CN110520519A - 细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种bs89作为提高植物生产力和防止植物疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术和农业。菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89是一种提高植物生产力和保护植物免受疾病侵害的药剂。菌株保藏在全俄罗斯农业微生物研究所的保藏中心，保藏号RCAM 03458。该菌株显示对植物致病真菌具有高杀真菌活性和对植物致病细菌具有杀细菌活性，也显示对各种作物具有高生长促进活性，特别是小麦、大麦、马铃薯、卷心菜、甜菜、亚麻和向日葵。

Description

细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89作为提高植物生产力 和防止植物疾病的方法
本发明涉及生物技术和农业领域，涉及来自芽孢杆菌属的新的根际细菌菌株，作为增加植物生产力和保护植物免受致植物病原微生物的方法。
现在如果不使用化肥和植物保护产品，就不可能实现高效农业生产。因此，由于矿物肥料(首先是氮肥)的广泛使用，发达国家主要农作物的产量在过去五十年中增加了5倍以上。然而，生产和使用矿物氮肥的方法是最耗能的过程，消耗农业生产中消耗的能源的30％至50％。
目前已知在农业领域有许多不同目的的微生物制剂，包含生长刺激制剂以及抑制植物病原细菌和真菌生长的制剂。微生物可刺激植物生长(固氮螺菌)、结合氮(根瘤菌)、预防植物病害(假单胞菌，芽孢杆菌)或消灭害虫(链霉菌)。
现有技术公开了1987年发表在Izobreteniya stran mira(世界各国的发明)10号上的英国申请号为2170987(优先权14.02.85，IPC4A01C1/06)中描述的“种子处理方法”。所述方法包括用由微生物、载体(如麸)和胶(如印度胶)组成的组合物处理种子。小麦种子的处理提供了最好的结果。
现有技术公开了专利号为2140138的俄罗斯联邦的一组发明“蔬菜作物种子播种前处理方法以及获得蔬菜作物种子播种前处理准备的方法”，在申请号为98120341的专利上发布，优先权为1998年11月13日，以ZAO SSPR SORTSEMOVOSHCH的名义指定，IPC-01/01/06，于1999年10月27日公布。
用含有细菌菌株枯草芽孢杆菌CH-13的生物杀菌制剂进行上述方法(在附生微生物组中以ARRIAM D-606的保藏号保藏)。生物杀菌制剂的生产是通过将先前在液体无菌营养培养基中培养的含有菌株枯草芽孢杆菌CH-13的培养液与PVA乳液、水稀释液和无菌白垩或白云石以一定比例混合。本发明允许通过预播种子处理来增加蔬菜作物对植物病原真菌的保护效果。
现有技术公开了专利号为2099947的俄罗斯联邦的发明“用于保护植物免受疾病的植物孢子素(Phytosporin)生物制剂”，在申请96121980上发布，优先权为1996年11月15日，以乌克兰国家科学院(UA)微生物学和病毒学研究所和NPO Bashkirskoye(RU)的名义指定，IPC-01N63/00；С12N1/20；С12R1：125，于1997年12月27日公布。
植物孢子素生物制剂基于细菌菌株枯草芽孢杆菌ARRIAM 128，每毫升盐水的细胞浓度为109-1010，其量为92-98体积％，载体的量为2-8体积％。菌株枯草芽孢杆菌ARRIAM128的特征在于对植物病原细菌和真菌具有高度拮抗活性，因此可用于通过预播种处理来保护各种农业植物(谷类和豆类作物)和观赏树木。
现有技术公开了专利号为2478290的俄罗斯联邦的发明“用于刺激植物生长、保护植物免受疾病、提高产量和土壤肥力的生物制剂”，在申请号为2011145665的专利上发布，优先权为2011年11月11日，以OOO Batsiz的名义指定，IPC A01N63/02,А01C1/06,C12N1/20,C12R1/07，该申请于2012年5月20日公布，该专利于2013年4月10日公布。
生物制剂含有生物量的解淀粉芽孢杆菌RNCIM-11008和腐殖酸盐，比例如下，体积百分比：解淀粉芽孢杆菌RNCIM-11008的营养细胞和孢子的生物量1.24÷1.30×1010CFU/ml的培养液和孢子含量占总CFU 99.0的94％，腐殖酸盐为1.0。生物制剂可保护植物免受真菌和细菌疾病的侵害，改善土壤的植物检疫条件，增加土壤肥力和作物产量。
该制剂的缺点是应用领域有限(只有小麦和大麦)，需要确保生产菌株的高效价的细胞和孢子以使制剂有效。
现有技术公开了专利号为2528058的俄罗斯联邦的发明“具有杀真菌和杀细菌效果的解淀粉芽孢杆菌菌株以及其保护谷类植物免受植物病原真菌引起的疾病的生物制剂”，在申请2013125726上发布，优先权为2013年6月4日，以FGUP GosNIIgenetika的名字指定，IPC A01N63/02,А01C1/06,C12N1/20,C12R1/07，于2014年9月10日公布。
