CN102199563A - 一种防治植物病害的生防菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治植物病害的生防菌及其制备方法。主要内容包括：（1）Bacillussp.CC09（芽孢杆菌CC09菌株）的分离与鉴定；（2）芽孢杆菌CC09菌株生防菌剂的制备及其防治植物病害的应用；（3）芽孢杆菌CC09生防菌剂的稳定性。芽孢杆菌CC09生防菌剂具有杀菌谱广、效果持久、病害不易产生抗药性、对人、畜、农作物安全和环境友好等特点，对禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）、链格孢菌（Alternariaalternata）、水稻立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）和辣椒疫霉（Phytophthoracapsici）等的生长有显著的抑制活性，特别对小麦白粉病和赤霉病有显著的防治效果。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治植物病害的生防菌及其制备方法。
背景技术
21世纪人类面临着许多挑战，而主要问题之一是人口与粮食问题。我国人口占世界总人口的四分之一，但耕地只有世界耕地的6.8%，这个问题在我国尤其突出。因此，提高粮食产量是我国关系民生的战略任务。但据调查，世界主要粮食作物和经济作物每年因病害损失20%(Oerke et al,1994.Crop Protection and Crop Production.Elsevier,Amsterdam,808pp)。我国粮食作物因病害而损失至少 10-15%，如果完全不使用杀菌剂，正常年份的黄瓜损失约为55％～75％、萝卜为40％、甘篮为25％、苹果为30％，甜菜为24％(陈万义,1998.植物保护24(5):33-36)。由此可见杀菌剂在粮食作物和经济作物中的重要地位。事实上，如果没有杀菌剂的使用，世界上的作物将有一半在现有条件下不能栽种。
目前农业生产上应用的杀菌剂多为化学合成物。化学合成杀菌剂虽具有防效较高和应用方便的优势，但存在如下缺点： 
抗性问题严重：特别是植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗性产生的速度快、抗性水平高。一般应用3年左右，植物病原真菌就可对其产生抗性。据报道已有46种病原真菌对苯菌灵产生了较高的抗性(Gullino et al,2000.Crop Protection 19:1-11)。
研制新品种杀菌剂的费用昂贵：由于对杀菌剂的要求越来越严格，新品种杀菌剂的研制费用也越来越大。在美国每研究开发成功一个新品种的杀菌剂需要研究20000多个化合物，花费约0.8～l亿美元(Leroux,1996,Pestic. Sci. 47:191-197)。
环境污染：虽然化学合成杀菌剂较化学合成杀虫剂对人蓄的危害要小一些，但化学合成杀菌剂也有致癌作用，对野生和非靶标生物有毒等缺点，环境相容性差。因此，在推行的无公害农药和可持续农业生产的今天，开发和研制不易产生抗性的、较少引起污染的环境友好型生物杀菌剂已成为农药发展的必然趋势。
相对于化学合成杀菌剂，生物防治剂和天然产物的使用具有更加诱人的前景，特别是微生物杀菌剂。一方面微生物是地球上最庞大的生物类群，具有广泛的生物多样性，还可通过生物工程技术大幅度提高目标物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物杀菌剂(活的微生物及其培养物)较化学农药更加安全，易降解，合成成本较低。目前报道的能够产生抗真菌化合物的微生物很多(Liu et al.,2007, Appl Microbiol Biotechnol 76:459-466; Romero et al.,2007, Journal of Applied Microbiology 103:969-976)，其中芽孢杆菌是研究最多的生防菌获选菌，已证明芽胞杆菌属中的许多种都具有合成抗菌活性物质—抗菌多肽的能力，例如，枯草芽孢杆菌产生的能抑制酵母和细菌生长的二肽—bacilysin，以及抑制植物病原菌真菌生长的脂肽(Loeffler et al.,1986, Phytopathology 115:204-213; Romero et al.,2007, Journal of Applied Microbiology 103:969-976)；蜡状芽胞杆菌合成的抗菌肽—mycocerein (Wakayama er al.,1984, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 26:939-940)等。而且，芽孢杆菌可以形成芽孢，细胞壁不含内毒素，除个别种外绝大多数对人畜无害，具有极强的抗逆性和良好的环境适应性及环境友好性，是最理想的生物杀菌剂资源。
