WO2014027821A1 - 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물 - Google Patents

스트랩토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2014027821A1
WO2014027821A1 PCT/KR2013/007279 KR2013007279W WO2014027821A1 WO 2014027821 A1 WO2014027821 A1 WO 2014027821A1 KR 2013007279 W KR2013007279 W KR 2013007279W WO 2014027821 A1 WO2014027821 A1 WO 2014027821A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
culture
weeds
fraction
composition
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/007279
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최정섭
김영숙
이보영
김재덕
고영관
연규환
김창진
박동진
주윤정
Original Assignee
한국화학연구원
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020120088828A external-priority patent/KR101402215B1/ko
Priority claimed from KR1020130091223A external-priority patent/KR101715120B1/ko
Application filed by 한국화학연구원, 한국생명공학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to JP2015527367A priority Critical patent/JP6273279B2/ja
Publication of WO2014027821A1 publication Critical patent/WO2014027821A1/ko
Priority to US14/621,765 priority patent/US9491948B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • Weed control composition comprising Straptomyces scopulillidis KR-001 strain, or a culture thereof as an active ingredient
  • the present invention relates to a novel Steptomyces scopuliridis strain having herbicidal activity and a medium composition for mass production of the strain.
  • the classification method according to the form is classified as weeds, broadleaf weeds, weeds and weeds by dividing the weeds according to the shape of the weeds.
  • the classification method according to the life history is classified according to how long weeds live for 1 year, 2 year weed, and perennial weed.
  • the stems of the grasses and weeds have a well distinguishable segment between the nodes and the nodes, the leaves are separated from the nodes, and the leaves are divided into leaf sheath and leaf made to protect the stems.
  • the leaf body is narrow and elongated, and leaf vein is formed in parallel.
  • Some crops can be controlled by using non-selective organic synthetic herbicides such as glyphosate, but they are organic because the main source and colony of barley is the riverside, roadside, or people's living area. Control using synthetic herbicides is in reality very limited.
  • Actinomycetes including the genus Streptomyces, are gram-positive soil microorganisms that grow in mycelium form and produce various useful secondary metabolites as well as antibiotics such as herbicides. Is attracting attention. Examples of herbicides utilizing secondary metabolites produced by Actinomycetes have been herbicidin and herbimycin produced by Streptomyces saganonens i s7, anismycin produced by S. act inomycetes7, and bialaphos produced by S. vir idochromogenes7. , S. a I bus subsp. Subsp.chlorinus NRRL B-241087]-produced albucidin, S. viridichromogenes ⁇ ⁇ S. hygroscopicus 6 ⁇ ], isolated glufosinate—ammonium, including bialophos and ansamitocins. It is commercialized and is buried.
  • nitrogen sources include organic nitrogen sources such as beef extract, malt extract, yeast extract, soybean meal, and peptone.
  • organic nitrogen sources such as ammonia water, ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 S0 4 ), urea and nitrate salts are used.
  • trace elements such as minerals and vitamins are also used to aid the growth of bacteria and the production of secondary metabolites. These are the most essential elements for culturing microorganisms and show differences in bacterial growth and type and production of secondary metabolites according to their combination and composition ratio.
  • the present inventors have tried to find eco-friendly natural products-derived herbicides and methods for mass production thereof, the novel Straptomes scopuliridis KR-001 strain, its culture, or the culture fractions thereof.
  • the carbon source and the nitrogen source to increase the yield of the active material produced by the strain and weeds, broadleaf weeds and heating agent weeds, and to confirm that the optimum conditions can be established to reduce the production cost .
  • the strain has completed the present invention by revealing that it can be usefully used for mass production with natural product-derived weed control material.
  • An object of the present invention is to provide a novel Straptomys Scopullidis.
  • Still another object of the present invention is a herbicide for weed control containing any one or more selected from the group consisting of the strain, its culture solution, extract of the culture solution, fraction of the culture solution or extract and active fraction of the fraction as an active ingredient. It is to provide a composition and a method for weed control using the composition.
  • Still another object of the present invention is to mass produce Streptomyces scopulididis strain containing potato starch and soybean powder as active ingredients. It is to provide a medium composition and a method for mass production of Straptomys scopulididis strain.
  • the present invention is StrapTomyS Scopulliedi deposited under accession number KCTC 12156BP. scopuliridis) provides a KR-001 strain.
  • the present invention is selected from the group consisting of Straptomyths scopulididis KR-001 strain deposited with Accession No. KCTC 12156BP, cultures thereof, extracts of the cultures, fractions of the cultures or extracts and active fractions of the fractions. It provides a herbicide composition for weed control containing any one or more as an active ingredient.
  • the present invention in the group consisting of Straptomyths scopulididis KR-001 strain deposited with the accession number KCTC 12156BP, its culture solution, the extract of the culture solution, the fraction of the culture solution or extract ' and the active fraction of the fraction Provided is a weed control method comprising the step of treating one or more of the weeds, seeds or habitat thereof.
  • the present invention also provides a medium composition for mass production of Streptomyces scopuliridis strains containing potato starch and soybean powder as active ingredients.
  • step 2) after inoculating 1 to 3% (w / v) of the Streptomyces scopulidis strain to the medium composition of step 1), and then incubated for 5 to 7 days It provides a method for mass production of dis strains.
  • the present invention provides the use of Straptomyces scopulididis K-001 strain, the culture medium thereof, the extract of the culture solution, the fraction of the culture solution or extract and the fraction of the deposit deposited under the accession number KCTC 12156BP.
  • the present invention provides the use of Stemtomyces scopulididis strain medium comprising potato starch and soybean powder as an active ingredient for use as a mass production medium composition.
  • Figure 1 is a diagram showing a phylogenetic tree by the 16S rRNA gene sequence of the 5 to cw? Yces scopuliridis KR-001 strain deposited with the accession number KCTC 12156BP.
  • Figure 2 is a diagram showing the herbicidal activity by concentration in the foliage treatment of the strain culture medium of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the herbicidal activity of each fraction (nucleic acid, ethyl acetate, butanol and water fraction) of the strain culture in the foliage treatment during the foliage treatment by concentration:
  • Figure 4 is a view showing the herbicidal effect by concentration in the soil treatment of the ethyl acetate fraction of the strain culture of the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the control effect of the concentration of wangula (angulatus) ⁇ during foliage treatment of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention in greenhouse conditions.
  • Figure 7 is a diagram showing the effect of the control of bakbak through the body transition of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention in silver condition.
  • Figure 8 is a diagram showing the control effect on the visible foil during the foliage treatment of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention under packaging conditions.
  • Figure 10 is a diagram showing the control effect of the ethyl acetate acetate fraction of the strain of the present invention against the mugwort (Artemisia princes Pampan) in packaging conditions by concentration, time after the fraction treatment. '
  • FIG. 11 is a diagram showing the control effect of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention on the foliage of the horsetail 0 z // ' 5e ⁇ arvense L.) in packaging conditions by concentration and time after the fraction treatment.
  • FIG. 12 is a diagram showing the control effect of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention against clover repens L.) in packaging conditions by concentration and time after the fraction treatment.
  • Figure 13 is a diagram showing the weakness of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention for three plants and crops such as rice, wheat, barley and two broad-leaf crops such as pepper and tomato in the greenhouse conditions.
  • EA fr. ethyl acetate fraction
  • Bialaphos Bialaphos
  • Glufosinate glufosinate
  • 15 is a diagram showing the HPLC results of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention.
  • Figure 16 is a diagram showing the killing power of the active material fraction of the ethyl Arthur Tate (EA-1, EA-3, EA-4, EA-5, EA-6 and EA-7) of the strain of the present invention (EA : Ethyl Acetate fraction). 17 is a diagram showing the herbicidal power by the foliage treatment of EA-3, EA-4 and EA-5 shown in the HPLC results of the ethyl acetate fraction of the strain of the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing herbicidal activity of Streptomyces scopulididis KR-001 strain culture filtrate according to the type of carbon source.
  • 19 is a diagram showing the herbicidal activity of Stratumomyces scopulididis KR-001 strain culture filtrate according to the type of nitrogen source.
  • FIG. 20 is a diagram showing the herbicidal activity of S. aureus Scopullidis R-001 strain culture filtrate according to a carbon source and nitrogen source combination.
  • FIG. 21 is a graph showing quantitative standard graphs of the biocidal substances A (top) and B (bottom) produced by Straintomyces Scopulillidis KR-001 strain.
  • FIG. 22 is a diagram showing the herbicidal activity of the optimum culture medium of S. aureus Scopulillidis KR-001 strain.
  • mass production is markedly greater than the number of cells of St.tomyces skopulididis cultured in an industrial medium (eg, bennet medium) used in the art for culturing Sliptomyces skopulididis.
  • an industrial medium eg, bennet medium
  • Straptomyces scopulilidis medium composition is added to Straptomyces scopulilidis medium, Stemtomyces scopulilidis culture composition, or Stemtomyces scopulilidis medium. Wami the composition.
  • the present invention provides Streptomyces scopuliridis (5 / -i3 ⁇ 4D [KCi? S scopuliridis) KR-001 strain deposited with accession number KCTC 12156BP.
  • Strapomyces scopulididis SYrepio / Hjres scopuliridis R-001 strains (hereinafter referred to as KR-001 strains) according to the present invention are isolated from forest soils around Daecheongho, Cheongwon-gun, Chungcheongbuk-do, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. Strains obtained through culturing were stored in lyophilized and stored in -7CTC deep freezer and used.
  • the KR-001 strain was identified as a novel strain showing about 99.7% homology with the S. aureus of S. aureus, Streptomyces skopulididis (5 / 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4? 5 scopuliridis).
  • the present inventors named the novel strain as Straptomyses scopuliridis (5 "Qo ⁇ 3 ⁇ 4 i: fts scopuliridis) R-0 () 1 to the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC). Deposited on the date of September 09 was given accession number KCTC 12156BP
  • the present invention is Streptomyces Scopulillidis K -001 strain, the culture thereof, the extract of the culture solution, or the culture or deposited with the accession number KCTC 12156BP It provides a herbicide composition for weed control containing any one or more selected from the group consisting of a fraction of the extract and the active fraction of the fraction as an active ingredient
  • the extract of the strain culture solution can be obtained through extraction with an organic solvent And preferably an organic solvent selected from the group consisting of d to C 4 alcohols (e.g. methanol, ethanol, propane, butane, etc.), nucleic acids and ethyl acetate. Extraction can be performed using poisons or
  • Fractions of the culture or extract is preferably fractionated using nucleic acid, ethyl acetate, butanol and water as a solvent, but is not limited thereto.
  • the active fraction is the fraction eluted from the column or the column fraction chromatography of the culture solution or extract using methanol, ethane or an aqueous solution thereof in 6 minutes to 7 minutes, 8 minutes to 10 minutes or 15 minutes to 20 minutes. Preferred but not limited to this.
  • the flower and the weed is preferably one selected from the group consisting of Batang oo / 5 sanguinalis), sorghum Sorghum bicolor), 7 ⁇ .Agropyron smithii) and (Echinochloa crus-gal 1).
  • the broadleaf weeds are (5 / a / 7M / nigrum), Cactus 3 ⁇ 43 ⁇ 4o / »a» e indica, Cactus (4 ⁇ > ⁇ // ⁇ / 7 avicennae), SH v ⁇ ⁇ - ⁇ (Xan th iiim strumarium ) And ⁇ (Calystegia japonica) ⁇ — any one selected from the group consisting of is preferred, but not limited to:
  • the heat weeds are weeds that are difficult to control, such as thorny angulatus), Ginseng vine G3 ⁇ 4 / i japoniciis), ⁇ ⁇ Art em is ia princes), ⁇ . 7 (Equisetim arvense), and clover (7 / ⁇ // ⁇ / preferred one selected from the group consisting of repens), but is not limited thereto.
  • the culture solution, extracts thereof, fractions of the culture solution or extract, or active fractions of the fractions are any selected from the group consisting of Herbicidin A, Herbicidin B, and Herbicidin F. One or two or more are preferred but not limited thereto.
  • the herbicide composition for weed control may include a carrier and / or a lye agent.
  • the term 'carrier' refers to an inert, organic or inorganic, active compound having a composition or composition that is compatible or made to facilitate its application, or its storage, transportation and / or handling to a plant or other subject to be treated. Mean material.
  • the diluent or carrier include, but are not limited to, water, milk, ethane, mineral oil and glycerol.
  • the present inventors confirmed that the herbicidal power was excellent by treating the culture medium of the R-001 strain with three plants, weeds and five broadleaf weeds by concentration (see Table 3 and FIG. 2).
  • the present inventors fractionate the culture medium with nucleic acid, ethyl acetate, butane and water layer, and fractions of each solvent are treated with four plants, weeds and five broadleaf weeds by concentration, and the ethyl acetate fraction and butane are fleshed out from the fraction. It was confirmed that the superpower is excellent (see Table 4 and Figure 3). Ooh
  • the present inventors confirmed the herbicidal power of the ethyl acetate fraction by treating the soil and foliage treatment of the four acetates, weeds and five broadleaf weeds according to the concentrations (see Tables 5 and 6). .
  • the present inventors confirmed that the ethyl acetate fraction was cured with spiny gourd under greenhouse conditions to completely control spiny gourd at concentrations of 2000 ng ml / 1 and 1000 ug ml / 1 (see FIG. 6).
  • the present inventors confirmed that the ethyl acetate fraction has a thorn control effect through the body transition under greenhouse conditions (see FIG. 7).
  • the present inventors confirmed that the ethyl acetate fraction was excellent in the herbicidal power by treating the foliage by the concentration in the thorn gourd under the packaging conditions, and the herbicidal power was increased as time passed and the drug sustainability was excellent (Table 7 and FIG. 8).
  • the present inventors have confirmed that the ethyl acetate fraction has excellent herbicidal properties by foliage treatment on heating weeds such as round ginseng, wormwood, horsetail, and clover under packaging conditions (see Table 8, FIGS. 9 10 11 and 12).
  • the present inventors confirmed that the ethyl acetate fractions were hardened to the crops and crops (rice, wheat, barley) and broadleaf crops (pepper, tomato) in all five crops, causing no damage to crop selectivity (Table 9 and FIG. 13).
  • the present inventors detected the fraction eluted using the active material of the ethyl acetate fraction in the column chromatography using methane, ethanol or an aqueous solution thereof (see Fig. 15).
  • Herbicidine A, Herbicidine B and Herbicidine F were separated from the detected fractions.
