CN116240149A - 一种解淀粉芽胞杆菌及其防治芸豆普通细菌性疫病的应用 - Google Patents

一种解淀粉芽胞杆菌及其防治芸豆普通细菌性疫病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种解淀粉芽胞杆菌及其防治芸豆普通细菌性疫病的应用，其命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2，已于2023年2月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2023132，保藏地址为中国武汉大学。本发明的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2可以有效地防治芸豆普通细菌性疫病，同时对芸豆生长具有促生作用；通过对该菌株室内及田间防治研究研究，能为芸豆普通细菌性疫病的生物防治及后续开发提供新的生防资源。

Description

一种解淀粉芽胞杆菌及其防治芸豆普通细菌性疫病的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一种解淀粉芽胞杆菌及其防治芸豆普通细菌性疫病的应用。
背景技术
芸豆，学名菜豆Phaseolus vulgaris L.，是我国杂粮种植中重要的食用豆类作物之一，在豆科作物中，种植面积及产量仅次于大豆。由地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli,Xap)与褐色黄单胞菌褐色亚种(Xanthomonasfuscans subsp.fuscans,Xff)侵染引起的普通细菌性疫病，是世界范围内普遍发生的最重要的芸豆病害之一，防治难度大，可导致20％～60％的产量损失，严重时产量损失高达80％以上，并且严重影响品质。现阶段，未发现完全免疫的芸豆品种，高抗品种也很少，防治主要依赖以铜制剂为主的化学药剂，种类相对单一，且化学药剂的大量使用会污染生态环境及产生抗性。而利用生防菌防治植物病害，不仅可以减少环境污染，还能缓解病原菌的抗性，促进植物生长，生防菌的筛选与应用已成为植物病害防治的热点。
近年来，众多科研工作者在植物细菌性病害生物防治领域进行了大量研究，筛选出很多具有优良效果的生防微生物，例如，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、菌核曲霉(Aspergillus sclerotiorum)、链霉菌(Streptomyces sp.)等。目前，关于筛选生防微生物防治芸豆普通细菌性疫病的研究尚未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种解淀粉芽胞杆菌及其防治芸豆普通细菌性疫病的应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，其命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2，已于2023年2月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2023132，保藏地址为中国武汉大学。
本发明的第二个目的是要提供一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2在防治芸豆普通细菌性疫病中的应用。
与现有技术相比，本发明的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2可以有效地防治芸豆普通细菌性疫病，同时对芸豆生长具有促生作用；通过对该菌株室内及田间防治研究研究，能为芸豆普通细菌性疫病的生物防治及后续开发提供新的生防资源。
附图说明
图1为解淀粉芽胞杆菌KY2对芸豆普通性细菌疫病的抑制效果：A为对芸豆普通性细菌疫病病原菌地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种的抑制效果；B为对芸豆普通性细菌疫病病原菌褐色黄单胞菌褐色亚种的抑制效果。
图2为解淀粉芽胞杆菌KY2的菌落形态：A为KY2在LB培养基的菌落形态；B为KY2显微镜下的菌落形态。
图3为解淀粉芽胞杆菌KY2系统发育树。
图4为解淀粉芽胞杆菌KY2种子处理防治效果：A为KY2浸种处理病原菌Y1的效果；B为病原菌Y1浸种的效果；C为中生菌素浸种处理病原菌Y1的效果；D为KY2浸种处理病原菌Y7的效果；B为病原菌Y7浸种的效果；C为中生菌素浸种处理病原菌Y7的效果。
图5为解淀粉芽胞杆菌KY2室内盆栽防治效果：A为接种病原菌Y1；B为接种病原菌Y7；C为KY2对Y1治疗效果；D为KY2对Y7的治疗效果；E为KY2对Y1的预防效果；F为KY2对Y7的预防效果。
图6为解淀粉芽胞杆菌KY2的产生的代谢产物：A为纤维素酶；B为蛋白酶；C为嗜铁素。
图7为解淀粉芽胞杆菌KY2对芸豆种子萌发的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2筛选和鉴定：
1)称取10g黑龙江省嫩江市芸豆种植地根际土壤样品加入至装有90mL无菌水的三角瓶中，置于28℃、180r/min的摇床上震荡30min，土壤样品充分悬浮后取出置于80℃的水浴锅中水浴10min，然后取1mL土壤悬液，用无菌水按10-3、10-4、10-5进行梯度稀释，每个梯度吸取100μL涂布于LB平板，置于28℃培养箱中倒置培养24h后，选取不同形态的菌落，经平板划线纯化后保存备用。
2)将芸豆普通细菌性疫病病原菌Xap和Xff单菌落接种至NB培养基中，28℃培养至菌液OD600为1.0。将芸豆普通细菌性疫病病原菌Xap、Xff分别按照3％的接种量加入到己经冷却至45℃的装有NA培养基的三角瓶中，充分摇匀后分装培养皿，待冷却凝固后即为含芸豆普通细菌性疫病病原菌平板。
3)分离纯化后的芽胞杆菌单菌落接菌至LB培养基中，28℃培养菌液OD600为2.0。将直径为6mm的无菌滤纸片置于病原菌平板中央，吸取5μL分离纯化后的芽胞杆菌菌液于滤纸片上，同时以无菌水作为空白对照，静置30min后，28℃培养2-3d，观察抑菌圈的形成，进行拮抗细菌初筛。产生抑菌圈的菌株，按照上述方法进行抑菌活性的复筛，设置3次重复，计算抑菌率，选取抑菌圈直径大的菌株进行后续试验。
4)将拮抗细菌采用三线法在LB固体平板培养基上进行划线，置于28℃培养箱中培养24h后取出观察其菌落的形状、大小和颜色等菌落特征，并在光学显微镜下观察细菌形态特征。同时，依据《常见细菌系统鉴定手册》，对其生理生化特征进行鉴定。