目前用于植物病害控制的芽孢杆菌生防菌株以枯草芽孢杆菌为主，如中国生产的百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等，用于水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病等根部病害的防治；国外生产的SerenadeTM、Souata AS、Kodiak、Subtilex、BioYield、TaegroTM和Alifine-B等，用于防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等叶部病害和由镰刀菌(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)等引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害，但针对白粉病防治的芽孢杆菌制剂国内外均非常有限。此外，由于芽孢杆菌种群及菌株的多样性差异，不同芽孢杆菌乃至同一芽孢杆菌的不同菌株均具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点，筛选具有不同作用对象的高效芽孢杆菌生防菌剂仍是现在乃至今后相对长一段时期内各国科研工作关注的课题，开发拥有自主知识产权的新芽孢杆菌制剂仍具有较强的国际竞争能力。
发明内容
本发明需要解决的问题是利用植物内生细菌资源开发一种可用于植物病害防治的广谱、高效、可产业化生产的生防菌剂，提供内生细菌Bacillus sp. CC09菌株以及该菌株的分离、培养和鉴定方法；提供由该菌株制备的生防菌剂及其防治小麦白粉病和小麦赤霉病等植物病害的使用方法。
本发明的具体技术方案如下：
本发明采用的细菌是分离自植物樟树茎干的内生细菌Bacillus sp. CC09菌株(以下简称为CC09)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年3月15日，保藏号为CGMCC No.4669。
本发明的生产菌株CC09经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验以及16S rDNA、rpoB序列分析，鉴定为Bacillus sp.的一个新菌株CC09，具有以下特征：①菌落呈规则圆形，白色，干燥，不透明；②菌体为杆状，大小2.57mm×1.2mm，有芽孢，芽孢中生，椭柱或椭圆状，革兰氏染色阳性；③生理生化反应表现为：阿拉伯醇、阿拉伯糖、木糖、木糖醇、葡萄糖、山梨糖、甘露醇、淀粉酶、血清菊糖，均为阳性；硝酸盐(产气)、亚硝酸盐(产气)、葡萄糖(产气)、尿素酶、乙酰胺、ONPG试验结果为阴性。
本发明按照常规方法制备，从樟树茎杆中分离筛选出具有对植物病原真菌生长有抑制活性的菌株CC09，通过液体发酵和在发酵液中添加表面活性剂、防腐剂以及抗冻剂，制备CC09菌株的生防菌剂；利用皿内实验，评价其对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用；以及盆栽实验，评价其对小麦白粉病和赤霉病的防效。
本产品发明的优点及效果：本发明具有稳定的分离自樟树茎杆的内生细菌——Bacillus sp.CC09 (芽孢杆菌CC09菌株)，该菌株培养方法简单；CC09菌株发酵过程所用原料主要为马铃薯和蔗糖，成本较低；由CC09菌株发酵制备的生防菌剂制备简单，且对温度、酸性和弱碱性条件有较好的稳定性。本产品低毒，对人畜无害、对农作物无药害，绿色环保，且对小麦白粉病和赤霉病等植物病害有显著防效。
具体实施方式
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：CC09菌株的分离与鉴定
新鲜樟树茎杆采自江苏南京紫金山，自来水洗净晾干后切成1cm左右的小段。依次浸入75%乙醇和40%甲醛溶液表面消毒各3min，然后用无菌水清洗3次，以除去表面污染杂菌，再用无菌剪刀将茎干纵向切开，切面朝下放于马铃薯蔗糖琼脂平板上，每平板5个茎段，共5个平板。30℃培养，逐天观察新菌落的出现，共7天，挑取单菌落，划线纯化。另外，在相同的马铃薯蔗糖琼脂平板中放入2~3块未剪碎的茎作对照，检测表面灭菌是否彻底。所得菌株采用甘油保藏法于-80℃冰箱保藏备用。