  • the killing power of the detected fraction, that is, the active fraction was excellent (see FIGS. 16 and 17).
  • the strapomas scopulididis KR-001 strain deposited with the accession number KCTC 12156BP of the present invention its culture, the extract of the culture, the culture
  • the fraction of the extract and the active fraction of the fraction can be usefully used as an active ingredient of the herbicide composition for weed control because it shows excellent herbicidal power against the flower weed, broadleaf weeds, heating weeds.
  • the present invention is selected from the group consisting of Straptomyths scopulididis KR-001 strain deposited with the accession number KCTC 12156BP, cultures thereof, extracts of the cultures, fractions of the cultures or extracts and active fractions of the fractions. It provides a weed control method comprising the step of treating any one or more of the weeds, its seeds or its habitat.
  • the present inventors can treat the culture solution, solvent-specific fractions, ethyl acetate fractions in plants or the soil treatment.
  • the culture solution, solvent fractions, ethyl acetate fractions are powder, coarse dust, micro granules, granules, wettable powder, emulsif iabl concentrate, liquid solvent, suspension concentrate Water, water-decomposing granules or oil suspensions.
  • the culture solution, solvent-specific fractions, ethyl acetate fractions were confirmed that the soil treatment applied to the foliage treatment or soil applied directly to the stems and leaves of plants have excellent herbicidal power against the flowers and weeds, broadleaf weeds, heating weeds.
  • Streptomyces scopulididis KR-001 strain deposited with Accession No. KCTC 12156BP of the present invention its culture, extract of the culture, fraction of the culture or extract, and active fraction of the fraction are treated with foliage or soil treatment. If it is excellent in killing power, it can be useful as a weed control method for treating weeds, their seeds or their habitat.
  • the present invention also provides a medium composition for mass production of Streptomyces scopuliridis strain containing potato starch and soybean powder as an active ingredient.
  • the potato starch is preferably contained 1 to 3% (w / v), soybean powder 0.5 to 2% (w / v), potato starch 3% (w / v) and soybean powder 2% (w / v) More preferably.
  • the straptomyces scopulididis strain is preferably a straptomyces scopulididis R-001 strain deposited with accession number KCTC 12156BP, but is not limited thereto.
  • composition preferably further comprises glucose, but is not limited thereto.
  • the composition preferably contains, but is not limited to, potato starch (w / v), glucose l% (w / v) and soybean powder l> (w / v).
  • the present inventors include soy peptone to select a carbon source suitable for the growth of microorganisms and the production of herbicidal active material as a culture medium of S. a. Sp. To the minimal nutrient medium are added the carbon sources glucose, sucrose, soluble starch, potato starch, corn starch, maltose and molasses.
  • skim milk which is an organic nitrogen source in a basic medium containing glycerol (skim milk) , tryptone (tryptone), meat extract (beef extract), peptones (peptone), corn sulfuric acid immersion liquid (corn steep liquor, CSL), soya powder (soybean powder), Kaze i of peptone (casein peptone), yeast extract ( yeast extract), soy peptone, and the final pH, microbial growth, and herbicidal activity of the culture filtrate inoculated with the culture medium inoculated with pre-cultured Streptomyces scopulididis and the control culture filtrate.
  • the inventors of the present invention in order to select a carbon source and nitrogen source in a suitable medium for the growth of microorganisms and the production of the herbicidal active substance as a culture medium of Straptomyces scopulididis KR-001 strain, potato starch, corn starch or maltose, And the final pH, microbial growth, and herbicidal activity of the culture filtrate inoculated and the culture filtrate inoculated with the streptomyces skopulididis precultured with the addition of a nitrogen source meat extract, soybean powder, or yeast extract.
  • bacterial growth is very good and shows 90% herbicidal activity, and final pH ranges from 5 to 7. It was confirmed that it appears as (see Table 13 and Figure 20).
  • the present inventors 1 to 3% (w / v) in order to establish a carbon source and nitrogen source optimum medium composition suitable for the growth of microorganisms and the production of the herbicidal active material as a culture medium of the Straptomyces scopulididis KR-001 strain Culture filtrate and 1 ⁇ 2 (w / v) potato starch, (w / v) glucose, inoculated with a culture medium containing potato starch and 0.5-2% 0 / v) soybean powder and pre-cultivated with S.tomyces skopulididis preculture.
  • the inventors of the present invention in order to confirm the herbicidal activity of the optimal culture medium of the Streptomyces scopulididis KR— 001 strain, the culture medium in which the Streptomyces scopulididis KR-001 strain was cultured using the optimum medium As a result of spray foliage treatment, it was confirmed that the culture medium cultured with the optimum medium showed strong herbicidal power (FIG. 22).
  • the medium composition for mass culture of Stemtomyces scopulididis strains is excellent for the microbial growth and herbicidal activity, and the production cost reduction effect, and for the mass culture of Straptomyces scopulariaas strain for the production of weed control agents. Can be used.
  • the present invention provides a method for mass production of S. aureus scopulididis strain using a medium composition containing potato starch and soybean powder as an active ingredient.
  • step 2) after inoculating 1 to 3% (w / v) of Streptomyces scopulididis strain in the medium composition of step 1), the strapomas scopulididis comprising culturing for 5 to 7 days Provided is a method for mass production of strains.
  • the medium composition of step 1) preferably further comprises glucose, but is not limited thereto.
  • the medium composition of step 1) preferably contains 1 to 3% (v / v) potato starch and 0.5 to 2% (v / v) soybean powder, but is not limited thereto.
  • step 1) After inoculating the Stemtomyces scopulidis strain to the medium composition of step 1), it is preferable to incubate for 5 to 7 days at 150 to 300 rpm at 25 to 30 ° C, at 170 rpi at 27 ° C It is more preferable to culture for 5 days.
  • the Streptomyces scopulidis strain is preferably the Straintomyces scopulididis KR-001 strain deposited with accession number KCTC 12156BP, but is not limited thereto.
  • Stemtomyces scopulidis strain culture medium produced using the medium composition containing the potato starch and soybean powder as the active ingredient of the present invention is excellent in microbial growth and herbicidal activity, and reduced production cost, weed It can be usefully used for mass culture of Streptomyces scopulididis strains for the production of control agents.
  • the present invention accession number for use as a herbicide composition for weed control Provided are Streptomyces scopulididis KR-001 strains deposited with KCTC 12156BP, cultures thereof, extracts of the cultures, fractions of the cultures or extracts, and uses of the fractions.
  • the strapomas scopululiedes KR-001 strain deposited with the accession number KCTC 12156BP of the present invention its culture, the extract of the culture, the fraction of the culture or extract and the active fraction of the fraction is the flower and weed, Since it shows excellent herbicidal power against broadleaf weeds and heating weeds, it can be usefully used as an active ingredient of the herbicide composition for weed control.
  • the present invention provides the use of Stemtomyces scopulididis strain medium comprising potato starch and soybean powder as an active ingredient for use as a mass production medium composition.
  • Streptomyces scopulididis KR-001 strain deposited with Accession No. KCTC 12156BP of the present invention its culture, the extract of the culture, the fraction of the culture or extract and the active fraction of the fraction is a flower, weeds, broadleaf Since weeding ability is excellent against weeds and heating weeds, it can be usefully used as an active ingredient of the herbicide composition for weed control.
  • the present invention will be described in detail by way of examples.
  • HV agar (Humic acid-Vitamin) medium was used to separate the soil from Daecheong-ho, Cheongwon-gun, Cheonwon-gun, and the appropriate concentration of cyclohexamide or nalidixic acid to suppress the growth of bacteria and bears. ) was used. After 1 g of each soil sample was added to 10 ml of sterile saline solution and thoroughly mixed with vortex, each sample was plated with 100 ul in a separation medium and incubated at 28 ° C. for a period of time. During the incubation period Periodically observing the culture state, the cultured colonies were inoculated in fresh medium, single colonies were isolated purely, and selected by observing under a microscope. Actinomycetes isolation medium and culture conditions are as follows (Table 1).
  • Each strain isolated from the pure water was incubated on agar medium, the cells were collected, suspended in 203 ⁇ 4 sterile glycerol and stored in -70 ° C cryogenic refrigerator. In addition, lyophilized preservation was carried out for long-term preservation. Each isolated strain was cultured in a solid medium, suspended in sterile 10% skim milk (skim mi lk), lyophilized and stored at 4 ° C. or lower.
  • colony PCR was performed to obtain the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of the strain.
  • a single colony was picked up with a toothpick, mixed with PCR-premix (iNtRON Biotechnology, Korea) and amplified 16S rRNA gene using 27f and 1492r primers.
  • the amplified PCR product was purified using a Wizard PCR prep kit (Promega, Med i son, WI, USA), and then a nucleotide sequence was obtained by requesting a macrogen (Daejon, Korea).
  • the base sequence was compared with GenBank database and base sequence using NCBI BLSAT.
  • the sequences were sorted by CLUSTAL X, and a neighbor-joining tree was created using PHYDIT program version 3.0.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the 16S rRNA gene of the strain was analyzed based on the neighbor-joining algorithm.
  • the strain was found to be a novel strain showing about 99.7% homology with S. aureus Scopulididis RB72T (FIG. 1).
  • the strain used in the present invention was identified as a strain of 5 re? Ia »yc & s scopul iridis.
  • the strain was designated as Straeptomyces scopulididis (5ir3 ⁇ 4D o / »j ⁇ es scopul iridis) KR-0 () 1 and deposited on March 09, 2012 to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. Deposited as 12156BP.
  • Streptomyces skopulididis cultured for 7 days at 27 ° C, 180 rpm by injecting 500 ml of Bennet liquid medium in 500 ral baffled flask 1% inoculation Take supernatant of KR-001 strain culture solution and dilute to 1, 1/2, 1/4 concentrations (including Tween-20 0.1%), 3 kinds of flowers and weeds (barium, sorghum, dolpi) and 5 broadleaf weeds ( The leaves were treated with 14 ml per pot for the leaves, silkworms, larvae, larvae, buckthorn flowers, to increase their herbicidal power after 5 days. It was evaluated through a survey by the weak criteria table. At this time, the composition components of the Bennett medium are shown in the following [Table 2].
  • the killing power for the eight species in the culture stock solution was 90% to 100%, even at a concentration of 70% to 100%.
  • weeding power against barren, itch, silkworm grass was relatively strong.
  • Sustained killing ability was increased over time after the treatment, and the main symptom was burndoTO.
  • the main symptoms were burndoTO, and some plants and plants were turned purple at the quarter concentration (Table 3 and FIG. 2).
  • composition Components of Bennett Badge
  • Streptomyces scopulidis KR-001 strain culture was fractionated with nucleic acid, ethyl acetate, butane and water layer. 8 g mL “1 , 16 ug mL _1 , 32 ⁇ ⁇ mL “ 1 , 63 ug mL “1 , 125 yg mL “ 1 , 250 11 g mL “1 and 500 yg mL " After 5 days of foliage treatment at 1 concentration, the herbicidal power was evaluated by vascular observation by the standard table for weakening of external symptoms and drug efficacy.
  • weeds battery, sorghum, stone lumps, wheat
  • broad-leaf weeds Acanthosis, larvae, estuary, hawk, buckwheat
  • the ethyl acetate fractions of the Straintomyces Scopullidis KR-001 strain cultures were 2000 pg mL ⁇ 1 , 1000 ug mL "1 , 500 ng ml ' 1 , 250 yg mL "1 , 125 yg mL " 1 was prepared and sprayed, and after 15 days of treatment, the external symptoms and efficacy were weakened, and the crown was examined by the reference table (0% to 100%).
  • the herbicidal power of the target weed species at the concentration of 2000 Ug mL "1 ethyl acetate fraction was 95% to 100%, and sorghum and the mother at 1000 ug mL " 1 concentration.
  • Complete control activity (100%) was shown for all species except the first species.
  • sorghum and pups appeared on the ground but died, while other species did not appear on the ground. This phenomenon occurred after each weed seed germination and passed through the treatment layer. It was assumed that the acetate fraction was killed by contact.
  • the experiment was carried out as follows to determine the activity of the foliage treatment of the fraction of the strain culture solution of the present invention obtained from the ⁇ Example 4>.
  • the above ⁇ Ethyl acetate fraction of the strain culture of the present invention obtained from Example 4> was prepared as a pharmaceutical preparation solution (50% acetone, Tween-20 0.1%) 2000 yg mL " 1000 pg mL “ 1 , 500 yg mL “1 , 250 yg mL—125 yg mL “1 , 62.5 yg mL " 1 concentrations of Dodo-dock lime were prepared by spray foliage treatment, and after 12 days of treatment, the external symptoms and efficacy were weakened, and the crown was examined by the reference table (0% to 100%). .
  • the potency of 9 weeds at 1 treatment concentration showed strong activity of 95% to 100%, and was excellent at 80% to 100% even at 500 yg mL— 1 concentration.
  • the external symptoms were expressed and the effect was increased as the treatment date progressed.
  • the herbicidal power was maintained even after 10 days of drug treatment, and it was confirmed that there was residual persistence.
  • the main symptom is the formation of a needle bed at the beginning of treatment It passed and eventually deciduous.
  • the ethyl acetate fractions were cultivated at 2000 g raL “1 and 1000 mL " 1 concentrations in thorny shoots grown up to 3 leaf stages under greenhouse conditions, and then irradiated after 7 days.
  • the ethyl acetate fraction prepared at 1000 yg mL— 1 concentration on the three leaf stems was wetted with gauze, sealed with aluminum foil, and then subjected to local treatment. In this case, it was allowed to be absorbed into the plant for 24 hours in dark condition. After 24 hours of treatment, the gauze and aluminum foil were removed and managed in the same greenhouse conditions daily to observe their performance and then inspected after 6 days of treatment.
  • the ethyl acetate fraction of the strain culture solution of the present invention obtained from Example 4 has a strong control effect in greenhouse conditions against barley gourd, which is an environmental hazard plant designated as "ecological disturbance wild plant" by the Ministry of Environment.
  • On-site application evaluation was performed under actual packaging conditions.
  • the field test site was in the area of the Namhan River in front of the town hall of Andeok-ri, 31-15, Andeok-ri, Gaegun-myeon, Yangpyeong-gun, Gyeonggi-do. The test period was conducted from September 22, 2011 to October 06, 2011.
  • the growth of spiny gourd during the drug treatment was 10 to 15 leaves and the length was 2 m to 3 m, and the treatment compartment was 1 m X 1 m and treated with 300 mL for each concentration.