申请描述了具有杀真菌和杀菌活性的菌株解淀粉芽孢杆菌RNCIM-11475并提出了保护谷类植物免受植物病原真菌引起的疾病的生物制剂。生物制剂是通过混合活性剂(滴度为2-3×109CFU/ml的菌株的培养液和细硅藻土颗粒形式的载体)生产的，以1：3的体积比随后进行干燥。
本发明可以增加粮食作物的产量并减少植物病原真菌的流行。
它的缺点是应用领域有限(仅粮食作物)和缺乏杀菌活性。
现有技术公开了一种解淀粉芽孢杆菌植生亚种B203菌株的中国专利申请，公开号为CN102703354(A)，2012年10月3日，表现出对草莓炭疽病和一些其他真菌病的杀菌作用；IPC A01N63/00,-/02；A01P3/00；C12N1/20；C12R1/07，和菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种B232的基于优先权日2014年8月6日的国家申请CN20141385641，2014年12月10日的中国专利CN104195072(А)的专利申请，表现出对白杨树皮疡病和其他真菌病的杀菌作用；IPCA01N63/00；A01P3/00；C12N1/20；C12R1/07。
这些菌株的缺点是应用范围有限(草莓，白杨)和缺乏杀菌活性。此外，该专利没有指出制剂对控制草莓和白杨真菌病有效的必要滴度。
现有技术公开了基于国家申请RO20100001379，优先权日为2010年12月21日，发明名称为“解淀粉芽孢杆菌植生亚种B100菌株用于农作物生长”的2012年6月29日的罗马尼亚专利申请RO127468(A2)，IPC A01N63/00；C12N1/20。
该菌株对土壤中广泛的植物病原性真菌和果树细菌疾病具有杀真菌(产生脂肽和聚酮抗生素)和杀细菌活性，以及基于生长因子的内生性产生刺激作用。它可以产生许多酶，如蛋白酶、内酯酶、淀粉酶、植酸酶和纤维素酶，并溶解磷和硒的无机化合物。该菌株可用于强化缺硒地区的粮食作物(小麦和玉米)的粮食。
该公开并未指出在制备过程中，当该菌株用于控制植物病害时所需的解淀粉芽孢杆菌植生亚种B100的滴度，另一个缺点是其应用领域有限(粮食作物和果树)。
还已知基于德国国家申请的2012年3月24日的国际申请WO2012130221(A2)，其优先权为2011年4月1日，发明名称为“抗植物病原微生物的产品”，IPC A01N63/00；C07K14/32；C12N1/20；C12R1/07。
申请描述了一种新菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种AB101，对由立枯丝核菌引起的马铃薯根腐病(黑斑病)非常有效。
一种抗真菌制剂细菌素被开发用于治疗真菌、其他微生物和病毒感染。它基于对革兰氏阳性菌具有强效作用的解淀粉芽孢杆菌植生亚种AB101细菌的的孢子。
解淀粉芽孢杆菌植生亚种菌株产生十种不同的物质：杀真菌剂(各种抗生素物质群体，如二肽、脂肽和铁载体)，杀细菌剂(聚酮化合物和细菌素)以及抗广谱植物病害的抗病毒物质，特别是由植物病原真菌立枯丝核菌引起的马铃薯根腐病(黑斑病)。它可以用于农业、植物保护和生物技术。
该公开并未指出在制备过程中，当该菌株用于控制植物病害时所需的解淀粉芽孢杆菌植生亚种AB101的滴度。
另一个缺点是有限的应用领域：主要是描述针对由植物病原真菌立枯丝核菌引起的马铃薯根腐病的效果。
现有技术公开了申请号为2495119的发明“作为提高植物生产力和保护植物免受致植物病微生物的方法的菌株枯草芽孢杆菌8A”，在申请号为2012151104的专利上发布，优先权为2012年11月29日，以GNU ARRIAM of Rossel’khozakademiya的名义注册，选择这种菌株作为原型。
该菌株于2011年11月14日保藏在Rossel'khozakademiya的全俄罗斯农业微生物研究所(ARRIAM)的保藏机构，保藏号为RCAM 00876，作为增加植物生产力和保护植物免受致植物病微生物的手段。该菌株具有很高的杀真菌和杀细菌活性。该菌株及在其基础上的生物制剂也显示出具有高生长刺激活性，导致产量增加。实验证实菌株的有效性是由于其细菌通过定植根际和植物根部形成微生物植物系统的能力。
来自分类群解淀粉芽孢杆菌植生亚种的菌株被保藏在离申请人远的(其中一些在其他国家)的保藏机构中。此外，一些出版物没有提及菌株用在生物制剂中所需的滴度。由于这些原因，选择保藏在全俄罗斯农业微生物研究所(ARRIAM)保藏机构中并且可供申请人使用的菌株枯草芽孢杆菌8A作为原型。
本发明的目的是分离适合用于农业的根际细菌菌株作为抵抗植物病原微生物的植物保护手段，改善农作物的营养并提高植物生产力，从而扩大此类产品的工具包(toolkit)。
要求保护的解决方案是使用根际菌解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89作为提高植物生产力和保护植物免受致植物病微生物的手段。
根际菌解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89是从冬小麦的根中分离得到的，在克拉斯诺达尔边疆区(俄罗斯联邦)的黑钙土土壤上生长。
该菌株保藏在ARRIAM的俄罗斯农业微生物保藏中心(RCAM)中，保藏日期为2015年9月7日，保藏号为RCAM 03458，作为提高植物生产力及其对植物病原微生物的保护的手段(附带保藏证明复本)。