将分离到的14株樟树茎杆内生细菌分别接种于含4ml马铃薯蔗糖培养基的15ml试管中，37℃、100rmp摇床发酵48h；发酵液离心除菌后取1ml与15ml溶化的马铃薯蔗糖培养基混匀，倒入直径为9cm的培养皿中，制成含培养物1/15的马铃薯蔗糖培养基平板，冷却后放入新鲜植物病原真菌菌饼，菌面向下，于30℃培养箱中培养40h后测量菌落直径，并以同样体积的培养基代替培养物作空白对照，计算培养物对测试真菌生长的抑制率，重复三次。
抑制率(％)＝[(对照组菌落平均直径－样品组菌落平均直径)/(对照组菌落平均直径－原始菌片直径)]×100%，菌落直径单位：厘米(cm)。
根据对植物病原真菌立枯丝核菌、辣椒疫霉菌、禾谷镰刀菌以及链格孢菌等菌丝生长的抑制活性，获得一株产生广谱、高效抗真菌活性物质的内生细菌菌株，经形态、染色、生理生化反应(表1)，初步确定该菌为芽孢杆菌(Bacillus sp. CC09)。
表1. 内生细菌CC09菌株鉴定的形态、染色、生理生化特征
| 测试指标 | 结果 |
| 形状 | 杆状 |
| 大小 | 2.57*1.2um |
| 芽孢 | 中生，椭柱或椭圆状 |
| 革蓝氏染色 | ＋ |
| 阿拉伯糖 | ＋ |
| 阿拉伯醇 | ＋ |
| 木糖 | ＋ |
| 木糖醇 | ＋ |
| 葡萄糖 | ＋ |
| 山梨糖 | ＋ |
| 甘露醇 | ＋ |
| 硝酸盐（产气） | － |
| 亚硝酸盐（产气） | － |
| 葡萄糖（产气） | － |
| 尿素酶 | － |
| 淀粉酶 | ＋ |
| 血清菊糖 | ＋ |
| 乙酰胺 | － |
| ONPG | － |
通过对CC09菌株基因组DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增和测序分析，该菌的DNA序列与Bacillus amyloliquefaciens strain GD4a(HM055603.1)、Bacillus subtilis strain BN-10 (EU825670.1)、Bacillus amyloliquefaciens strain 13 (HM107806.1)、Bacillus subtilis strain CICC 23584(HQ316607.1) 的16S rRNA基因序列具有99%的同源性；与Bacillus amyloliquefaciens FZB42(CP000560.1)、Bacillus amyloliquefaciens DSM7(FN597644.1)的rpoB基因序列分别具有99%和98%的同源性。但生理生化实验与上述菌株均有一定差异。为此，我们将该菌株鉴定为Bacillus sp. CC09(芽孢杆菌CC09菌株，以下简称为CC09菌株)。
实施例二：CC09菌株生防菌剂的制备方法
挑取活化的CC09菌株单菌落接种到4ml马铃薯蔗糖培养基(15ml试管)培养，37℃、100rmp摇床培养12h，即为种子液；将种子液按0.5%(v/v)的比例接种于含400ml马铃薯蔗糖培养基的1L三角瓶中，37℃、100rmp发酵48h，得到发酵液，再在发酵液中添加3%(w/v)表面活性剂OP-10、3%(w/v)防腐剂水杨酸钠和2%（w/v）抗冻剂尿素，得到芽孢杆菌CC09菌株的生防菌剂。然后在发酵液中加入3%(w/v)的表面活性剂OP-10、3%(w/v)的防腐剂水杨酸钠和2%(w/v)的抗冻剂尿素，充分混匀后获得CC09菌株的生防菌剂。
实施例三：CC09菌株生防菌剂对植物病原真菌生长的抑制作用
1ml实施例二中所述的培养物与14ml已溶化的马铃薯蔗糖琼脂培养基混匀后倒入直径为9cm的培养皿中，制成含培养物1/15的培养平板，然后放入直径为7mm的各种新鲜植物病原真菌菌饼，菌面向下，于30℃培养箱中培养48h，测量菌落直径，并以同样体积的培养基代替培养物作空白对照，计算培养物对各种测试真菌生长的抑制率，重复三次。
由表2可见， CC09菌株生防菌剂对链格孢菌和板栗疫霉菌菌丝生长的抑制作用最强，显著高于阳性对照达科宁；对禾谷镰刀菌的生长有中等程度的抑制作用，与阳性对照达科宁相当，但对立枯丝核菌和辣椒疫霉菌生长的抑制作用较低。
表2. CC09菌株生防菌剂对植物病原真菌生长的抑制作用(%)
| 样品 | 立枯丝核菌 | 禾谷镰刀菌 | 辣椒疫霉菌 | 链格孢菌 | 板栗疫霉菌 |
| 生防菌剂 | 62.0 | 55.7 | 51.3 | 82.0 | 65.3 |