  • the ethyl acetate fraction was weighed to a concentration of 2000 g mL "1 and 4000 yg mL " 1 , dissolved in a small amount of acetone, and diluted with a pharmaceutical preparation (including 50% acetone and Tween—20 0.1%). , 5 days, 8 days and 14 days after the treatment was visually inspected.
  • the killing power against spiny gourd under the packaging conditions of the ethyl acetate fraction of the strain culture solution of the present invention is improved over time after the drug treatment, it is excellent drug sustainability receive wake, 4000 ug mL "processing from the first concentration, 5, 8 and 14 visible foil antifungal activity after days was respectively 50%, 90% and 100%, 2000 ug mL controlling effect on eu 1 are respectively 40%
  • the herbicidally active substances derived from natural products are usually fast-acting and start to express their efficacy within several hours of treatment, and the short duration of drug treatment is known to be regenerated after a certain period of time.
  • DAT Days after treatment (Example 10) ⁇ Example 10> of the culture medium fraction of Straptomyce scopulididis KR-001 strain Control Effect of Foliage Treatment on Heating Weeds (Pear Ginseng, Wormwood, Horsetail, Clover)
  • the test was carried out by selecting the area where weeds grow on the periphery of the Korea Institute of Chemical Research, Yuseong-gu, Daejeon. The test period was from October 4, 2011 to October 16, 2011. The treatment section was treated with 1 mx 1 m and treated with 200 mL for each concentration.
  • the final treatment concentration of the ethyl acetate fraction of the strain culture solution of the present invention obtained from ⁇ Example 4> was weighed to be 2000 Lig mL "1 and 4000 yg raL " 1 concentration and dissolved in a small amount of acetone. 50% acetone, containing 0.1% of Tween-20) to prepare a dilution.
  • the ethyl acetate fraction of the strain culture solution of the present invention obtained from the ⁇ Example 4> showed an excellent control effect against hwanui ⁇ oysters (ffui his japonicus), 2000 g mL "1 and 4000 ug mL- processing in the first concentration after 5 days is shown approaching control efficacy of 40% and 30%, the effect is rapidly advanced after each 10 days are 100% and 95%, respectively, 15 days after treatment
  • the concentrations showed 10 OT killing power (Table 8 and Fig. 9).
  • the same phenomena that appeared in thorns showed that the killing power continued to increase over time after treatment, so that the killing power was maintained until 15 days after treatment. It was confirmed that there is a characteristic that the effect persists.
  • the ethyl acetate fraction of the strain culture solution of the present invention obtained from the ⁇ Example 4> showed an excellent control effect for ⁇ ⁇ Artemisia princeps) ⁇ , 2000 yg mL “1 and 4000 g mL— It showed complete control effect against mugwort at 1 concentration. After 3 days of treatment, the effect started to manifest. After 5 days, it was completely controlled at 4000 ug mL "1 concentration, 2000 yg mL " 1 concentration. Eighty percent was 80% after 8 days, both concentrations were 100% was confirmed that the herbicidal power is maintained (Table 8 and Figure 10).
  • the ethyl acetate fraction of the strain culture solution of the present invention obtained from the ⁇ Example 4> showed an excellent control effect for the horsetail arvense) ⁇ , 5 days treatment Afterwards it showed a killing power of 95% and 90) at 4000 yg mL— 1 and 2000 ng mL “1 concentrations respectively, and completely died after 8 days (Table 8 and FIG. 11).
  • the crops were planted with rice, wheat and barley and three crops, and two broad-leaf crops such as pepper and tomato. At the time of treatment, the growth of each crop was 3.5 leaves of rice, 1.2 leaves of wheat, 1 leaf of barley, and 7.3 leaves of pepper. , It was 4.4 leaves of tomato.
  • Treatment concentrations were 4000 mL “1 , 2000 ug tiiL ⁇ 1 , 1000 g mL “ 1 , 500 mL "1 , 250 g mL '1 and 125 ixg mL— 1, and after 14 days of treatment, The survey was conducted.
  • the ethyl acetate fraction, bialaphos, and glufosinate of the strain culture solution of the present invention obtained from Example 4 were 250 ug ml / 1 , 500. It was confirmed that at a concentration of g mL "1 and 1000 yg mL " 1, there was an equivalent level of killing power (FIG. 14). Therefore, the killing power of the ethyl acetate fraction of the strain culture of the present invention is judged to be similar to the control compound Bialaphos (Bialaphos) or glufosinate (Glufosinate).
  • a minimum nutritional medium was prepared by adding 0.5% (w / v) soy peptone (5 g / L) to a 500 ⁇ baffled flask, followed by industrial glucose glucose. 1.0% (w / v) (10 g / s) of sucrose, soluble starch, potato starch, corn starch, maltose and molasses, respectively. added so as to have a L), the ⁇ example 1> prior to a culture broth of 2% inoculum and incubated at 27 ° C 5 days with shaking with 170 rpm on.
  • aheul multiple baffle de flask of 500 as a control group Bennett into the liquid medium 500 the ⁇ Example 1> around the cultured broth in a 2% inoculation 27 ° C and a 170 rpm 5 days with shaking culture described in It was.
  • the growth of the bacteria is very good and show about 70% herbicidal activity as compared to the Bevet medium culture medium, soluble starch
  • the growth rate of the bacterium was similar to that of the Bennett medium, but the herbicidal activity was confirmed to be 60%.
  • the pH was in the range of 6 to 7, and the growth of bacteria was also very good (+++).
  • the pH of the medium containing sucrose and molasses which were low as 20% of the herbicidal activity, was about 9, and the bacterial growth was also normal (++) level. Therefore, the generation amount of the herbicidal active material according to the carbon source type through the above results Or changes in metabolite types, which affect the pH of the culture filtrate. Ultimately, the herbicidal activity is relatively high because the highest amount of active substance is produced when the pH of the culture filtrate is around 5 to 7. It was confirmed that the expression is high (Table 11 and Figure 18).
  • a basic medium containing 2% (v / v) glycerol (20 as a carbon source) was prepared in a 500 ⁇ baffled flask, followed by organic nitrogen sources such as skim milk and tryptone.
  • tryptone meat extract, peptone, corn steep liquor (CSL), soybean powder, casein peptone, yeast extract, soy peptone 0.5% (w / v) (5 g / L) was added, and the cultured culture medium of ⁇ Example 1> was inoculated at 2% and shaken for 5 days at 170 rpm at 27 ° C.
  • the culture solution was the same as in Example 15 above.
  • the optimal medium for the production of bioactive substances of strain R-001 was selected.
  • potato starch, corn starch or maltose which is a carbon source having excellent herbicidal activity, selected from ⁇ Example 15> and ⁇ Example 16> in 500 baffled flasks, meat extract, soybean powder, Alternatively, yeast extracts were added at W (w / v) and 0.5% (w / v) conditions, respectively, and after 2% inoculation of the preculture of ⁇ Example 1>, the initial pH of each medium was 6.95 to 7.10. The mixture was shaken and cultured at 27 ° C. and 170 rpm for 5 days.
  • the herbicidal activity in the 5-day culture was relatively higher than in the other carbon sources, but the herbicidal activity was rather lower in the 7-day culture.
  • the herbicidal activity in the 5-day culture was slightly lower than that of the corn starch, but the activity was kept constant even in the 7-day culture, and it was confirmed that the herbicidal activity was relatively low when maltose was used.
  • the soybean powder was used as a nitrogen source, the growth of bacteria was generally good regardless of the type of carbon source, and the herbicidal activity was also relatively high.
  • the herbicidal activeol was determined according to the optimum ratio and ratio of potato starch, the final selected carbon source, and soybean powder, the final selected nitrogen source, selected from ⁇ Example 17>, and the herbicide of the Straintomysis skopulididis KR-001 strain An optimal medium composition was established that was most suitable for the production of the active substance.
  • the biocidal substances A and B produced by Straptomyces skopulididis KR-001 strain are prepared by concentration, HPLC under the conditions of the following [Table 14] By quantifying the area of the peak appearing by concentration through the analysis, a calibration curve was prepared, and the content of the biocides A and B in each culture medium was quantified by HPIX analysis. HPLC analysis for each concentration of bioactive substance A and B was repeated three times. Optimal media composition and culture conditions were established by analyzing 35% methanol at 245 nm with a mobile phase using a Shimadzu ODS column (4.6 ⁇ 300 mm 3).
  • the highest ratio of 64.32 iig / inL in the combination of potato starch and soybean powder (23 ⁇ 4) was 64.32 iig / inL. It was confirmed that the production amount also tended to increase.
  • the culture medium cultured Straptomyces scopulididis KR-001 strain using the Bennett medium described in the above [Table 2] and the Straptomyces scopulifidis using the optimal medium of the ⁇ Example 18> Eight times the culture medium cultured K-001 strain After spraying, the leaves were sprayed on the basin under greenhouse conditions, and after 3 days, the external symptoms were confirmed.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 균주인 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 및 상기 균주, 이의 배양액, 또는 상기 배양 분획물은 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 난방제 잡초에 우수한 살초력을 나타내고, 탄소원과 질소원을 최적조건으로 함유된 배지 조상물은 저비용으로 상기 균주가 생산하는 활성물질의 수율을 현저히 증가시킬 수 있으므로, 상기 균주를 잡초 방제용 제초제 조성물 및 잡초 방제 방법으로 유용하게 사용할수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주， 또는 이의 배양액을 유효성 분으로포함하는 잡초 방제용 조성물
.
【기술분야】
본 발명은 살초활성을 갖는 신규한 스트템토마이세스 스코풀리리디스 (Streptomyces scopuliridis) 균주 및 상기 균주의 대량생산용 배지 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
잡초의 종류는 너무나 많기 때문에 다양한 분류방법이 있지만 농업에서 이용하는 일반적인 분류방법은 잡초의 형태에 의한 분류와 생활사에 의한 분류 방법이 있다. 형태에 의한 분류 방법은 잡초의 모양이 어떻게 생겼는가에 따라 잡초를 구분하는 방법으로 화본과잡초， 광엽잡초， 사초과잡초 등으로 구분된다. 생활사에 의한 분류 방법은 잡초가 얼마나 오랜 기간 동안 살아가는가에 따라 구분하는 방법으로 1년생잡초， 2년생잡초， 다년생잡초 등으로 구분된다. 화본과 (grasses) 잡초의 줄기에는 잘 구분될 수 있는 마디와 마디 사이가 있고, 잎은 마디로부터 어긋나기로 나 있으며 잎은 줄기를 둘러싸서 보호하는 잎집 (leaf sheath)과 잎몸 (leaf Made)으로 나누어지는데 잎몸은 좁고 기다란 모양으로 잎맥 (leaf vein)이 평행하게 형성된 것이 특징이다. 피 , 바탱이， 뚝새풀 강아지풀， 갈대， 억새 등이 이에 속한다. 광엽 (broad leaves) 잡초란 화본과 잡초나 방동사니과 잡초에 속하지 않는 식물로서 말 그대로 잎이 비교적 넓은 잡초이다. 잎은 주로 타원형， 난형， 피침형이며 엽맥이 그물처럼 얽혀 있는 것이 특징이다. 우리 주변에서 흔히 발생하는 망초， 토끼풀， 쑥， 냉이, 비름， 물달개비, 가래, 가막사리 등 많은 잡초가 이 범주에 속한다. 방동사니과 (sedges)에 속하는 잡초들은 화본과와 비슷한 점이 있으나 대부분 줄기 횡단면이 삼각형 모양이며 잎혀나 잎귀가 없다는 점으로 구분이 된다. 잎은 좁고 능선이 있으며 끝이 뾰족하고 소수에 작은 꽃이 달린다. 방동사니， 너도방동사니 올방개， 매자기， 올챙이고랭이 둥이 속한다. 가시박 ( >W angulatus L.)은 북아메리카가 원산지인 박과의 1년생 귀화식물로 국내 강변， 도로변， 철로변， 농경지는 물론 생활주변까지 집단적으로 발생하여 생태계를 심각하게 파괴하고 있는 잡초로서 환경부에서는 야.생동식물보호법 시행규칙에 생태계교란 야생식물로 지정하고 있다. 가시박은 생육이 왕성하며 종자 생산량이 많고 군락을 형성하여 자라기 때문에 초본식물은 물론 수목까지 덮어 광합성을 저해하여 고사시키며, 토양 수분 및 질소의 수탈과 교란을 일으켜 기존 식생을 파괴하여 생물 다양성올 변화시킬 뿐만 아니라 종자 표피에 있는 가시 때문에 피부병을 유발하는 등 인ᅳ축에게도 직접적으로 피해를 주고 있다. 현재 가시박은 국내 전 지역에서 분포하고 있으며 점차 분포지역이 확산되어 심각한 피해를 야가하고 있어 이의 방제를 위한 제어기술 개발이 ¾실히 요구되고 있다. 현재까지 알려진 가시박 제거 방법은 베거나 어린 식물을 뽑는 것인데，' 매우 많은 노동력을 필요로 한다. 일부 농경지에 발생한 가시박은 글리포새이트 (glyphosate)와 같은 비선택성 유기합성 제초제를 사용하면 일부 방제는 가능하지만， 가시박의 주된 발생지 및 군락지가 강변이나 도로변 또는 사람들이 활동하는 생활주변이기 때문에 유기합성 제초제를 이용하는 제어는 현실적으로 매우 제한적일 수밖에 없는 실정이다.
더구나 유기합성 제초제의 연용에 따른 저항성 잡초의 출현 및 생태계에 미칠 잠재적 영향과 환경오염에 대한 문제가 부각되고, 소득향상과 삶의 질을 중시하는 풍토가 조성되면서 친환경 농업에 대한 관심이 높아짐에 따라 합성농약 사용을 저감하기 위한 세계 각국의 규제가 강화되고 있기 때문에 주로 생활주변에서 발생하고 있는 가시박은 기존 유기 합성 제초제를 이용하여 제어하는 것은 더욱 어려운 상황이 되고 있다.