该菌株具有以下形态-培养和生理-生化特征。
细菌细胞是常规杆状，末端是圆形。鞭毛的排列是单极的，有周毛。细胞大小(0.9-1.8)μm。细菌形成孢子位于细胞的中心并在革兰氏染色后呈阳性。生长24小时后，在液体营养培养基中观察到聚-β-羟基丁酸的积累。液体和半液体营养培养基的生长是微量需氧的，新陈代谢是呼吸的和发酵的。在牛肉膏琼脂上，菌株形成具有糊状纹理和不平坦粗糙边缘的干奶油色菌落。菌落直径为(5-12)mm。最适生长温度为33℃。温度超过45℃或低于15℃时，生长会减慢。最佳PH值为6.8，pH从4.5到9.0也适合生长。该菌株水解酪蛋白、明胶、淀粉和石蕊牛奶，在此过程中石蕊失去颜色。它具有强过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性。可以生长在50℃、10％NaCl和0.001％溶菌酶中。
作为唯一的碳源，菌株使用(形成酸)阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、甘油、糊精、淀粉和(形成碱)鼠李糖和己六醇。它主要利用矿物质形式的氮(铵盐和硝酸盐)以及氨基酸和蛋白质。
实验表明，菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89增加植物的产量并且对几种农作物病原体有拮抗性，例如：
-对于冬天和春天的小麦，抗霉(白粉菌属)、褐锈病(小麦叶锈病)，珠镰孢菌素病根腐病(镰孢菌)和基部颖壳腐病(丁香假单胞菌)；
-对于春天的大麦，抗种子霉(青霉菌属，链格孢属)，根腐病(孺孢菌)和褐斑病(内脐孺孢属)；
-对于包心菜和花椰菜，抗黑腐病(野油菜黄单胞菌)，黑茎病(立枯丝核菌)，腐霉根腐病(畸雌腐霉)；
-对于马铃薯，抗晚疫病(致病疫霉)，立枯丝核疫病(立枯丝核菌)和枯萎病(尖孢镰刀菌)；
-对于甜菜，抗由真菌腐霉菌和甜菜茎点霉引起的疾病以及抗斑点病(尾孢菌)；
-对于向日葵，抗白腐病(核盘菌)和茎枯病(向日葵茎溃疡病菌)；
-对于亚麻，抗枯萎病(燕麦镰孢,尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum v.)直角石属(orthoceros f.)lini(Boll)Bilai)和白叶枯病(梭状嗜碱性软化芽孢杆菌(Clostridiummacerans Schard))。
实验表明，菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89对抗植物病原真菌黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、拟分枝孢镰刀菌、禾白粉菌、晚疫病菌、立枯丝核菌、畸雌腐霉(Pythiumirregular)、霉霜菌、葡萄钩丝壳菌、葡萄孢菌具有杀真菌活性，对抗植物病原细菌野油菜黄单胞菌、丁香假单胞菌和密执胺棒形杆菌具有杀细菌活性。
测试了四种根际细菌菌株的拮抗活性：荧光假单胞菌AP-33(微生物制剂Planrhiz)、枯草芽孢杆菌ARRIAM 128(微生物制剂Phytosporin)，枯草芽孢杆菌8A(原型)和解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89(要求保护的菌株)。结果列于表1和2中。
对五种植物病原菌菌株测试杀菌活性：丁香假单胞菌8300、丁香假单胞菌2314、欧文氏杆菌A-1、欧文氏杆菌3391和密执安棍状杆菌17-1。
首先，用细菌环将细菌接种在营养琼脂的表面上形成菌苔，并在28℃下培养48小时。在测试杀细菌活性当天，将本研究中使用的植物病原菌菌株接种到马铃薯琼脂上形成菌苔。借助于钻头将有成熟培养的测试细菌的无菌琼脂块切出，并借助无菌手术刀和火焰灭菌钳将其转移到新鲜接种的培养基的表面。在28℃下接种含有块的培养皿24小时，然后测量块周围抑制区的直径。测量结果列于表1。
表1.根际细菌菌株对植物病原菌的拮抗活性
表1中的数据表明，要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89与原型菌株枯草芽孢杆菌8A相比，对植物病原细菌具有较强的拮抗活性。
用威尔斯方法对五种植物病原性真菌测试杀真菌活性：晚疫病菌、立枯丝核菌、黄色镰孢菌、腐皮镰刀菌、腐霉菌。
将真菌孢子悬浮液(105CFU/ml)加入马铃薯葡萄糖琼脂中，加热并冷却至37℃，以每1ml培养基1ml悬浮液的速率进行。将混合物倒入培养皿中。凝结后，用火焰消毒的钻头在混合物中制成四个光滑通孔。这些孔被放在一个正方形的顶点。将细胞滴度为108CFU/ml的100ml细菌悬液倒入每个孔中。具有空孔的培养皿作为对照。具有孔的所有培养皿在28℃培养72小时。杀真菌活性用抑制植物病原真菌生长的孔周围区域的大小来确定。测定结果列于表2。
表2.根际细菌菌株对植物病原真菌的拮抗活性
表2中的数据表明，要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89与原型菌株枯草芽孢杆菌8A相比，对植物病原真菌具有较强的拮抗活性。