| 达科宁 | 76.3 | 60.9 | 77.5 | 60.0 | 60.0 |
实施例四：CC09菌株生防菌剂抑制不同病原真菌的IC
50
按照上述方法制备CC09菌株生防菌剂，设5个使用浓度：7、20、33、47、67 mL/mL，以同等体积的培养基代替生防菌剂作空白对照，测定其对五种病原真菌的皿内抑菌活性，重复三次。结果显示：CC09菌株生防菌剂对测试植物病原真菌的生长有很高的抑制活性，对立枯丝核菌、禾谷镰刀菌、辣椒疫霉菌、链格孢菌和板栗疫霉菌的IC50分为35.5、24.0、60.0、2.0、31.3mL/mL。
实施例五：CC09菌株生防菌剂对温度、pH的稳定性
按照上述方法制备CC09菌株生防菌剂，并将其pH分别调节为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，静置24h后调回初始pH，按照实施例三测定其抑菌活性，重复三次，计算其相对抑制率(表3)。
将制备的生防菌剂分别置于25℃，80℃，100℃，121℃处理30min，冷却至室温后，按照实施例四测定其抑菌活性，重复三次，计算其相对抑制率(表4)。
相对抑制率(%)＝处理后的生防菌剂的抑制率/自然生防菌剂的抑制率×100。
表3. CC09菌株生防菌剂对pH的稳定性
| pH | F.graminearum | P.capsici | R. solani |
| 1 | 6.6±0.3 | 18.3±0.3 | 30.2±0.6 |
| 2 | 20.5±0.3 | 22.4±0.5 | 46.4±0.3 |
| 3 | 27.2±0.6 | 40.9±0.6 | 61.5±0.3 |
| 4 | 55.9±0.5 | 68.1±0.6 | 84.5±0.3 |
| 5 | 75.6±0.3 | 86.1±0.6 | 89.2±0.6 |
| 6 | 93.2±0.7 | 86.1±0.6 | 89.5±0.3 |
| 7 | 100.0±0.6 | 100.1±0.4 | 100.3±0.9 |
| 8 | 98.0±0.6 | 90.6±0.4 | 94.4 ±0.7 |
| 9 | 96. 3±0,3 | 89.9±0.3 | 93.3±0.8 |
| 10 | 96.5±0.3 | 89.9±0.5 | 94.3±0.4 |
| 11 | 93.0±0.6 | 86.1±0.5 | 94.5±0.4 |
| 12 | 86.4±0.3 | 81.6±0.3 | 94.5±0.8 |
| 13 | 82.6±0.3 | 59.0±0.6 | 93.9±0.6 |
| 14 | 82.4±0.7 | 58.7±0.9 | 89.2±0.6 |
表4. CC09菌株生防菌剂对温度的稳定性
| 温度(℃) | F. graminearum | P.capsici | R. solani |
| 25 | 100.0±0.0 | 100.0±0.0 | 100.0±0.0 |
| 80 | 89.0±3.3 | 90.9±9.1 | 89.6±5.0 |
| 100 | 73.9±4.7 | 84.3±6.5 | 84.1±5.6 |
| 121 | 44.5±1.6 | 44.9±0.5 | 52.9±9.3 |
表3显示CC09菌株生防菌剂中的抑菌活性物质在中性、碱性和弱酸性条件下比较稳定，但在强酸性条件下(pH＜4)活性大大降低，当pH为1时，CC09菌株生防菌剂完全丧失对禾谷镰刀菌的抑制活性，对辣椒疫霉和立枯丝核菌的抑制活性也降低了60%。
表4显示CC09菌株生防菌剂中的抗真菌活性物质受温度影响较小，在100℃下处理30min对其抑菌活性没有显著影响，但在121℃下处理30min，其对两种测试菌的抑制活性影响较大。
实施例六：CC09菌株生防菌剂对小麦赤霉病的防效
选取子粒饱满的小麦种子表面消毒后，用无菌水30℃浸泡24h，播种于装有180g灭菌土的花盆中，灭菌土与小麦赤霉病菌按照30：1比例混合，每盆播种6粒种子。制剂的处理方式有两种，一种是在土壤接种病原菌的同时用生防菌剂原液(100%)、5倍稀释液(20%)和10倍稀释液(10%)浇灌处理土壤，观察不同稀释浓度生防菌剂的防病效果，以确定最佳使用浓度；另一种是在土壤接种病原菌后的不同时间(0h、24h、72h和120h)用生防菌剂的5倍稀释液浇灌处理土壤，以确定制剂的最佳使用时间。各处理制剂的使用量均为20mL/盆，以无菌水为空白对照，以同体积的三唑酮（10mg/mL）为阳性对照，3个重复。25℃保湿培养14d后调查小麦幼苗发病情况，计算病情指数和相对防治效果。