이에， 인ᅳ축에 독성이 낮고 자연조건에서 분해가 용이한 천연물 또는 생화학제를 이용하여 가시박을 친환경적으로 방제하는 기술이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 유기합성 제초제는 저렴한 비용과 높은 살초활성으로 오랜 기간 사용되어왔으나 연용에 의한 저항성 잡초의 출현 및 환경오염 등의 이유로 저독성으로의 생분해가가능하고 선택성을 갖는 환경 친화적인 제초제 개발에 관한 관심이 증대되고 있다. 특히 방선균을 포함한 미생물이 생산하는 살초활성 물질의 경우 효율이 높고 환경 친화적인 특징을 지녀 연구재료로써 뿐만 아니라 산업적 응용분야에서도 큰 관심올 받고 있다. 또한, 스트랩토마이세스 속을 포함하는 방선균은 균사 형태로 생장하는 그램 양성 토양미생물로서， 제초제 등의 항생물질뿐 아니라 다양한 종류의 유용한 2차 대사산물을 생성하기 때문에 학문적으로나 산업적 웅용 측면에서 연구자들의 관심을 끌고 있다. 지금까지 방선균이 생산하는 2차 대사산물을 활용한 제초활성 물질의 예로는 Streptomyces saganonens i s7\ 생산히 "는 herbicidin과 herbimycin, S. act inomycetes7\ 생산하는 anismycin, 그리고 S. vir idochromogenes7\ 생산하는 bialaphos, S. a I bus subsp. subsp. chlorinus NRRL B-241087]- 생산하는 albucidin, S. viridichromogenes^\ S. hygroscopicus6^ ] 분리된 glufosinate— ammonium 등을 들 수 있으며， 그 중에서 bialophos와 ansamitocins 등은 제품화 되어 깔매되고 있다.
그러나 많은 연구사례에도 불구하고 살초활성이 우수하고 저독성의 안전한 잡초방제용 천연물 제초제로의 개발은 극히 제한적이이며， 연구개발이 진행 중인 대부분의 미생물 제초제 또는 식물 유래의 제초제들은 대부분 농경지에 발생하는 잡초를 대상으로 하고 있다. 따라서 살초활성이 우수하며 저독성의 환경 친화적 천연물 농약으로 사용할 수 있는 신규 미생물의 탐색이 여전히 요구되고 있으며， 천연물 제초제 소재로 스트렙토마이세스 속 균주의 활용가치를 높이기 위해 경제적으로 비용을 절감하면서도 균주의 생육 증식 및 활성물질의 생산을 향상시킬 수 있는 최적화된 배지 선정의 필요성이 대두 되고 있다. 미생물 배양에 있어'서 탄소원으로는 포도당， 설탕， 엿당 등을 포함한 당류 및 당 추출물， 각종 전분 등이 이용되며， 질소원으로는 소고기 추출물 (beef extract), 맥아 추출물 (malt extract), 효모 추출물 (yeast extract), 콩가루 (soybean meal), 펩톤 (peptone) 등의 유기 질소원과 암모니아수， 암모늄 설페이트 ((NH4)2S04), 우레아 (urea), nitrate salts 등의 무기 질소원이 사용된다. 또한 균 생육 및 2차 대사산물의 생산을 돕기 위해 미네랄 및 비타민과 같은 미량원소들이 사용되기도 한다. 이들은 미생물 배양에 가장 필수적인 요소들로써 이들의 조합 및 조성비에 따라 균 생육 및 2차 대사산물의 종류와 생성에서 차이를 보인다. 이에, 본 발명자들은 친환경적인 천연물 유래 제초제 및 이의 대량생산 방법올 찾고자 노력하던 증， 신규한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (S roD OTycd^ scopuliridis) KR-001 균주， 이의 배양액， 또는 상기 배양 분획물이 화본과 잡초， 광엽 잡초 및 난방제 잡초에 살초력을 나타내고, 또한 상기 균주가 생산하는 활성물질의 수율올 증가시키는 탄소원과 질소원을 선발하여 최적조건을 확립하여 생산 단가를 절감시킬 수 있음을 확인함으로써， 상기 균주는 천연물 유래 잡초 방제제 소재와 대량생산에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】 본 발명의 목적은 신규한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스
Figure imgf000006_0001
scopuliridis) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주， 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성 물 및 상기 조성물을 이용한 잡초 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감자 전분 (potato starch) 및 콩 분말 (soybean powder)을 유효성분으로 함유하는스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산 용 배지 조성물 및 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산방법을 제공하 는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디
Figure imgf000007_0001
scopuliridis) KR-001 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주， 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주， 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 '및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군에서 어느 하나 이상을 잡초， 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 잡초 방제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 감자 전분 (potato starch) 및 콩 분말 (soybean powder)을 유효성분으로 함유하는 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (Streptomyces scopuliridis) 균주 대량생산용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 함유하는 배지 조성물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배지 조성물에 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주 1 내지 3%(w/v)를 접종한 후， 5 내지 7일간 배양하는 단계를 포함하는 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 K -001 균주, 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 용도를 제공한다. 아울러, 본 발명은 대량생산 배지 조성물로 사용하기 위한 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 포함하는 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 배지의 용도를 제공한다.
【유리한 효과] 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (S re^o//yces scopuliridis) KR-001 균주， 이의 배양액, 또는 상기 배양 분획물은 화본과 잡초， 광엽 잡초 및 난방제 잡초에 우수한 살초력을 나타내고, 탄소원과 질소원이 최적조건으로 함유된 배지 조성물은 저비용으로 상기 균주가 생산하는 활성물질의 수율을 현저히 증가시킬 수 있으므로， 상기 균주를 잡초 방제용 제초제 조성물 및 잡초 방제 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (5ire cw?yces scopuliridis) KR-001 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 계통수 (phylogenetic tree)를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 균주 배양액의 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 균주 배양액의 각 분획 (핵산, 에틸 아세테이트， 부탄올 및 물 분획)의 바탱이에 대한 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다:
Hexane Fr. : 핵산분획물;
EtOAc Fr. :에틸아세테이트 분획물;
BuOH Fr. :부탄을 분획물;
AQ Fr: 물 분획물;
CK: 음성대조군.
도 4는 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 토양처리시 제초효과를 농도별로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도아다.
도 6은 온실조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 가시박 ( angulatus)^} 대한 방제효과를 농도별로 나타낸 도이다.
도 7은 은실조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 체내 이행을 통한가시박 방제효과를 나타낸 도이다.
도 8은 포장조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 가시박에 대한 방제효과를 나타낸 도이다.
도 9는 포장조건에서의 환삼^굴 imi!us japonicus Sieb. & Zucc.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 방제효과를 농도별， 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 10은 포장조건에서의 쑥 {Artemisia princes Pampan)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별， 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다. '
도 11은 포장조건에서의 쇠뜨기 0 z//'5e 腿 arvense L.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별， 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 12는 포장조건에서의 클로버 repens L.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별， 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 13은 온실조건에서의 벼， 밀， 보리 등의 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽 작물 2종들에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 농도별 약해를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획 (EA fr.), 비알라포스 (Bialaphos) 및 글루포시네이트 (Glufosinate)의 경엽처리에 의한농도별 살초력을 비교한 도이다.
도 15는 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 균주의 에틸아서ᅵ테이트의 활성물질분획 (EA-l, EA-3, EA- 4, EA-5, EA-6 및 EA-7)의 살초력을 나타낸 도이다 (EA ： Ethyl Acetate fraction). 도 17은 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 결과 나타난 EA-3, EA-4 및 EA-5의 경엽처리에 의한 살초력을 나타낸 도이다.
도 18은 탄소원 종류에 따른 스트 ¾토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양 여액의 살초활성을 나타내는 도이다.
도 19는 질소원 종류에 따른 스트램토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양 여액의 살초활성을나타내는 도이다.
도 20은 탄소원과 질소원 조합에 따른 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 R-001 균주 배양 여액의 살초활성을 나타내는 도이다.
도 21은 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주가 생산하는 살초활성 물질 A (위) 및 B (아래)의 정량 표준 그래프를 나타내는 도이다.
도 22는 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 최적 배양 배지의 살초활성을 나타내는 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이에, 본 발명의 용어를 상세히 설명한다. 본 명세서에서 "대량생산" 은 당업계에서 스트랩토마이세스 스코풀리리디스를 배양하는데 이용하는 산업용 배지 (예컨대， 베넷 (bennet) 배지)에 배양된 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균체수보다 현저하게 성장， 증식， 증가 또는 향상된 것을 의미하며， 바람직하게는 최소 2 배 이상 성장, 증식 또는 향상되었음을 의미한다.
본 명세서에서 "스트랩토마이세스 스코풀리리디스 배지 조성물" 은 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 배지， 스트템토마이세스 스코풀리리디스 배양용 조성물 또는 스트템토마이세스 스코풀리리디스 배지에 첨가되는 조성물을 와미한다. 이하， 본 발명을상세히 설명한다. 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 (5 /-i¾D [KCi?s scopuliridis) KR-001 균주를 제공한다. 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 SYrepio/Hjres scopuliridis) R-001 균주 (이하, KR-001 균주로 기재함)는 한국생명공학연구원 (KRIBB)에서 충청북도 청원군 대청호 주변 산림토양으로부터 분리 및 배양올 통해 확보하여 -7CTC 초저온 냉장고 (deep freezer)에 동결건조하여 보존하고 있는 균주를 분양받아사용하였다.
KR-001 균주는 16S rRNA 유전자 상동성 검색에서， 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 RB72T와 99.7% 정도의 상동성을 나타내는 신규한 균주로 확인되었는 바， 이는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 (5 /·¾σ ο¾ ?·5 scopuliridis)로 분류되었다.
본 발명자들은 상기 신규한 균주를 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (5 "Qo <¾ i:fts scopuliridis) R-0()1로 명명하여 한국생명공학연구원 생명자원센터 (KCTC)에 2012년 03월 09일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 12156BP를 부여받았다. 또한， 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 K -001 균주， 이의 배양물， 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성물을 제공한다. 상기 균주 배양액의 추출물은 유기용매로의 추출을 통해 얻어질 수 있으며， 바람직하게는 d ~ C4 알콜 (예: 메탄올， 에탄올, 프로판을， 부탄을 등)， 핵산 및 에틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매를 단독으로 사용하거나 2종 이상을 순차적으로 사용하여 추출을 수행할수 있다.
상기 배양액 또는 추출물의 분획물은 핵산， 에틸 아세테이트， 부탄올 및 물을 용매로사용하여 순차분획 되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 활성분획은 상기 배양액 또는 추출물의 분획물올 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올， 에탄을 또는 이들의 수용액을 용매로 사용하여 6 분 내지 7분， 8 분 내지 10 분 또는 15 분 내지 20 분에서 용출된 분획이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 잡초는 화본과 잡초， 광엽 잡초， 난방제 잡초로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 화본과 잡초는 바탱이 G o /5 sanguinalis) , 수수 Sorghum bicolor) , 7 ^ .Agropyron smithii) 및 {Echinochloa crus-gal 1 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 광엽 잡초는 까마중 (5 /a/7M/ nigrum) , 자귀풀 C4es ¾¾o/»a»e indica) , 어저귀 (4Ζ>ϋ //ο/7 avicennae) , S.Hv}^-}( Xan th iiim strumarium) 및 ^^{Calystegia japonica)^ — 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 난방제 잡초는 방제가 어려운 잡초로 가시박 angulatus) , 환삼덩굴 G¾ /i japoniciis) , ^{Art em is ia princes) , ^^.7 {Equisetim arvense) 및 클로버 (7 /σ//ωτ/ repens)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 배양액, 이의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 또는 상기 분획물의 활성분획은 허비시딘 A Herbicidin A), 허비시딘 B(Herbicidin B) 및 허비시딘 F(Herbicidin F)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 2 이상이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 잡초 방제용 제초제 조성물은 담체 및 /또는 회석제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 , '담체 '는 처리되어야 할 식물 또는 다른 대상체를 대상으로 이의 적용, 또는 이의 저장， 수송 및 /또는 취급이 편리하도록 흔합되거나 만들어진 활성 성분을 갖는， 비활성의， 유기 또는 무기 물질을 의미한다. 상기 회석제 또는 담체의 예로는 물， 우유， 에탄을, 광유， 글리세를을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 R-001 균주의 배양액을 농도별로 3종의 화본과 잡초와 5종의 광엽 잡초에 경엽처리하여 살초력이 우수함을 확인하였다 (표 3 및 도 2 참조)ᅳ
본 발명자들은 상기 배양액을 핵산， 에틸 아세테이트， 부탄을 및 물 층으로 분획하여 각 용매별 분획물을 농도별로 4종의 화본과 잡초와 5종의 광엽 잡초에 경엽처리하여 에틸 아세테이트 분획물 및 부탄을 분획물에서 살초력이 우수함을 확인하였다 (표 4 및 도 3 참조). 우
WO 2014/027821
11 본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 농도별로 4종의 화본과 잡초와 5종의 광엽 잡초에 토양처리 및 경엽처리하여 상기 에틸 아세테이트 분획물의 살초력을 확인하였다 (표 5 및 6 도 4 및 5 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물이 온실조건에서 가시박에 경엽처리하여 2000 ng ml/1 및 1000 ug ml/1 농도에서 가시박을 완전하게 방제하였음을 확인하였다 (도 6 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물이 온실조건에서 체내 이행을 통해 가시박 방제효과가 있음을 확인하였다 (도 7 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 포장조건에서 가시박에 농도별로 경엽처리하여 살초력이 우수함을 확인하였고， 상기 살초력이 시간이 경과함에 따라증진되어 약효지속성이 뛰어남을 확인하였다 (표 7 및 도 8 참조). 본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 포장조건에서 난방제 잡초인 환삼덩굴, 쑥， 쇠뜨기, 클로버에 경엽처리하여 우수한 살초력이 있음올 확인하였다 (표 8， 도 9 10 11 및 12 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 화본과 작물 (벼， 밀， 보리) 및 광엽 작물 (고추, 토마토)에 경엽처리하여 대상작물 5종 모두 약해가 유발되어 작물 선택성은 없음을 확인하였다 (표 9 및 도 13 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물， 비알라포스 (Bialapos) 및 글루포시네이트 (Glufosinate)를 동일한 농도로 경엽처리하여 살초력을 상호비교하였을 때， 에틸 아세테이트 분획물은 비알라포스와 글루포시네이트와 대등한 살초력이 있음을 확인하였다 (도 14 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물의 활성물질을 컬럼 크로마토그래피에서 메탄을， 에탄올 또는 이들의 수용액을 용매로 사용하여 용출되는 분획을 검출하였다 (도 15 참조). 상기 검출된 분획에서 허비시딘 A(Herbicidine A), 허비시딘 B(Herbicidine B) 및 허비시딘 F(Herbicidine F)를 분리하였다. 또한， 상기 검출된 분획, 즉 활성 분획의 살초력이 우수함을 확인하였다 (도 16 및 17 참조).