全基因组测序分析表明，菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的活性是由于编码产生杀真菌和杀菌物质的基因的存在，如表面活性素、丰源素、杆菌抗霉素D、环状脂肽、杆菌素、芽孢杆菌溶素、聚酮化合物杆菌烯、大环内酯、plantazolicin和amylocycl izin(表3)。
非核糖体肽(NRP)是一系列结构不同的抗生素物质。最有名的和研究最好的NRPs是表面活性素，丰源素和伊枯草菌素。
伊枯草菌素和丰源素是各种杆菌潜在的抗真菌的主要因素[1]。
丰源素对菌丝真菌特别有效[2]。
表面活性素是形成生物膜以及细菌在环境中的扩散所必需的，以这种方式促进植物根系和组织的定植以及表现生物防治活性[3]。此外，表面活性素和少量的丰源素可触发植物的保护机制[1]。
表3.参与菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89抗生素代谢物合成的基因簇
除了脂肽之外，基因簇dhb参与铁载体杆菌素的合成。细菌铁载体对三价铁具有高亲和力，并且可以在铁缺乏的环境如土壤中有效地结合铁。因此，铁离子对植物病原体的可用性降低，并且以这种方式促进了产铁载体细菌的生物防治活性(Kloepper等，1980)。负责杆菌素的合成的操纵子dhb，与产生肠杆菌素的革兰氏阴性菌相应的操纵子类似。
除了脂肽之外，基因簇dhb参与铁载体杆菌素的合成。细菌铁载体对三价铁具有高亲和力，并且可以在铁缺乏的环境如土壤中有效地结合铁。因此，铁离子对植物病原体的可用性降低，并且以这种方式促进产铁载体细菌的生物防治活性[4]。负责杆菌肽的合成的操纵子dhb，与产生肠杆菌素的革兰氏阴性菌相应的操纵子类似。
解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89有三大编码聚酮类化合物地菲西丁、聚酮化合物杆菌烯和大环内酯的基因簇(表3)。所有这三种代谢物都对植物和人类病原体具有广泛的抗菌活性并有用于医学的潜力[5,6]。
解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89菌株的基因组含有用于产生两种小核糖体肽(plantazolicin和amylocycl izin)的基因簇(表3)。Plantazolicin属于一种新型小核糖体肽，对其他杆菌，特别是炭疽杆菌(炭疽病原体)具有较小的抗菌活性[7]。此外，这种代谢物可以抑制在植物根部形成结痂的线虫。其他几种革兰氏阳性菌，包括密执安棍状杆菌坏腐亚种sepedonicus、解脲棒杆菌DSM7109和扩展短杆菌BL2，在其基因组中具有相似的生物合成簇[8]。
Amylocyclizin是来自细菌素类的环肽。它对密切相关的革兰氏阳性菌具有很高的抗菌活性。这种优势可用于抑制根际细菌竞争者[7]。负责该细菌素合成的基因簇acn在来自芽孢杆菌属/类芽孢杆菌分类群的物种中是常见的。在几种解淀粉芽孢杆菌植生亚种中也发现了另一种小肽，杆菌肽(mersacidin)[9]但菌株BS89仅含有整个基因簇的片段，并且可能不能合成杆菌肽(mersacidin)。
实验表明，菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89不仅对植物病原菌和植物病原真菌具有杀菌活性，而且还对萝卜和小麦等各种农作物有植物刺激作用。
在原始技术和萝卜植物cv.Duro和小麦cv.Veda的帮助下分析菌株的生长刺激活性。种子在70％乙醇中消毒2分钟，并用无菌自来水冲洗。然后将它们在滴度为107CFU/ml的细菌悬浮液中浸泡30分钟并放入无菌湿室中，每次20粒种子，重复3次。对照种子浸泡在无菌自来水中。然后将植物在植物生长室中28℃培养72小时。温育后，测量根和芽的长度。与对照幼苗相比，计算了测试菌株的生长刺激活性。结果列于表4和5中。
表4.根际细菌菌株对萝卜幼苗的生长刺激活性
表4中的数据表明要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89对萝卜幼苗具有更强的生长刺激作用，与原型菌株枯草芽孢杆菌8A相比。
表5.根际细菌菌株对小麦幼苗的生长刺激活性
表5中的数据表明要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89对小麦幼苗具有更强的生长刺激作用，与原型菌株枯草芽孢杆菌8A相比。
据推测，细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89具有高生长刺激活性，由于其能够产生许多维生素如硫胺素(B1)、核黄素(B2)、烟酸盐(B3)、泛酸盐(B5)、生物素(B7)、叶酸盐(B9)、钴胺素(B12)和甲基萘醌(K2)(表6)。维生素是在各种植物和细菌帮助下产生营养不可缺少的元素[10]。它们的主要生理作用是作为无数代谢过程中的辅因子和抗氧化剂。在八种已知的B族维生素中，细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的基因组中发现6种，采用KEGG本体论(使用KAAS服务器)和基因组数据挖掘技术(表6)。