟草赤星病（表1）、甘蓝黑斑病（表2）以及番茄早疫病（表3）的防效在70%以上，对病原菌起到了很好的控制作用。
（3）田间试验表明：生防菌SH-1对生防菌SH-1在温室内对烟草赤星病（表4）、甘蓝黑斑病（表5）以及番茄早疫病（表6）都有较好的抗病效果。
表1：生防菌剂SH-1对烟草赤星病的温室防治效果
药剂名称 病害严重度% 防治效果%
制剂SH-1 22.35 73.23
40%菌核净 25.32 69.67
空白对照 83.49 —
表2：生防菌剂SH-1对甘蓝黑斑病的温室防治效果
药剂名称 病害严重度% 防治效果%
制剂SH-1 19.96 74.88
40%菌核净 23.32 70.65
空白对照 79.45 —
表3：生防菌剂SH-1对番茄早疫病的温室防治效果
药剂名称 病害严重度% 防治效果%
制剂SH-1 24.53 70.24
40%菌核净 28.74 65.13
空白对照 82.43 —
表4：生防菌剂SH-1对烟草赤星病的田间防治效果
药剂名称 病害严重度% 防治效果%
制剂SH-1 27.57 66.14
40%菌核净 32.21 60.44
空白对照 81.43 —
表5：生防菌剂SH-1对甘蓝黑斑病的田间防治效果
药剂名称 病害严重度% 防治效果%
制剂SH-1 27.12 66.74
40%菌核净 30.02 63.18
空白对照 81.54 —
表6：生防菌剂SH-1对番茄早疫病的田间防治效果
药剂名称 病害严重度% 防治效果%
制剂SH-1 26.31 66.98
40%菌核净 27.21 65.85
空白对照 79.68 —
SEQUENCE LISTING
 
<110>  云南省烟草公司曲靖市公司；云南农业大学
 
<120>  一种生防菌用于防治真菌病害
 
<130>  PatentIn version 3.5
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
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<211>  1441
<212>  DNA
<213>  Klebsiella variicola
 
 
<220>
<221>  rRNA
<222>  (1)..(1441)
<223>  16S rRNA gene
 
<400>  1
ttgcggcggc ctaccatgca gtcgagcggt agcacagaga gcttgctctc gggtgacgag       60
 
cggcggacgg gtgagtaatg tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa      120
 
cggtagctaa taccgcataa cgtcgcaaga ccaaagtggg ggaccttcgg gcctcatgcc      180
 
atcagatgtg cccagatggg attagctggt aggtggggta acggctcacc taggcgacga      240
 
tccctagctg gtctgagagg atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc      300
 
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg      360
 
cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa gcactttcag cggggaggaa ggcggtgagg      420
 
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gttgcaaaag aagtaggtag cttaaccttc gggagggcgc taccactttt attattggtc     1440
 
g                                                                     1441

Claims (2)

1.一株植物内生细菌变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株，特征在于该菌株于2013年8月8日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2013367。 
2.权利要求1所述菌株在制备用于防治由链格孢引起的烟草赤星病、甘蓝黑斑病、番茄早疫病制剂中的应用。 
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