따라서， 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주， 이의 배양물， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 화본과 잡초, 광엽 잡초， 난방제 잡초에 대하여 우수한 살초력을 나타내므로 잡초 방제용 제초제 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주， 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 잡초， 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잡초 방제 방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 배양액 , 용매별 분획물, 에틸 아세테이트 분획물을 식물에 경엽처리하거나 토양에 처리할 수 있다. 이러한 상기 배양액， 용매별 분획물， 에틸 아세테이트 분획물은 분말， 거친 분말 (coarse dust), 미세 과립 (micro granule) , 과립 , 수화성 분말 (wettable powder) , 유제 (emulsif iabl concentrate), 액체 용제， 현탁 농축물， 물 분해 과립 또는 오일 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 배양액， 용매별 분획물， 에틸 아세테이트 분획물은 식물의 줄기와 잎에 직접 살포하는 경엽처리나토양에 적용하는토양처리 결과 화본과 잡초， 광엽 잡초， 난방제 잡초에 대하여 우수한 살초력이 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 경엽처리하거나 토양처리하는 경우 살초력이 뛰어나므로， 잡초， 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 잡초 방제 방법으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 감자 전분 (potato starch) 및 콩 분말 (soybean powder)을 유효성분으로 함유하는 스트랩토마이세스 스코풀리리다스 (Streptomyces scopuliridis) 균주 대량생산용 배지 조성물을 제공한다.
상기 감자 전분은 1 내지 3%(w/v), 콩 분말은 0.5 내지 2%(w/v) 함유되는 것이 바람직하고， 감자 전분 3%(w/v) 및 콩 분말 2%(w/v)를 함유하는 것이 보다 - 바람직하다. 상기 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주는 수탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 R-001 균주인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 글루코스 (glucose)를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 감자 전분 (w/v), 글루코스 l%(w/v) 및 콩 분말 l>(w/v)을 함유하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 배양배지로 미생물 생육 및 살초활성 물질 생산에 적합한 탄소원을 선발하기 위하여， 소이 펩톤 (soy peptone)를 포함한 최소 영양배지에 탄소원인 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose), 가용성 녹말 (solube starch), 감자 전분 (potato starch), 옥수수 전분 ( corn starch) , 말토오스 (maltose) 및 당밀 (molasses)를 첨가하고 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 전배양 한 배양액을 접종한 배양 여액 및 기존 배넷 배지에 상기 균주를 전배양 한 배양액을 접종한 대조군 배양 여액의 최종 pH, 미생물 생육 정도 및 살초활성을 측정한 결과， 감자 전분， 옥수수 전분 및 말토오스를 첨가한 배지 배양액의 균 생육이 대조군 배양액에 비해 매우 양호하고 70% 정도의 살초활성을 보이며， 배양 여액의 pH가 5 내지 7 부근에서 활성 물질의 생성량이 가장 높음을 확인하였다 (표 11 및 도 18 참조).
또한， 본 발명자들은 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 R-001 균주의 배양배지로 미생물 생육 및 살초활성 물질 생산에 적합한 질소원을 선발하기 위하여, 글리세를을 포함한 기본 배지에 유기태 질소원인 탈지유 (skim milk), 트립톤 (tryptone), 육 추출물 (beef extract), 펩톤 (peptone), 옥수수 황산 침지액 (corn steep liquor, CSL), 콩 분말 (soybean powder), 카제ᅵ인 펩톤 (casein peptone), 효모 추출물 (yeast extract), 소이 펩톤을 첨가하고 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 전배양 한 배양액을 접종한 배양 여액 및 대조군 배양 여액의 최종 pH, 미생물 생육 정도 및 살초활성을 측정한 결과, 효모 추출물 및 육 추출물을 첨가한 배지 _ 배양액의 균 생육이 대조군 배양액에 비해 매우 양호하고 40 내지 50%의 살초활성이 보이며， 최종 pH 가 6 내지 7 범위로 나타나는 것을 확인하였다. 또한， 콩 분말을 첨가한 배지 배양액의 균 생육은 보통 수준이지만 살초활성이 우수한 것을 확인하였다 (표 12 및 도 19 참조).
또한， 본 발명자들은 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 배양배지로 미생물 생육 및 살초활성 물질 생산에 적합한 비율의 탄소원 및 질소원을 선발하기 위하여， 탄소원인 감자 전분， 옥수수 전분 또는 말토오스， 및 질소원인 육 추출물， 콩 분말， 또는 효모 추출물을 첨가하고 스트램토마이세스 스코풀리리디스 전배양 한 배양액올 접종한 배양 여액 및 대조군 배양 여액의 최종 pH, 미생물 생육 정도 및 살초활성올 측정한 결과， 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 R-001 균주의 배양올 위한 탄소원으로 감자 전분, 질소원으로 콩 분말을사용한 경우 균 생육이 매우 양호하고 90%의 살초활성을 보이며， 최종 pH가 5 내지 7 범위로 나타나는 것을 확인하였다 (표 13 및 도 20 참조).
또한, 본 발명자들은 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 배양배지로 미생물 생육 및 살초활성 물질 생산에 적합한 탄소원 및 질소원 최적 배지 조성올 확립하기 위하여， 1 내지 3%(w/v) 감자 전분 및 0.5 내지 2%0/v) 콩 분말을 첨가하고 스트 ¾토마이세스 스코풀리리디스 전배양 한 배양액을 접종한 배양 여액과 ½(w/v) 감자 전분, (w/v) 글루코스 및 l%(w/v) 콩 분말올 첨가하고 상기 균주를 전배양 한 배양액을 접종한 배양 여액 및 대조군 배양 여액의 살초활성 물질 함량을 측정한 결과, 생산단가 및 살초활성 물질 생산량을 비교하였을 때 감자 전분 3%(w/v) 및 콩 분말 2%(w/v)를 첨가한 배양 배지가 가장 적합한 것을 확인함으로써， 상기 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 배양 배지로 감자. 전분 3%(w/v) 및 콩 분말 2%(vv/v)를 포함한 배지가 최적 배양 배지임을 확인하였다 (표 15， 표 16 및 도 21)
또한, 본 발명자들은 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR— 001 균주의 최적 배양 배지의 살초활성을 확인하기 위하여 , 상기 최적 배지를 이용해 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주를 배양한 배양액을 바탱이에 분무 경엽처리한 결과， 상기 최적 배지로 배양한 배양액이 강력한 살초력을 나타내는 것을 확인하였다 (도 22).
따라서， 본 발명의 탄소원과 질소원을 최적조건으로 혼합하여 제조된 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량배양용 배지 조성물은 미생물 생육 및 살초활성이 우수하고， 생산단가 절감 효과가 있으므로， 잡초 방제제 생산을 위한 스트랩토마이세스 스코풀리리다스 균주 대량배양에 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 함유하는 배지 조성물을 이용한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주의 대량생산 방법을 제공한다.
1) 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 함유하는 배지 조성물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배지 조성물에 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 1 내지 3%(w/v)를 접종한 후， 5 내지 7일간 배양하는 단계를 포함하는 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 배지 조성물은 글루코스를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 배지 조성물은 감자 전분 1 내지 3%(v/v) 및 콩 분말 0.5 내지 2%(v/v)를 함유하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 배지 조성물에 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주를 접종한 후, 25 내지 30°C에서 150 내지 300 rpm으로 5 내지 7일 배양하는 것이 바람직하고， 27°C에서 170 rpi으로 5일간 배양하는 것이 보다 바람직하다.
상기 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주는 수탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
따라서， 본 발명의 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 함유하는 배지 조성물을 이용해 생산된 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 배양액은 미생물 생육 및 살초활성이 우수하고， 생산단가 절감 효과가 있으므로， 잡초 방제제 생산올 위한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량배양에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 , 본 발명은 잡초 방제용 제초제 조성물로 사용하기 위한 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주， 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 용도를 제공한다.
따라서， 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양물， 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 화본과 잡초， 광엽 잡초， 난방제 잡초에 대하여 우수한 살초력을 나타내므로 잡초 방제용 제초제 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할수 있다. 또한， 본 발명은 대량생산용 배지 조성물로 사용하기 위한 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 포함하는 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 배지의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양물， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 화본과 잡초， 광엽 잡초, 난방제 잡초에 대하여 우수한 살초력을 나타내므로 잡초 방제용 제초제 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다 .
단， 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며， 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>균주의 분리
층청북도 청원군 대청호 주변 산림토양으로부터 분리하여 HV 한천 (Humic acid-Vitamin) 배지를 사용하였고, 세균 및 곰광이의 생육을 억제하기 위하여 적정한 농도의 사이클로핵사마이드 (cyclohexamide) 또는 날리딕스산 (nalidixic acid)을 첨가하여 사용하였다. 토양시료 각 1 g을 멸균한 생리식염수 10 ml에 첨가하고 볼텍스 (vortex)로 충분히 흔합한 후， 각 시료를 분리용 배지에 100 ul씩 도말하고 28°C에서 일정기간 동안 배양하며 관찰하였다. 배양기간 동안 주기적으로 배양상태를 관찰하며 배양된 콜로니를 새로운 배지에 접종하여 단일 콜로니를 순수 분리한 후 현미경으로 관찰하면서 선별하였으며, 방선균 분리배지 및 배양조건은 하기와 같다 (표 1).
순수분리한 각 균주는 한천 (agar) 배지상에서 배양한 후 균체를 모아 20¾ 멸균 글리세를에 현탁하여 -70°C 초저온 냉장고 상에서 보존하였다. 또한， 장기보존을 위해 동결건조 보존을 실시하였는데， 분리된 각 균주를 고체 배지에서 배양한 후 멸균한 10% 탈지유 (skim mi lk)에 현탁하고 동결건조하여 4°C 이하에 보존하였다.
【표 1】
방선균분리배지 및 배양조건
Figure imgf000019_0001
부식산 (Humic acid) 1
Na2HP04 0.5
C1 1.71
MgS047H20 0.05
FeS047H20 0.01
CaC03 0.02
Figure imgf000019_0002
<실시예 2>균주의 동정
상기 <실시예 1> 에서 분리한 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.
구체적으로， 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 얻기 위하여 콜로니 (colony) PCR을 수행하였다. 단일 콜로니로부터 이쑤시개를 이용해서 채취하여 PCR-premix(iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합 후 27f와 1492r 프라이머를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR산물은 Wizard PCR prep 키트 (Promega, Med i son, WI, USA)을 사용하여 정제한 후， 마크로젠 (Daejon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다. 염기서열은 NCBI의 BLSAT을 이용하여 GenBank 데이터베이스와 염기서열을 비교하였다. CLUSTAL X으로 염기서열을 정렬하고， PHYDIT program version 3.0을 사용하여 neighbour- joining tree를 작성하였다. 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열 (서열번호: 1)을 neighbour- joining 알고리즘을 바탕으로 분석하였다.
그 결과， 본 균주는 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 RB72T와 99.7% 정도의 상동성을 나타내는 신규한 균주임을 알 수 있었다 (도 1). 본 발명에서 사용한 균주는 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 (5 re?ia»yc&s scopul iridis) 균주로 동정되었다. 상기 균주를 수트랩토마이세스 스코풀리리디스 (5ir¾D o/»j^es scopul iridis) KR-0()1로 명명하고 2012년 03월 09일자로 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC 12156BP호로서 기탁하였다.
<실시예 3> 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 농도별 경엽처리시 활성 측정
상기 <실시예 1>로부터 수득한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 경엽처리시 활성을 측정하기 위하여 하기와 같은 방법을 실험올 진행하였다.
구체적으로， 500 ral의 배플드 (baffled) 플라스크에 베넷 (Bennet) 액체 배지 500 ml를 넣고 전배양 한 배양액을 1% 접종하여 27°C， 180 rpm에서 7일간 배양한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 상징액을 취하여 1， 1/2， 1/4 농도로 회석하여 (Tween-20 0.1% 포함) 3종의 화본과 잡초 (바행이， 수수， 돌피)와 5종의 광엽 잡초 (까마중， 자귀풀， 어저귀， 도꼬마리， 메꽃)를 대상으로 폿트당 14 ml량으로 경엽처리하여 5일 후에 살초력을 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사를 통해 평가하였다. 이때， 베넷 배지의 조성 성분은 하기 [표 2]에 나타내었다.
그 결과， 도 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이， 배양액 원액에서의 8개 초종에 대한 살초력은 90% 내지 100%이었고， 1/2 농도에서도 70% 내지 100%이었다. 대상 잡초 중에서 바랭이， 까마증， 자귀풀 등에 대한 살초력이 상대적으로 강하게 발현되었다. 배양액 처리 후 시간이 경과 할수톡 살초력이 증가되어 약효지속 효과가 있었으며 , 주요 증상은 고사 (burndoTO)이었고， 1/4농도에서는 일부 화본과 초종이 자색으로 변하였음을 확인할 수 있었다 (표 3 및 도 2).
【표 2]
베넷 배지의 조성 성분
Figure imgf000021_0001
【표 3】
은실조건에서 3종의 화본과 잡초 (바탱이, 수수， 피)와 5종의 광엽 잡초 (까마중, 자귀풀, 어저귀， 도꼬마리, 메꽃)에 대한스트랩토마이세스 스코풀리리디스 R-001 균주 배양액의 회석비율별 경엽처리시 활성 (%)
Figure imgf000021_0002
바탱이 (DIGSA, Digotaris sanguinalis) , 수수 (S0RBI, Sorghum bicolo ) , 돌피 (ECGCG, Echinochloa crus-galli) , 까마중 (S0LNI, Solarium nigrum) , 자귀풀 (AESIN, Aeschynomeme indica) , 어저귀 (ABUTH, Abut Hon avicennae) , 도꼬마리 (XANSI, Xanthiiun strumar ium) , 메꽃 (CAGEH, Calystegia japonica)
<실시예 4> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 용매 분획별 경엽처리시 활성 측정
상기 <실시예 3>으로부터 수득한 배양액의 용매 분획별 살초력을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로， 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액을 핵산， 에틸 아세테이트, 부탄을 및 물 층으로 분획하였다. 바탱이를 대상으로 각 용매별 분획물을 8 g mL"1, 16 ug mL_1, 32 μβ mL"1, 63 ug mL"1, 125 yg mL"1, 250 11 g mL"1 및 500 yg mL"1 농도로 경엽처리하여 5일 후에 살초력을 외형적인 증상 및 .약효를 약해 기준표에 의해 달관조사를 통해 평가하였다.