它们是硫胺素(B1)、核黄素(B2)、泛酸盐(B5)、维生素B6(吡哆醇)、生物素(B7)和叶酸(B9)。此外，我们发现一种参与钴胺素(维生素B12)(Prokka_00310)的蛋白质和两种参与烟酸(维生素B3)代谢的酶：烟酰磷酸核糖转移酶(Prokka_02867)和烟酰酸核苷酸焦磷酸化酶(Prokka_02473)。在细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚BS89的基因组中也发现了二甲基间苯醌甲基转移酶(Prokka_02063)。该酶催化K2维生素生物合成的最后一步。这些结果表明细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89可能能够产生维生素B3、B12和K2。
表6.细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的基因组中的维生素及其生物学作用
*来源：细菌学手册(线上)
http://textbookofbacteriology.net/nutgro_2.html
**资料来源：Palacios等人的综述。(2014)
以下给出基于所要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的液体形式的微生物制剂的制备实例。
贮存培养
为了获得细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的储备培养物，使用液体营养培养基PSB(马铃薯-蔗糖肉汤)。首先将200克去皮马铃薯切成片，并将其在800毫升蒸馏水中煮20分钟以制备马铃薯肉汤。然后通过棉纱过滤器过滤肉汤，加入10g蔗糖，并使混合物的pH达到7.0。
将获得的液体营养培养基倒入750ml摇瓶中，每瓶100ml，在1个大气压下灭菌30分钟。然后将营养培养基以下比例接种在烧瓶中：每个烧瓶中有1个含有纯细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的倾斜营养琼脂的管。之后，将烧瓶置于振荡器(180rpm)中并在28℃下培养48小时。通过这种方式，在具有细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的4×109CFU/ml的滴度的烧瓶中获得其储藏培养物，。4-6℃下它被存放在冰箱中长达1个月，以便之后接种发酵罐。
对照培养
在含有糖蜜和玉米提取物的培养基上的发酵罐中获得用于工业培养的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的对照培养物。贮存培养的接种率为1-3％，培养时间为33℃下72小时。培养对照培养物时，温度可以上升到37℃。以这种方式，获得基于细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89滴度不低于1×109CFU/ml的菌株的浓缩的细菌悬浮液。
基于细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的液体形式的微生物制剂
根据浓缩的细菌悬液的滴度，基于细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的浓缩的细菌悬浮液以1:10或1:20的比例用无菌水稀释。将获得的液体在20-25℃保存3-5天，直到得到至少1×108CFU/ml的细菌滴度。之后，微生物制剂即可用于农业。将液体制剂在无菌条件下倒入聚乙烯瓶或用酒精冲洗的容器中。
该制剂的保质期至少为24个月。
实验表明，为了使细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89在各种微生物制剂中有效，细菌的浓度(活细胞和孢子的量)应为每1ml培养液中104-109个细胞。浓度低于104个细胞/ml的菌株的使用降低了拮抗和生长刺激作用，而高于109个细胞/ml的浓度的升高也不会增强拮抗和生长刺激作用。
在冬小麦(cv.Veda)和萝卜(cv.Duro Krasnodarskoye)的温室试验中测试了基于如上所述获得的要求保护的根际菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的微生物制剂的作用。
对于这些试验，容积为3升(用于小麦和萝卜)的盆被重达3.4kg的土壤塞满。播种前，用200毫升的自来水润湿土壤直至全田湿润。萝卜和小麦种子按大小分类，在无菌培养皿中用无菌滤纸消毒和生长。
将大小相同的幼苗分成三份。将第一份幼苗在基于滴度为107CFU/ml的原型菌株枯草芽孢杆菌8A的液体制剂中接种30分钟。将第二份接种在在基于滴度为107CFU/ml的要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的制剂中。第三份幼苗用无菌水处理(对照)。25天后测量萝卜植物的生物量，30天后测量小麦植物的生物量。表7和表8列出了试验结果。
表7.温室试验中根际细菌菌株对小麦(cv.Veda)的作用
表8.温室试验中根际细菌菌株对萝卜(cv.Duro Krasnodarskoye)的作用