小麦赤霉病在小麦茎基部发病严重度分为5级。0级：无病；1级：幼苗茎秆基部略微枯黄，基叶不萎蔫；2级：幼苗茎秆基部变黑或变枯黄1cm以内，基叶出现萎蔫；3级：幼苗茎秆基部变黑1cm以上，基叶严重萎蔫；4级：整株植株严重枯萎乃至枯死(乔宏萍等 2005)。
病情指数＝∑(病级株数×代表数值)×100/(株数总和×发病最重级的代表数值)。
防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数
结果显示，用5倍稀释的CC09菌株生防菌剂于不同时间处理土壤，对小麦赤霉病均有一定防治效果，但是接种赤霉病菌后立即浇灌生防菌剂，防效最好(53.0%)，与阳性对照三唑酮处理效果无显著性差异。随着浇灌时间的推迟，防治效果逐渐降低，当接种后5天后再用生防菌剂浇灌土壤，防效仅为19.0％，显著低于三唑酮处理(表5)。
表5. 不同时间使用稀释5倍的生防菌剂对小麦赤霉病的防治效果
| 施药时间（h） | 病情指数 | 防治效果（%） |
| CK | 57.5±1.6 | |
| 三唑酮 | 25.0±1.5 | 56.4±4.5 a |
| 0 | 27.0±1.2 | 53.0±3.7 ab |
| 24 | 28.5±0.6 | 50.4±1.7* b |
| 72 | 36.7±1.3 | 36.1±4.0** c |
| 120 | 46.5±1.3 | 19.0±3.9** d |
注：以三唑酮处理为对照进行t检验，*代表95%的显著性差异（P<0.05）；**代表99%的显著差异（P<0.01）。字母（a,b,c,d）表示不同处理组间在P<0.05时的差异显著性。
不同浓度的CC09菌株生防菌剂处理土壤对小麦赤霉病的防治效果存在显著差异，浓度越高，防效越高。用生防菌剂原液直接浇灌土壤，对小麦赤霉发病的防治效果高达90.7%，极显著高于阳性对照三唑酮的防治效果。稀释5倍后处理土壤，仍与三唑酮的防治效果无显著差异(约为61.6％) (表6)。
表6. 不同稀释浓度的生防菌剂对小麦赤霉病的防治效果
| 施药浓度（%） | 病情指数 | 防治效果（%） |
| CK | 58.3±1.8 | |
| 三唑酮 | 21.9±0.6 | 62.4±1.9 b |
| 100 | 5.4±0.4 | 90.7±1.2** a |
| 20 | 22.5±1.2 | 61.3±3.5 b |
| 10 | 32.2±1.4 | 44.8±4.2** c |
注：以三唑酮处理为对照进行t检验，*代表95%的显著性差异（P<0.05）；**代表99%的显著差异（P<0.01）。字母（a,b,c）表示不同处理组间在P<0.05时的差异显著性。
实施例七：CC09菌株生防菌剂对小麦白粉病的防效
利用盆栽实验，研究CC09菌株培养物稀释20倍对小麦白粉病的保护作用(小麦喷药后10天、17天和24天接种白粉病菌，调查病害严重度)和治疗作用(小麦接种白粉病菌后10天、17天和24天喷药，调查病害严重度)。阳性对照为100ppm的三唑酮，阴性对照为水。每个处理3盆，每盆种植小麦10苗。计算相对防效：
结果显示，CC09菌株生防菌剂对小麦白粉病既有保护作用，又有治疗作用，其相对防效除24天的保护作用显著低于三唑酮外，其它处理的防效与三唑酮处理的防效无显著性差异(表7)。
表7. 防治小麦白粉病相对防效（%）
*表示防效在0.05水平存在差异。
Claims (3)
1.一种防治多种植物真菌病害的生防菌，其特征在于该菌为一株植物内生细菌——Bacillus sp. CC09（芽孢杆菌CC09菌株），该菌株分离自植物樟树茎干，已于2011年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4669。
2.一种防治植物病害的生防菌剂的制备方法，其特征是利用权利要求1所述的生防菌进行液体发酵，发酵工艺包括种子液的制备和1L摇瓶培养，种子液制备为在15ml试管中加入4ml马铃薯蔗糖培养基，接种后于37℃、100rmp摇床发酵12h，得到种子液，将种子液按0.5%（v/v）的比例接种于含400ml马铃薯蔗糖培养基的1L三角瓶中，37℃、100rmp发酵48h，得到发酵液，再在发酵液中添加3%（w/v）表面活性剂OP-10、3%（w/v）防腐剂水杨酸钠和2%（w/v）抗冻剂尿素，得到芽孢杆菌CC09菌株的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂在防治小麦白粉病或小麦赤霉病中的应用。
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