그 결과, 도 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이， 핵산과 물 층에서는 전혀 활성이 없었고， 에틸 아세테이트와부탄올 층에서 활성이 발현되었는데， 특히 에틸 아세테이트 층에서 가장 강력한 살초력을 확인하였다. 에틸 아세테이트 8 ug mL" 16 \xg mL"1, 32 ug ml/1, 63 \xg ml'1, 125 mL-1, 250 yg mLᅳ1 및 500 ug mL"1 농도에서의 바랭이에 대한 살초력은 각각 80%， 90%, 95%， 100%, 100%, 100% 및 10 로 강력한 살초력이 나타났음을 확인할 수 있었다. 이때， 각용매 분획별 활성물질의 수율은 핵산 분획 0.03%, 에틸 아세테이트 분획 3.61%， 부탄을 분획 17.84%, 물 분획 73.67%인 것을 확인하였다 (표 4 및 도 3).
[표 4】
은실조건에서의 바탱이에 대한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 용매 분획별 경엽처리시 활성 (¾)
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
<실시예 5> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 분획물의 토양처리시 효과측정
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 토양처리효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 처리 1일 전에 4종의 화본과 잡초 (바탱이， 수수， 돌괴， 개밀)와 5종의 광엽 잡초 (까마증, 자귀풀， 어저귀, 도꼬마리， 메꽃)를 파종하여 온실조건 (30/20±5°C, Light/Dark=14/10시간)에서 관리 후， 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획을 2000 pg mL一1， 1000 ug mL"1, 500 ng ml'1, 250 yg mL"1, 125 yg mL"1 농도로 조제하여 분무처리하였으며， 처리 15일 후에 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사 (0% 내지 100%)하였다.
그 결과， 도 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 에틸 아세테이트 분획 2000 Ug mL"1 농도에서의 대상잡초 종에 대한 살초력은 95% 내지 100%이었으며， 1000 ug mL"1 농도에서도 수수와 어저귀를 제외한 전 초종에 대해 완전한 방제활성 (100%)을 나타내었다. 2000 yg mL"1 및 1000 pg mL"1 농도에서 수수와 어저귀의 경우에 지상부로 출현은 되었지만 고사되었고 , 다른 초종은 지상부로 출현하지 않았는데 이러한 현상은 각 잡초 종자 발아 후， 처리 층을 통과하면서 에틸 아세테이트 분획에 접촉되어 고사된 것으로 추측하였다. 실험대상 초종 중 바탱이， 개밀， 까마중, 도꼬마리， 메꽃은 500 ug mL"1 농도에서 완전 고사되었고， 개밀은 250. Vg mL"1,. 메꽃은 125 yg mL"1 농도에서도 완전 고사하여 가장 감수성이 좋은 종임을 확인할 수 있었다 (도 4 및 표 5).
【표 5】
온실조건에서의 4종의 화본과 잡초 (바탱이, 수수, 돌피， 개밀)와 5종의 광엽 잡초 (까마중， 자귀풀, 어저귀， 도꼬마리， 메꽃) 들에 대한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001균주 배양액 에틸 아세테이트 분획의 토양처리시 효과
Figure imgf000024_0001
<실시예 6> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액 분획물의 경엽처리시 활성 측정
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 경엽처리시 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로， 4종의 화본과 잡초 (바탱이， 수수， 돌피， 개밀)와 5종의 광엽 잡초 (까마증, 자귀풀， 어저귀， 도꼬마리， 메꽃)를 파종하여 온실조건에서 9일 동안 생육시킨 후， 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획을 약제조제액 (50% 아세톤， Tween-20 0.1%포함)으로 2000 yg mL" 1000 pg mL"1, 500 yg mL"1, 250 yg mL— 125 yg mL"1, 62.5 yg mL"1농도가 되도톡 회석 조제하여 분무경엽 처리하였고， 처리 12일 후에 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사 (0% 내지 100%)하였다.
그 결과， 도 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 2000 ug mL""1 및 1000 Ug mL"
1 처리농도에서의 9종 잡초에 대한 살초력은 95% 내지 100%로 강력한 활성을 나타내었으며, 500 yg mL— 1 농도에서도 80% 내지 100%로 우수하였다. 약제처리 초기에 외형적인 증상이 발현되어 처리일자가 경과함에 따라 효과가 증가되어 발현되었고， 약제처리 10일 이후에도 살초력이 유지되어 잔효지속성이 있음을 확인할 수 있었다. 주요 증상은 처리 초기에 수침상이 형성되었다가 시간이 경과하면서 고사되어 결국 낙엽화되었다. 250 ng mL— 1 이하 농도에서도 초종에 따라서는 강력한 살초력을 나타내었는데 수수， 까마증， 자귀풀은 62.5 ml/1 농도에서도 95% 이상의 살초력을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 5 및 표 6). 【표 6】
은실조건에서의 4종의 화본과 잡초 (바탱이， 수수， 돌피, 개밀)와 5종의 광엽 잡초 (까마중, 자귀풀, 어저귀， 도꼬마리， 메꽃) 들에 대한 에틸 아세테이트 분획의 경엽처리시 활성
Figure imgf000025_0001
<실시예 7> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액 분획물의 은실조건에서의 가시박 에 대한 경엽처리 방제효과 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 온실조건에서의 가시박 SYcyos angulatus)^] 대한 경엽처리시 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로， 온실조건에서 3 엽기까지 생육시킨 가시박에 상기 에틸 아세테이트 분획을 2000 g raL"1및 1000 mL"1 농도로 경엽처리하여 7일 후에 달관조사하였다.
그 결과， 도 6에 나타낸 바와 같이, 경엽처리 후， 24시간이 경과하면서 외형적인 증상이 발현되기 시작하여 5일이 지나면서 2000 yg mL_1와 1000 μ g mL"1 농도에서 모두 가시박이 완전하게 억제되었음올 확인할수 있었다 (도 6). <실시예 8> 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 분획물의 온실조건에서의 체내 이행을통한 가시박방제효과 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 온실조건에서의 체내 이행올 통한 가시박 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로， 온실조건에서 가시박을 파종하여 3 엽이 전개되었을 때， 3 엽 줄기에 1000 yg mL— 1 농도로 상기 조제한 에틸 아세테이트 분획물을 거즈에 적셔서 알루미늄 호일로 실링 (sealing)하여 국부처리 한 다음, 암 조건에서 24시간 두어 식물체 내로 충분히 흡수되도록 하였다. 처리 24시간 후, 거즈 및 알루미늄 호일을 제거하고 동일한 온실조건에서 관리하면서 매일 이행 여부를 관찰하다가 처리 6일 후에 달관조사하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이， 국부처리 후 2일이 경과하면서 외형적인 증상이 발현되기 시작하였고， 6일 후에 무처리 가시박은 7 엽까지 전개되었으나， 처리된 가시박에서는 4 엽까지만 전개되었을 뿐만 아니라 상위엽인
4 엽과 하위엽인 2 엽의 주변으로부터 고사가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 에틸 아세테이트 분획물은 상향이행과 하향이행이 동시에 이루어지는 것을 확인하였다 (도 7). <실시예 9> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 분획물의 포장조건에서의 가시박에 대한 경엽처리시 방제효과 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 포장조건에서의 가시박에 대한 경엽처리시 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 환경부에서 "생태계교란 야생식물" 로 지정한 환경위해 식물인 가시박에 대해 온실조건에서 강력한 방제효과가 있음올 확인한바， 실제 포장조건에서의 현장적용평가를 실시하였다. 포장시험 장소는 경기도 양평군 개군면 앙덕리 31-15번지 소재의 앙덕리 마을회관 앞 남한강변 지역이었으며， 시험기간은 2011년 09월 22일부터 2011년 10월 06일까지 수행하였다. 약제처리시 가시박 생육상황은 10 엽기 내지 15 엽기로 길이는 2 m 내지 3 m이었으며, 처리 구획은 1 m X 1 m로 하여 각 농도별로 300 mL씩 처리하였다. 상기 에틸 아세테이트 분획의 최종 농도가 2000 g mL"1 및 4000 yg mL"1 농도가 되도록 칭량하여 소량의 아세톤으로 용해시킨 후 약제조제액 (50% 아세톤, Tween— 20 0.1% 포함)으로 희석조제하였고, 처리 5일， 8일 및 14일 후에 육안으로 달관조사하였다. 그 결과, 도 8 및 표 7에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 포장조건에서의 가시박에 대한 살초력은 약제처리 후 시간이 경과함에 따라 증진되고， 약효지속성이 뛰어난 것으로 나타났는데, 4000 ug mL"1 농도에서 처리' 5일， 8일 및 14일 후의 가시박 방제효과는 각각 50%, 90% 및 100%이었으며， 2000 ug mLᅳ1에서의 방제효과는 각각 40%. 70% 및 80%이었다. 통상 천연물 유래의 제초활성 물질은 속효성이어서 약제 처리 수 시간 내에 약효가 발현되기 시작하며， 약효지속기간이 짧아서 약제 처리 후 일정기간이 경과하면 재생되는 것이 일반적인 현상으로 알려져 있는데， 상기 에틸 아세테이트 분획은 2주일 후에도 살초력이 유지되어 약효지속성이 우수한 특성올 확인할 수 있었다. 또한， 약제가 처리된 잎 아랫부분에 위치한 줄기가 모잘록병과 같이 부러지는 현상을 고려할 때 약제가 처리된 잎은 물론이고 아래 줄기 쪽으로 이행하는 것으로 . 판단하였다 (도 8 및 표 7) 【표 7】
포장조건에서의 가시박에 대한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액 에틸 아세테이트 분획의 경엽처리 효과
Figure imgf000027_0001
DAT: Days after treatment (약제처리 후 일수) <실시예 10> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액 분획물의 난방제 잡초 (환삼덩굴, 쑥， 쇠뜨기， 클로버)에 대한 경엽처리시 방제효과
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 포장조건에서의 환삼덩굴이나 쑥， 쇠뜨기 또는 클로버와 같은 방제가 어려운 잡초에 대한 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 시험은 대전광역시 유성구 한국화학연구원 포장주변에서 시험 대상 잡초가 자생하고 있는 지역을 선정하여 수행하였으며， 시험기간은 2011년 10월 4일부터 2011년 10월 16일이었다. 처리 구획은 1 m x 1 m로 하여 각농도별로 200 mL씩 처리하였다. 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 최종 처리농도가 2000 Lig mL"1및 4000 y g raL"1 농도가 되도록 칭량하여 소량의 아세톤으로 용해시킨 후 약제조제액 (50% 아세톤， Tween-20 0.1% 포함)으로 회석조제하여 처리하였다. 약제처리 후 환삼덩굴은 5일, 10일， 15일 후, 쑥과 쇠뜨기는 5일， 8일， 10일 후， 클로버는 4일， 8일， 12일 후에 육안으로 달관조사하였다. <10-1>환삼덩굴 G¾fflK//us japonicus) 방제효과 확인
도 9 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 환삼^굴 (ffui his japonicus)^) 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데， 2000 g mL"1 및 4000 ug mL— 1 농도에서 처리 5일 후에는 각각 40% 및 30% 정도의 방제효과 나타내다가 이후 급속하게 효과가 진전되어 10일 후에는 각각 100%와 95%, 15일 후에는 처리농도 모두 10OT의 살초력을 나타내었다 (표 8 및 도 9). 가시박에서 나타났던 현상과 동일하게 처리 후 시간이 경과하면서 살초력이 계속 증가되어 처리 15일 이후까지 살초력이 유지되어 약효지속효과가 지속되는 특성이 있음을 확인할 수 있었다. 【표 8】
포장조건에서의 환삼덩굴 ( ¾z«//i/s japonicus) , ^Artemisia princeps) , ^뜨 \ Equisetum arvense) 및 클로 ^( ifoI ium oeos)에 대한 에틸 아세테이트 분획의 경엽처리 효과
Figure imgf000029_0001
<10-2>쑥 {Artemisia princeps) 방제효과 확인
도 10 및 표 8에 나타낸 바와 같이， 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 ^{Artemisia princeps)^ 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데， 2000 yg mL"1 및 4000 g mL— 1 농도에서 쑥에 대하여 완전한 방제효과를 나타내었는데， 처리 3일이 지나면서 효과가 발현되기 시작하여 5일 후에는 4000 ug mL"1 농도에서는 완전하게 방제되었고， 2000 yg mL"1 농도에서도 80%이었다가 8일 후에는 두 농도 모두 100%로 나타나 살초력이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다 (표 8 및 도 10).
<10-3>쇠뜨기 ¾ se iffl? arvense) 방제효과 확인
도 11 및 표 8에 나타낸 바와 같이， 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 쇠뜨기 arvense)^} 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데, 약효발현이 매우 빨라서 처리 5일 후에 4000 yg mL— 1 및 2000 ng mL"1 농도에서 각각 95%와 90 )의 살초력을 나타내었고， 8일 이후에는 완전고사되었다 (표 8 및 도 11).
<10-4>클로버 (7 / // repens) 방제효과 확인
도 12 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 클로버 (7 // ffl rep )에 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데， 처리 4일이 지나면서 잎에 반점이 형성되어 진행되다가 8일 이후에 잎이 완전하게 고사되고 12일 이후에는 줄기까지 고사되어 약효발현 속도가 빠를 뿐만 아니라 살초력이 유지되고 있음을 확인하였다 (표 8 및 도 12). <실시예 11> 스트템토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액 분획물의 은실조건에서의 작물선택성 평가
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 작물선택성올 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다 /
구체적으로， 가시박을 포함한 다양한 종류의 잡초에 대한 탁월한 살초력을 확인한 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 작물선택성을 확인하였다. 대상작물은 벼, 밀, 보리 등의 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽 작물 2종이었으며， 처리 당시， 각각의 작물의 생육상황은 벼 3.5 엽, 밀 1.2 엽， 보리 1 엽, 고추 7.3 엽， 토마토 4.4 엽이었다. 처리농도는 4000 mL"1, 2000 ug tiiLᅳ1, 1000 g mL"1, 500 mL"1, 250 g mL'1 및 125 ixg mL— 1이었고， 처리 14일 후에 작물에 대한 약해 정도를 육안으로 달관조사하였다.
그 결과， 도 13 및 표 9에 나타낸 바와 ' 이, 대상작물 5종 모두 약해가 유발되어 작물 선택성은 없는 것을 확인하였다. 특히， 광엽 작물인 고추와 토마토에서 심한 약해가유발되었는데， 토마토의 경우에는 처리한 전 농도범위에서 100%의 약해가 유발되어 가장 심하였으며, 고추에서도 처리범위에서 70% 내지 100%의 약해가 유발되었다. 화본과 작물에서는 광엽 작물에 비해 상대적으로 약해가 다소 낮게 발현되었으나 보리의 경우에는 처리농도 범위에서 50% 내지 8 이었으며, 벼와 밀에서는 30% 이하의 약해 만이 발현되 < | 상대적으로 낮았다. 따라서 방선균 유래의 제초활성물질은 작물 선택성이 없기 때문에 비선택적으로 사용되어야할 것을 확인하였다 (도 13 및 표 9).