在温室试验中获得的小麦,cv.Veda,和萝卜ish,cv.Duro Krasnodarskoye数据比较(表7和表8)表明，基于要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的微生物制剂比基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的微生物制剂对小麦和萝卜有更大的作用。
实验表明，基于要求保护的根际细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的10％微生物制剂溶液的使用对于农业植物种子的处理是最佳的，而0.1-3％的溶液是植物生长的最佳选择。
通过三种微生物制剂的应用，在谷物、蔬菜和经济作物(春季和冬季小麦、大麦、土豆、亚麻、向日葵和甜菜)的田间试验中测试了用于提高生产力和质量的菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的作用：基于细菌菌株枯草芽孢杆菌ARRIAM128的植物孢子素(Phytosporin)，基于原型菌株枯草芽孢杆菌8А的微生物制剂，和如上所述的基于要求保护的根际细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的微生物制剂。
在克拉斯诺达尔地区的强效的、中等壤质的、中等腐殖质的黑钙土土壤上进行了春小麦(cv.Lada)的田间试验，加入3.24％秋林蛋白(Tyurin)、8.3mg/kg硝酸盐氮、64mg/kg磷、150mg/kg钾、PH6.46的水的腐殖土。
田间试验是根据Pryanishnikov全俄罗斯农业化学研究所地理试验网络的建议进行的(评估农业微生物制剂在农业的有效性/Ed.A.A.Zavalin，莫斯科：Rossel'khozakademiya，2000，82页)。播种区面积40m2，记录区面积30m2。该试验重复了4次。这片土地提前空着休耕。肥料是N6Р52(磷酸铵肥料磷酸铵肥料)。预播处理：在5-7厘米的深度进行栽培。春小麦播种速度：每公顷500万粒肥沃种子。
播种当天，一部分小麦种子未经处理(对照)，第二部分用基于菌株枯草芽孢杆菌128ARRIAM(标准)的液体生物制剂植物孢子菌素Phytosporin处理，第三部分用基于菌株枯草芽孢杆菌8A(原型)的液体生物制剂处理，最后一部分种子用基于上述要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89处理。以每9升水1升制剂的比例加入20-30克羧甲基纤维素钠处理小麦种子。
播种前栽培土壤。为此，根据实验方案将矿质肥料以磷酸铵肥料磷酸铵肥料(N6P52)的形式加到土壤上。之后，根据用于处理的生物制剂以及对照区将小麦种子播种到划定的播种区。
在3-5叶阶段和分蘖结束阶段/开始启动阶段喷洒植物叶面。用肩部喷雾器以每公顷300升水1升制剂的比例喷洒植物。
小麦的农耕文化符合区域技术。用SAMPO-130收割机收获产量，并记录全部，按图绘制。重新计算至纯度100％、湿度14％。谷蛋白含量基于GOST 13586.1/68进行测定，蛋白质含量基于GOST 10846/91进行测定。所得结果显著性的统计评估基于95％显著性水平的方差分析。表9列出了春小麦试验的结果。
表9.根际细菌菌株对春小麦(cv.Lada(Krasnodar Territory))产量和籽粒品质的影响
在乌里扬诺夫斯克州的白、中等强度、壤土、中等腐殖质黑钙土土壤上进行了冬小麦田间试验，加入2.89％秋林蛋白、9.5mg/kg硝酸盐氮、79mg/kg磷、140mg/kg钾、PH6.62的水的腐殖土。
播种区面积30m2，记录区面积25m2。该试验重复了4次。这片土地提前空着休耕。肥料是N6P52(磷酸铵肥料磷酸铵肥料)。预播处理：在5-7厘米的深度进行栽培。冬小麦施用量：每公顷480万粒肥沃种子。
播种当天，一部分小麦种子未经处理(对照)，第二部分用基于菌株枯草芽孢杆菌128ARRIAM(标准)的液体生物制剂植物孢子菌素Phytosporin处理，第三部分用基于菌株枯草芽孢杆菌8A(原型)的液体生物制剂处理，最后一部分用的种子基于上述要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89处理。
以每9升水1升制剂的比例加入20-30克羧甲基纤维素钠处理小麦种子。
在所有的实验变量中，在预播栽培下，根据实验方案将矿质肥料以磷酸铵肥料磷酸铵肥料(N6P52)的形式额外手动加入，再播种。之后，根据用于处理的生物制剂以及对照区将小麦种子播种到划定的播种区。
在耕作阶段和开始启动阶段期间喷洒植物叶面。用肩部喷雾器以每公顷200升水1升制剂的的比例喷洒植物。
小麦的农耕文化符合区域技术。用SAMPO-130收割机收获产量。重新计算至纯度100％、湿度14％。谷蛋白含量基于GOST 13586.1/68进行测定。所得结果显著性的统计评估基于95％显著性水平的方差分析。表10列出了冬小麦试验的结果。
表10.根际细菌菌株对冬小麦(cv.Mironovskaya 808(Ulyanovsk Region))产量和籽粒品质的影响