【표 9】
은실조건에서의 벼, 밀， 보리 등의 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽 작물 2종들에 대한 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 약해
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
<실시예 12> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액 분획물과 대조화합물의 살초력 비교
상기 <실시예 4>로부터 수득한 배양액의 분획물의 살초력을 확인하기 위하여， 비알라포스 (Bialaphos) 및 글루포시네이트 (Glufosinate)의 살초력을 상호 비교하였다.
구체적으로, 표면적 350 cm2 풀라스틱 사각 폿트에 원예용 상토를 담은 후， 바탱이를 포함한 화본과 잡초 4종， 까마중을 포함한 광엽 잡초 3종을 각각 파종하여 은실조건 (25±3°C, 14/10h = Light/dark)에서 파종 15일 후에 배양액의 에 아세테이트 분획， 비알라포스 (Bialaphos) 및 글루포시네이트 (Glufosinate)를 약제조제액 (아세톤 50%， Tween-20 0.1% 포함)으로 250, 500 및 1000 g mLᅳ1 농도가 되도톡 회석조제하여 14 ml/pot량으로 경엽처리하여 13일 후에 살초력을 달관조사하였다.
그 결과， 도 14에 나타낸 바와 같이， 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획과 비알라포스 (Bialaphos) 및 글루포시네이트 (Glufosinate)는 250 ug ml/1, 500 g mL"1 및 1000 yg mL"1 농도에서 대등한 수준의 살초력을 나타냈음을 확인하였다 (도 14). 따라서 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트분획의 살초력은 대조화합물인 비알라포스 (Bialaphos) 또는 글루포시네이트 (Glufosinate)와유사하다고 판단된다.
<실시예 13> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 분획물의 제초 활성물질 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 제초 활성물질을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 진행하였다. 구체적으로， 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획에 대하여 HPLC를 진행하였다. 분석조건은 다음과 같다 (표 10). 그 결과， Rt. 6분 50초， 9분 10초 그리고 15분 30초에 피크 (Peak)를 확인하였다 (도 15).
스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0002
<실시예 14> 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 에틸 아세테이트 활성물질분획의 화합물 및 살초력 확인
상기 <실시예 12>로부터 수득한 Rt. 6분 50초， 9분 10초 및 15분 30초의 화합물 및 이의 살초력을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 12>로부터 수득한 Rt. 6분 50초， 9분 10초 및 15분 30초의 화합물을 상기의 분석조건 (표 10)으로 Prep-HPLC를 실시하여， fr. 1 - 7로 나누었다. 각 분획을 바탱이를 대상으로 112.5 ug mL— 225 g mL"1, 450 Ug mL"1및 900 ug mL— 1 농도로 경엽처리하여 5일 후에 살초력을 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사를 통해 평가하였다.
그 결과 도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이， fr. 3 4번 및 5에서 우수한 살초력을 확인하였다. 우수한 살초력을 보인 fr. 3번， 4번 및 5번을 분리 정제한 후 문헌과의 데이터 비교를 통해 Rt. 6분 50초， 9분 10초 및 15분 30초의 구조를 Herbicidin B, Herbicidin A 및 Herbicidin F로 확정하였다 (7¾e Journal of Antibiotics 1982, 35 1711-1714.) (도 16 및 도 17). <실시예 15> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 산업적 대량생산을 위한 배지의 최적 탄소원 조사
스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 배양배지인 하기 [표 2]에 기재된 베벳 (Bennet) 배지의 구성성분을 단순화하여 생산비를 절감하고， 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 효율적인 대량배양을 위하여， 미생물 배양 시 산업적으로 주로 사용하는 다양한 종류의 탄소원 중 미생물 생육 및 살초활성 물질 생산에 적합한 배지를 선발하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 500 ^의 배플드 (baffled) 플라스크에 0.5%(w/v) 소이 펩톤 (soy peptone) (5 g/L)를 첨가하여 최소 영양배지를 제조한 후， 산업용 원료인 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose), 가용성 녹말 (soluble starch), 감자 전분 (potato starch), 옥수수 전분 (corn starch), 말토오스 (maltose) 및 당밀 (molasses)를 각각 1.0%(w/v)(10 g/L)가 되도록 첨가하고， 상기 <실시예 1>의 전배양 한 배양액을 2% 접종하여 27°C에서 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 상기 각 배양액은 최종 pH와 미생물 생육 정도를 측정하고， 살초활성 평가를 위하여 균을 완전히 제거한 상기 배양 여액을 8배 희석하여 (Tween-20, 0.1% 포함) 은실조건 (30±5°C, 광 /암 = 14시간 /10시간)에서 바탱이를 대상으로 분무 경엽처리하고， 3일 후에 외형적인 증상 및 살초력 정도를 기준으로 달관조사 (0; 효과 없음， 100; 완전방제)하였다. 아을러， 대조군으로 500 의 배플드 플라스크에 [표 2]에 기재된 베넷 액체 배지 500 를 넣고 상기 <실시예 1>의 전배양한 배양액을 2% 접종하여 27°C에서 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 그 결과， 표 11 및 도 18에 나타낸 바와 같이 , 감자 전분， 옥수수 전분 및 말토오스를 첨가한 배지의 경우， 베벳 배지 배양액에 비해 균 생육이 매우 양호하고 70% 정도의 살초활성을 보이며， 가용성 녹말을 첨가한 배지의 경우, 베넷 배지와 균 생육 정도는 유사하였으나 살초활성은 60%로 우수한 것올 확인하였다. 또한， 상대적으로 살초활성이 높았던 탄소원인 감자 전분， 옥수수 전분 및 말토오스를 첨가한 배지의 경우， pH는 6 내지 7 범위이고， 균 생육도 매우 양호 (+++)한 것을 확인하였다. 반면， 살초활성이 20%로 낮았던 탄소원인 수크로스 및 당밀을 첨가한 배지의 pH는 9 내외로 높고， 균 생육도 보통 (++) 수준인 것을 확인하였다. 따라서, 상기 결과를 통해 탄소원 종류에 따라 살초활성 물질 생성량 또는 대사산물 종류의 변화가 발생하게 되고, 이러한 변화에 의해 배양 여액의 pH에 영향을 미치며， 궁극적으로는 배양 여액의 pH가 5 내지 7 부근일 때 활성 물질의 생성량이 가장 높기 때문에 살초활성이 상대적으로 높게 발현됨을 확인하였다 (표 11 및 도 18).
【표 11】
Figure imgf000034_0001
<실시예 16> 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 산업적 대량생산을 위한 배지의 최적 질소원 조사
상기 <실시예 15>과 같이 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 배양배지인 베넷 배지의 구성성분을 단순화하여 생산비를 절감하고， 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR— 001 균주의 효율적인 대량배양을 위하여, 미생물 배양 시 산업적으로 주로 사용하는 다양한 종류의 질소원 증 미생물 생육 및 살초활성 물질 생산에 적합한 배지를 선발하는 실험을 수행하였다.
구체적으로， 500 ^의 배플드 (baffled) 플라스크에 2%(v/v) 글리세를 (glycerol)(20 을 탄소원으로 첨가한 기본 배지를 제조한 후， 유기태 질소원인 탈지유 (skim milk), 트립톤 (tryptone)， 육 추출물， 펩톤 (peptone), 옥수수 황산 침지액 (corn steep liquor, CSL), 콩 분말 (soybean powder), 카제인 펩톤 (casein peptone) , 효모 추출물, 소이 펩톤 0.5%(w/v)(5 g/L)를 첨가하고, 상기 <실시예 1>의 전배양 한 배양액을 2% 접종하여 27°C에서 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 상기 <실시예 15>과 같은 방법으로 균 생육과 살초활성을조사하였다. 아울러 , 대조군으로 500 m의 배풀드 플라스크에 [표 2]에 기재된 베넷 액체 배지 500 |[1«를 넣고 상기 <실시예 1>의 전배양한 배양액을 2% 접종하여 27°C에서 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다.
그 결과， 표 12 및 도 19에 나타낸 바와 같이， 질소원으로 효모 추출물과 육 추출물을 첨가한 경우， 균 생육이 매우 양호 (+++)하고， 배양 여액 8배 회석액 처리에서도 40~50%의 살초활성올 보이며， 탄소원과 마찬가지로 최종 pH가 6 내지 7 범위로 나타내므로 질소원 별 배양 여액의 pH와 균 생육 간에 밀접한 상관관계가 있음을 확인하였다ᅳ 한편， 콩 분말을 첨가한 경우, 균 생육은 보통 (++)이었으나 살초활성은 효모 추출물 또는 육 추출물 첨가 배지와 비슷한수준임을 확인하였다. 일반적으로 균 생육과 2차 대사산물의 생성량은 비례하는 경우가 많지만， 배양 환경에 따라서는 세포 수만 증가될 뿐 실제로 2차 대사산물 생성은 적은 경우가 종종 발생하기도 하고， 반대로 균 생육은 다소 불량한 경우에도 대사산물의 생성량은 상대적으로 훨씬 많이 생성되는 경우도 있으나， 콩 분말을 첨가한 배지와 경우에는 균 생육은 보통 수준이지만 살초활성은 우수하므로， 살초력을 발현하는 활성물질의 생성은 활발하게 이루어짐을 확인하였다 (표 12 및 도 19).
【표 12】
Figure imgf000035_0001
<실시예 17> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 산업적 대량생산을 위한 최적 배지 선발
상기 <실시예 15> 및 <실시예 16>로부터 선발된, 산업용 배지 성분 증 살초활성이 우수한 탄소원과 질소원을 조합하여 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 R-001 균주의 살초활성 물질 생산올 위한 최적 배지를 선발하였다. 구체적으로, 500 의 배플드 (baffled) 플라스크에 상기 <실시예 15〉 및 <실시예 16>로부터 선발된， 살초활성이 우수한 탄소원인 감자 전분， 옥수수 전분 또는 말토오스와 질소원인 육 추출물， 콩 분말， 또는 효모 추출물을 각각 W(w/v)와 0.5%(w/v) 조건으로 첨가하고 상기 <실시예 1>의 전배양 한 배양액을 2% 접종한 후， 각 배지의 초기 pH를 6.95 내지 7.10으로 조절하여 27°C, 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 각 배지별 살초활성은 평가를 위하여 상기 <실시예 15>과 같이 바.랭이를 대상으로 분무 경엽 처리하고, 3일 후에 외형적인 증상 및 살초력 정도를 기준으로 달관조사 (0; 효과 없음， 100; 완전방제)하였다. 아울레 대조군으로 500 의 배플드 플라스크에 [표 2]에 기재된 베넷 액체 배지 500 1 를 넣고 상기 <실시예 1>의 전배양 한 배양액을 2% 접종하여 27°C에서 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다.
그 결과， 표 13 및 도 20에 나타낸 바와 같이， 탄소원으로 옥수수 전분을 사용한 경우 5일 배양에서의 살초활성이 다른 탄소원에 비해 상대적으로 높았으나 7일 배양에서는 살초활성이 오히려 낮아지는 경향을 보였고, 감자 전분을 사용한 경우 5일 배양에서의 살초활성은 옥수수 전분에 비해 다소 낮았으나 7일 배양에서도 활성이 일정하게 유지되었으며, 말토오스를 사용한 경우 상대적으로 살초활성이 낮게 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 질소원으로 콩 분말을 사용한 경우에는 탄소원의 종류에 관계없이 균 생육이 대체로 양호하였으며， 살초활성도 상대적으로 가장 높음을 확인하였다. 한편， 배양 여액의 최종 pH와 균 생육 및 살초활성과의 상관관계를 분석했을 때， 상기 <실시예 15> 및 <실시예 16>의 결과와 마찬가지로 낮은 pH에서 균 생육이 매우 양호 (+++)하면서 살초활성도 높다는 것을 확인하였다. 따라서， 상기 <실시예 15>의 결과로부터 살초활성 물질의 생산 및 안정성에 적합하며 배양기간 단축 등을 고려하여 KR-001 균주의 배양을 위한 탄소원으로는 감자 전분, 질소원으로는 콩 분말을 최종 선발하였다 (표 13 및 도 20).
【표 13] S소췬과질소원초합0 f른스트 !토야 0|Af스스코풂 스 KR-001균주배양 < 액의살초 ¾성
Figure imgf000037_0001
<실시예 18> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 산업적 대량생산을 위한최적 배지 조성
상기 <실시예 17>로부터 선발된， 최종 선발 탄소원인 감자 전분과 최종 선발 질소원인 콩 분말의 최적 비율 및 비율에 따른 살초활성올 측정하여， 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 살초활성 물질 생산에 가장 적합한 최적 배지 조성을 확립하였다.
구체적으로ᅳ 상기 <실시예 15> 내지 <실시예 17>와 동일한 방법으로 상기 <실시예 15>， <실시예 16> 및 <실시예 17>로부터 선발된 최종 선발 탄소원인 감자 전분 1 내지 3%(w/v) 및 최종 선발 질소원인 콩 분말을 0.5 내지 2%(w/v) 첨가하여 배지를 제조하였다. 또한， 상기 방법과 같이 탄소원으로 감자 전분 및 글루코스 각각 l%(w/v)(10 g/L) 및 콩 분말 l%(w/v)(10 g/L)를 첨가하고 상기 <실시예 1>의 전배양 한 배양액을 2% 접종한 후, 각 배지는 27°C, 170 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 상기 각각의 배양 배지 내 살초활성 물질 함량 정량을 위하여, 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주가 생산하는 살초활성 물질 A및 B를 농도별로 준비하고， 하기 [표 14]의 조건으로 HPLC분석을 통해 농도별로 나타나는 피크의 면적을 정량함으로써， 검량선 (calibration curve)을 작성하고， 상기 각 배양배지에서의 살초활성 물질 A 및 B의 함량을 HPIX 분석을 통해 정량하였다. 살초활성 물질 A 및 B의 농도별 HPLC 분석은 3회 반복하였으며， HPLC 분석은 Shimadzu ODS 컬럼 (column)(4.6 x 300 誦)을 사용하여 35% 메탄올을 이동상으로 245 nm로 분석하여 최적 배지 조성 및 배양조건을 확립하였다.