在克拉斯诺达尔边疆地区的强、中等肥沃、中等腐殖质黑钙土土壤上进行了春大麦田间试验，加入3.24％秋林蛋白、8.3mg/kg硝酸盐氮、64mg/kg磷、150mg/kg钾、PH6.46的水的腐殖土。
播种区面积40m2，记录区面积30m2。该试验重复了4次。这片土地提前空着休耕。肥料是N6P52(磷酸铵肥料磷酸铵肥料)。预播处理：在5-7厘米的深度进行栽培。播种量：每公顷400万粒肥沃种子。
播种当天，一部分大麦种子未经处理(对照)，第二部分用基于菌株枯草芽孢杆菌128ARRIAM(标准)的液体生物制剂植物孢子菌素Phytosporin处理，第三部分用基于菌株枯草芽孢杆菌8A(原型)的液体生物制剂处理，最后一部分的种子用基于上述要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89处理。以每9升水1升制剂的比例加入20-30克羧甲基纤维素钠处理大麦种子。
播种前栽培土壤。为此，根据实验方案将矿质肥料以磷酸铵肥料(N6P52)的形式手动加到土壤上。之后，根据用于处理的生物制剂以及对照区将大麦种子播种到划定的播种区。
在3-5叶阶段和分蘖结束阶段/开始启动阶段喷洒植物叶面。用肩部喷雾器以每公顷300升水1升制剂的的比例喷洒植物。
春大麦的农耕文化符合区域技术。用SAMPO-130收割机收获产量，并记录全部，按图绘制。重新计算至纯度100％、湿度14％。谷蛋白含量基于GOST 13586.1/68进行测定。所得结果显著性的统计评估基于95％显著性水平的方差分析。表11列出了春大麦试验的结果。
表11.根际细菌菌株对春大麦(cv.Preriya(Krasnodar Territory))产量和籽粒品质的影响
表9、10和11中的数据表明，基于要求保护的菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的微生物制剂对基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的生物制剂的谷物农作物的产量和籽粒品质具有更强的作用。
加入2.30％秋林蛋白、22.1mg/kg硝酸盐氮、315mg/kg磷、52mg/kg钾、PH5.6的水后，在列宁格勒地区的弱弱灰壤、壤土、腐殖质上进行马铃薯(cv.Nevsky)田间试验，。播种材料：选自相同预热和分拣批次的马铃薯块茎。块茎的重量为60-70克，有眼孔。前作：青饲料的一年生草。肥料：有机肥不是通过马铃薯引入，在垄作耕作下以N100P110K130的比例引入矿质肥料。
实验区面积50m2，记录区面积25m2。实验重复4次。播种方案为75×30厘米，导致播种密度为每公顷44,000块茎。到收获时，植物密度平均每公顷43,500株。
播种当天，一部分马铃薯块茎未经处理(对照)，第二部分用基于菌株枯草芽孢杆菌128ARRIAM(标准)的液体生物制剂植物孢子菌素Phytosporin处理，第三部分用基于菌株枯草芽孢杆菌8A(原型)的液体生物制剂处理，最后一部分块茎用基于上述要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89处理。以每9升水1升制剂的比例预播处理马铃薯块茎。
根据用于处理的生物制剂以及对照区，用克隆播种机播种马铃薯到划定的播种区，种植宽度为75cm，播种密度为每100平方米播种400个块茎。
处理植物：处理行之间-两个萌发前处理和1个萌发后处理；喷洒除草剂提图斯(Titus)(0.03公斤/公顷)+特伦德(Trend)(0.2公斤/公顷)和杀虫剂安德拉(Aktara)、水分散性颗粒剂(0.06kg/公顷)、景气涂抹器ON-600，对照液体的施用量为300升/公顷。用肩部喷雾器喷洒每个区域的植物，比例为每公顷300升水每1升制剂：第一次在全芽期喷施，第二次在萌芽期喷施。收割前清除牧草：BD-4-7。收获：带手动块茎采摘的土豆挖掘机KTN-2B。。
表12列出了马铃薯试验的结果。
表12.根据马铃薯cv.Nevsky田间试验应用根际细菌菌株的作用(列宁格勒地区)
加入3.50％秋林蛋白、30.5mg/kg硝酸盐氮、280mg/kg磷、40mg/kg钾、PH6.0的水后，在列宁格勒地区的灰化的壤质土、腐殖土上进行包心菜(cv.Podarok)的田间微型试验。
为了获得芽，将包心菜(cv.Podarok)的种子播种到带有泥炭矿物土壤的盒子中。盆的基质的制备如下：将ARRIAM试验田的灰化灰壤土(30％)与Terravita泥炭土(ZAO MNPPFart)(50％)混合，并洗涤石英砂(20％)。将氮磷钾肥溶液以100％NPK的比例加入到混合物中。以这种方式获得的基质充分混合，混合物用盒子装满，每盒10公斤。
对于卷心菜试验，使用下列制剂的0.1％溶液：基于菌株枯草芽孢杆菌128ARRIAM(植物孢子菌素Phytosporin-标准)的制剂；基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的制剂；基于细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的制剂。将一升0.1％的生物制剂溶液分别放置于三个盒子中；水被放置在第四个盒子中。
卷心菜苗圃在15-20℃的温室种植。在2-3个真叶的阶段，将植物种植在容积为0.5升的泥炭盆中。当将卷心菜种植到泥炭盆中时，将0.1％的已经加入基质的制剂溶液(水作为对照)倒入各个种植孔中，每株植物1ml溶液(水作为对照)。种植3嫩芽，重复30次。
之后，根据其中一种生物制剂或水的处理来划定种植区界限，在4-5个真叶的阶段中将卷心菜芽与土壤块一起种植在土壤中固定的地方。土地面积为5m2，行距为50cm，植株间距为35cm。卷心菜的种植培养与往常一样。为了防治害虫，将卷心菜植物用0.15％的杀虫剂二磷酸dimophos(40％乳剂)溶液处理两次；种植芽三周后使用无机肥料：N35P20K30和在莲座叶期使用N30P20K35。
根据前面所述的用其中一种生物制剂进行的处理来在每个播种区的植被中划定界限，用肩式喷雾器SOLO-456以相应生物制剂的0.5％溶液以2L/公顷(每公顷2L/400ml水)的比例喷洒两次。对照植物未被喷洒。该试验重复了4次。
表13列出了用卷心菜进行试验的结果。
表13.在用白卷心菜(列宁格勒地区)田间试验中施用根际细菌菌株的作用
表12和13中的数据表明，基于要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的生物制剂比基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的生物制剂对蔬菜农作物的产量(生产力)具有更强的作用。
在巴什基尔州农业大学(巴什科尔托斯坦共和国)的漂白黑钙土土壤的教育实验区进行甜菜田间试验，腐殖质含量5.8％、PH6.5、Chirikov奇里科夫后91.1mg/kg磷、Chirikov奇里科夫后130.8mg/kg磷。总吸收碱值相当高，54-56mg/当量。碱饱和度：96-98％。
施用量：约每公顷5.5公斤种子。收获时的植物密度：80,000株/公顷。播种方式宽，行距45cm，推测行间距50cm。最佳播种深度3-4厘米。试验区面积50m2，记录区面积25m2。试验重复4次。
整个甜菜播种面积分为四个区域。在每个区域中，甜菜的播种用0.5％的其中一个生物制剂的溶液处理：基于菌株枯草芽孢杆菌128ARRIAM(Phytosporin-标准)的制剂；基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的制剂；基于细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的制剂。对照植物未被处理。
用肩式喷雾器SOLO-456以生物制剂的0.5％溶液以每公顷2L生物制剂/400ml水)的比例喷洒。喷洒两次：在4-6个真叶的阶段和在排列的草本闭合阶段。对照植物未被喷洒。该试验重复了4次。
表14列出了甜菜试验的结果。
表14.在甜菜(cv.Ramonskaya odnosemennaya 47,(Bashkortostan Republic))田间试验中施用根际细菌菌株的作用
加入3.71％秋林蛋白、6.2mg/kg硝酸盐氮、75mg/kg磷、180mg/kg钾、PH7.15的水后，在斯塔夫罗波尔地区的土壤上进行向日葵和亚麻的田间试验：中等强度、中等壤质、中等腐殖质的黑钙土，腐殖质。农耕技术：先前的作物是春季大麦，向日葵和亚麻在SKS-610种子间距钻机和批量滴管的帮助下播种。
试验变量是：播种未经处理的亚麻和向日葵种子(对照)，并播种用生物制剂处理的种子：植物孢子素(基于枯草芽孢杆菌128)，基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的制剂和以2.0L/t的比例的基于要求保护的解淀粉芽孢杆菌植生亚种的菌株制剂；这些生物制剂也以1.0L/公顷的比例处理植物。
试验是微区，播种面积30m2，记录区面积25m2。试验重复了4次。用紧小型的温特斯泰格收割机收获亚麻和向日葵种子。所有试验变量均记录产量。
实验结果列于表15和16中。
表15.在亚麻田间试验中施用根际细菌菌株的作用(斯塔夫罗波尔地区)
表16.在向日葵田间试验中施用根际细菌菌株的作用(斯塔夫罗波尔地区)
表14,15和16中的数据表明，基于要求保护的细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的生物制剂比基于原型菌株枯草芽孢杆菌8A的生物制剂对技术农作物如甜菜、亚麻和向日葵的产量(生产力)具有更强的作用。
基于细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89的生物制剂的田间试验证实了其提高这种农作物产量如小麦、大麦、马铃薯、卷心菜、甜菜、亚麻和向日葵的高效性。这些结果表明这种菌株是用于农业的有前景的工具。
总之，细菌菌株芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌植生亚种BS89可用于农业，作为提高植物生产力和保护植物免受植物病原微生物引起的疾病的有效手段。它是这是这种手段的工具包的一个有价值的补充。
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