【표 14]
HPLC분석 조건
Figure imgf000038_0001
그 결과， 표 15 및 도 21에 나타낸 바와 같이， 살초활성 물질 A의 생성량은 감자 전분 3%와 콩 분말 Ά 조합에서 (C/N 비율 = 2 ： 1) 734.27 yg/mL로 가장 많고， 베넷 배지의 131.13yg/mL에 비해 약 6배 증가 되며， 이때 리터 당 생산단가는 174.60원으로 베넷. 배지의 2 ,240.92원에 비해 약 13배 낮음을 확인하였다. 한편， 살초활성 물질 B의 경우에는 감자 전분 와 콩 분말 2¾ 조합에서 (C/N 비율 = 1 : 1) 64.32 iig/inL로 가장 높았지만, 대체로 감자 전분 농도에 상관없이 콩 분말 양이 증가할수톡 생성량도 증가하는 경향이 있음을 확인하였다. 또한， 탄소원으로 감자 전분 및 글루코스를 각각 ½， 콩 분말 W 조합 (C/N 비율 = 2 : 1) 배지의 경우 감자 전분 3%와 콩 분말 2% 조합 (C/N 비율 = 2 ： 1) 배지보다 생산단가가 저렴하지만， 살초활성 물질 A 생산량은 적다는 것을 확인하였다 (표 15 및 도 21). 【표 15】
탄소원과 ¾ '소원비을 0|i &스트¾토아이세스스코 스 KR-001균주의살조¾성읊질생산벼교
Figure imgf000039_0001
따라서， 상기 <실시예 18>의 결과를 통해 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 살초활성 물질 생산에 가장 적합한 최적 배지를 확립하고 최적 배지 조성 및 배양조건을 하기 [표 16]에 나타내었다.
【표 16】
스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001균주의 최적 배지 조성 및 배양조건
Figure imgf000039_0002
<실시예 19> 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 산업적 대량생산을 위한 최적 배지의 살초활성 효과 확인
상기 <실시예 18>의 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주의 대량배양용 최적 배지의 효과를 확인하기 위하여， 살초활성을 조사하였다.
구체적으로， 상기 [표 2]에 기재된 베넷 배지를 이용해 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주를 배양한 배양액 및 상기 <실시예 18>의 최적 배지를 이용해 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 K -001 균주를 배양한 배양액을 8배 회석하여 온실조건에서 바탱이를 대상으로 분무 경엽처리하고， 3일 후에 외형적인 증상을 확인하였다.
그 결과， 도 22에 나타낸 바와 같이， 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR- 001 균주를 상기 최적 배지로 배양한 배양액이 무처리 및 베넷 배지로 배양한 배양액에 비해 현저하게 강력한살초력을 나타내는 것을 확인하였다 (도 22).
【수탁번호]
기탁기관명 ： 한국생명공학연구원 생명자원센터
수탁번호 ： KCTC12156BP
수탁일자 ： 20120309
Figure imgf000041_0001
INTEUNATrONAL FORM
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT
issued ursuant to Ruie 7.1
： GHC¾ Jimg St¾>
Korea Research Institute of herrtca! Technolog
141 Gajeong-ro, Yuseong-gu, Daejeon 305-600
Republic of Korea
Figure imgf000041_0002
： 3fl8-SflS
Έ S: ；
SI lc t8-¾- IrSrHi ^ίδ^Μι： Ψ^:
&1¾- tofe
Ιοί»δ: mwta ½1£ Ιί£
ᅳ ta^ Ί
•(taairW 극 te윷 te) ta^fefe : ¾{¾rfe C 〕
： £ K 3 ^香 n δ¾¾ "5 I
^五 fetete Ί
； 01
Figure imgf000042_0001
i*# Ιοβ^. fek*. fe^lc &la i p¾fe¾
" ' bo t¾ .Z.00/CT0ZaM/X3d U8/^0/ 0Z OAV

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 ( Streptomyces scopul iridis) KR— 001 균주.
【청구항 2】
가탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로 선택되는 어느 하나 이상올 유효성분으 로 포함하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
【청구항 3】
제 2항에 있어서, 상기 분획물은 상기 배양액의 추출물을 핵산, 에틸 아세 테이트， 부탄올 및 물을 용매로 사용하여 순차 분획 된 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
【청구항 4】
제 2항에 있어서 상기 활성분획은 상기 배양액 분획물을 컬럼 크로마토그래 피에서 메탄올， 에탄을 또는 이들의 수용액을 용매로 사용하여 6 분 내지 7 분， 8 분 내지 10 분 또는 15 분 내지 20분에서 용출된 분획인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 ¾성물.
【청구항 5】
제 2항에 있어서， 상기 잡초는 화본과 잡초， 광엽 잡초 또는 난방제 잡초인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 화본과 잡초는 바탱이 (/?/§o / sanguinalis) , 수 ( Sorghum bi color) , 7 ^{Agropyron a ithii) 및 {Echinochloa crus-gal Π) 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
【청구항 7】
제 5항에 있어서， 상기 광엽 잡초는 까마증 (5b/a/n//H nigrum) , 자귀풀
{Aeschynomeme indica) , 어저귀 (/i i//o/7 . avicennae) , 도꼬마리 (/a/7 A/izffl stnimariu ) 및 메꽃 /_ 5 ^/<3
Figure imgf000044_0001
으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하 나인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
【청구항 8】
제 5항에 있어서, 상기 난방제 잡초는 가시박 ᅳ angulatus) , 환삼덩굴 {Humulus japonicLis) , ^{Artemisia princeps) , ί£7] Equisetum arvense) 및 클 로쒜 Tr fo J him repens) S— 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물ᅳ
【청구항 9】
기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 잡초， 이의 종자또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잡초 방제 방법 .
【청구항 10】
제 9항에 았어서， 상기 잡초는 화본과 잡초, 광엽 잡초 또는 난방제 잡초인 것을 특징으로 하는 잡초 방제 방법 . ᅳ
[청구항 11】
감자 전분 (potato starch) 및 콩 분말 (soybean powder)을 유효성분으로 함유하는 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산용 배지 조성물.
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 감자 전분은 1 내지 3%(w/v), 콩 분말은 0.5 내지 2 (w/v) 함유된 것을 특징으로 하는 스트램토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산용 배지 조성물.
【청구항 13】
제 11항에 있어서， 상기 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주는 수탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주인 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산용 배지 조성물.
【청구항 14】
제 U항에 있어서 상기 조성물은 글루코스 (glucose)를 추가적으로 포함하는 것올 특징으로 하는 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산용 배지 조성물.
【청구항 15】
제 11항에 있어서， 상기 조성물은 감자 전분 3%(w/v) 및 콩 분말 2%(w/v)를 함유하는 것을 특징으로 하는 스트템토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산용 배지 조성물.
【청구항 16]
제 11항에 있어서, 상기 조성물은 감자 전분 l%(w/v), 글루코스 l%(w/v) 및 콩 분말 l%(w/v)을 함유하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 대량생산용 배지 조성물.
【청구항 17】 ·
1) 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 함유하는 배지 조성물을 제조하는 단계 ; 및 2) 상기 단계 1)의 배지 조성물에 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 균주 1 내지 3%(w/v)를 접종한 후 , 5 내지 7일간 배양하는 단계를 포함하는 스트템토마이세스 스코풀리 리 디스 균주 대량생산 방법 .
【청구항 18]
잡초 방제용 제초제 조성물로 사용하기 위한 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리 리디스 KR-001 균주， 이의 배양액， 상기 배양액의 추출물， 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 용도 .
[청구항 19】
대량생산용 배지 조성물로 사용하기 위한 감자 전분 및 콩 분말을 유효성분으로 포함하는 스트램토마이세스 스코풀리리디스 균주 배지의 용도 .
PCT/KR2013/007279 2012-08-14 2013-08-13 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물 WO2014027821A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015527367A JP6273279B2 (ja) 2012-08-14 2013-08-13 ストレプトマイセス・スコプリリディスｋｒ−００１株またはその培養液を活性成分として含む雑草防除用組成物
US14/621,765 US9491948B2 (en) 2012-08-14 2015-02-13 Composition comprising Streptomyces scopuliridis KR-001 strain, or culture broth thereof as active ingredient for weed control

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088828A KR101402215B1 (ko) 2012-08-14 2012-08-14 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 ｋｒ―００１ 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물
KR10-2012-0088828 2012-08-14
KR1020130091223A KR101715120B1 (ko) 2013-07-31 2013-07-31 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주 대량생산용 배지 조성물
KR10-2013-0091223 2013-07-31

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/621,765 Continuation-In-Part US9491948B2 (en) 2012-08-14 2015-02-13 Composition comprising Streptomyces scopuliridis KR-001 strain, or culture broth thereof as active ingredient for weed control

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014027821A1 true WO2014027821A1 (ko) 2014-02-20

Family

ID=50101321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/007279 WO2014027821A1 (ko) 2012-08-14 2013-08-13 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9491948B2 (ko)
JP (1) JP6273279B2 (ko)
WO (1) WO2014027821A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114097500A (zh) * 2021-11-22 2022-03-01 晋中学院 一种谷子种植除草方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102086066B1 (ko) * 2018-10-25 2020-03-05 한국화학연구원 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 n29 균주, 또는 이의 배양여액을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6524577B1 (en) * 2000-09-27 2003-02-25 Agraquest, Inc. Strain of Streptomyces for controlling plant diseases
KR100461579B1 (ko) * 2002-02-16 2004-12-14 주식회사 그린바이오텍 신균주 스트렙토마이세스 속 ａ6497(ｋｃｔｃ 10144ｂｐ)및 이를 이용한 미생물 제초제
KR100477890B1 (ko) * 2002-10-15 2005-03-18 한국생명공학연구원 신균주 스트렙토마이세스 속 ８ｅ１２ 및 이를 이용한 제초제
US20120028799A1 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 Bioworks, Inc. Growth enhancement and control of bacterial and fungal plant diseases with streptomyces scopuliridis

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS572313B2 (ko) * 1973-02-05 1982-01-14
TWI312681B (en) * 2001-02-01 2009-08-01 Novel physiologically active substance
JP5230647B2 (ja) * 2006-12-20 2013-07-10 ノバルティス アーゲー アミノチアゾール大環状分子、抗菌化合物としてのその使用およびその製造法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6524577B1 (en) * 2000-09-27 2003-02-25 Agraquest, Inc. Strain of Streptomyces for controlling plant diseases
KR100461579B1 (ko) * 2002-02-16 2004-12-14 주식회사 그린바이오텍 신균주 스트렙토마이세스 속 ａ6497(ｋｃｔｃ 10144ｂｐ)및 이를 이용한 미생물 제초제
KR100477890B1 (ko) * 2002-10-15 2005-03-18 한국생명공학연구원 신균주 스트렙토마이세스 속 ８ｅ１２ 및 이를 이용한 제초제
US20120028799A1 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 Bioworks, Inc. Growth enhancement and control of bacterial and fungal plant diseases with streptomyces scopuliridis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MACEDO, JULIANA ALVES ET AL.: "Optimization of medium composition for transglutaminase production by a brazilian soil Streptomyces sp.", ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 10, no. 4, 15 October 2007 (2007-10-15), pages 618 - 626 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114097500A (zh) * 2021-11-22 2022-03-01 晋中学院 一种谷子种植除草方法
CN114097500B (zh) * 2021-11-22 2022-09-23 晋中学院 一种谷子种植除草方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015524669A (ja) 2015-08-27
US20150230477A1 (en) 2015-08-20
JP6273279B2 (ja) 2018-01-31
US9491948B2 (en) 2016-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018329208B2 (en) Methods and compositions for the biological control of plant pathogens
Anand et al. Integrated control of fruit rot and powdery mildew of chilli using the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens and a chemical fungicide
AU2013308476B2 (en) Method of increasing abiotic stress resistance of a plant
Tamm et al. Elicitors and soil management to induce resistance against fungal plant diseases
EP3288361A1 (en) Isolated complex endophyte compositions and methods for improved plant traits
CN110520519A (zh) 细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种bs89作为提高植物生产力和防止植物疾病的方法
WO2000061591A1 (fr) Activateur de plante, procede de production de cet activateur, procede d&#39;activation, stimulateur d&#39;activite et procede d&#39;application de ce stimulateur
CN107427011A (zh) 预防农作物和观赏植物中，优选葡萄种植和木本植物中的感染的方法
WO2014027821A1 (ko) 스트랩토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물
Mergawy et al. Evaluation of the efficacy of some bioagents accompanied with Bio-and Mineral Fertilizers in controlling early blight of tomato and improvement yield
KR20140073867A (ko) 스트렙토마이세스 에룸펜스 ｋｒｂ－００１ 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성물
Abada et al. Effect of combination among bioagents, compost and soil solarization on management of strawberry Fusarium wilt
Reddy et al. Applied Microbiology (agriculture, environmental, food and industrial microbiology)
Abdulrahman et al. Effect of some agroecosystems management applications on plant flowering and root-knot nematodes activates using some soil improvements in greenhouses
KR101475260B1 (ko) 억새의 근권 토양으로부터 분리한 식물 생장을 촉진하는 바실러스 서브틸리스 ｊｓ 균주 및 이의 용도
Grosch et al. Control of bottom rot on lettuce caused by Rhizoctonia solani with commercial biocontrol agents and a novel fungicide/Bekämpfung der Salatfäule an Kopfsalat, verursacht durch Rhizoctonia solani mit kommerziellen Biokontrollpräparaten und einem neuen Fungizid
US20230240304A1 (en) Aspergillus terreus strain and composition for controlling bacterial plant diseases using strain or culture filtrate thereof
Abdel-Kader et al. Applicable control measure against Orobanche ramosa in tomato plants
Yousif et al. Evaluation of salicylic acid solution on fungus Botrytis cinerea that caused strawberry gray mold
Botero Ramírez Effect of three Trichoderma species on clubroot disease in cabbage
Keshari et al. Arbuscular Mycorrhizal Fungi: A Potential Agent for Phytonematodes Management in Diverse Agro-climatic Zones
El-Deriny et al. Efficiency of Amended Composts for Biocontrol of Root-Knot Nematode Infected Cantaloupe, Cucumis melo Var. Cantalupensis in Egypt
Raguchander Book of Abstract
dos Santos Use of environmental bacteria as plant growth promoters
Zyton et al. Management of bean rust by some bioagents and essential plant oils

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13829747

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015527367

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13829747

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1