5)采用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)提取拮抗细菌的总DNA，利用细菌16S rDNA的通用引物和gyrB基因简并引物对菌株KY2基因组DNA进行PCR扩增；细菌16S rDNA的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)和gyrB基因简并引物(gyrB-F：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，gyrB-R：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′，其中Y＝C/T，R＝A/G，N＝A/G/C/T)。PCR产物进行测序，其序列表如下：
>KY2：16S
GGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTG
G
TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC
AGC
AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAA
CAA
GTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT
TGT
CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAAC
TTG
AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACT
GAC
GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTT
AG
TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTG
GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGG
TG
CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAG
G
TGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAA
GG
GCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGT。
>KY2-gyrB
CCGGCGGTCTTCACGGTGTAGGGGCGTCCGTCGTAAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCGTGACGGGAAAATCCACTATCAGGCG
TA
CGAGCGCGGTGTACCTGTGGCTGATCTTGAAGTGATCGGCGAAACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGAAATTTTCAAAG
AA
ACAACCGTATATGACTATGATCTGCTTTCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAGGCGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGG
AC
AAGAACGGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGAGTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTA
TAT
CGAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCACAAATAATATCAACACATA
C
GAAGGCGGCACGCACGAGGCCGGATTTAAAACCGGTCTGACCCGTGTCATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAAAATGATCCGA
ATT
TAAGCGGGGATGATGTGAGAGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAAAACCAAGCTCGGCAA
CTC
CGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCTGTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCGGACTCAGCCCGCAAAATCGTTGAAAAAGGTTT
A
ATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCGGCGAAAAAAGCCCGGGAATTGACCCGGCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCG
GACT
GTTCTTCTAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGTGACTCTGCGGGCGGATCAGCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCC
AT
TCTGCCGCTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGATTCTCTCAAACAATGAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACA
GGGATCGGAGAAGATTTTAAT。
6)然后将所测得的序列在NCBI的Blast数据库中进行比对，并利用MEGA7.0中的Neighbor-joining分析法构建系统发育树。
参见图1，该菌株对芸豆普通细菌性疫病病原菌具有明显拮抗效果，对Xap和Xff的抑菌圈直径分别为(18.17±0.58)mm、(24.00±1.5)mm。该菌为革兰氏阳性菌，在LB固体培养皿上菌落表面光滑，边缘整齐，圆形，呈淡黄色，不透明，参见图2。16S rDNA的GenBank登录号为OM349482，经鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，参见图3，将其命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2，并于2023年2月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2023132，保藏地址为中国武汉大学。
进一步为了验证上述实施例的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2防治芸豆普通细菌性疫病防治效果，以下分别阐述淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2对室内盆栽和田间芸豆的芸豆普通细菌性疫病的防效。
实施例2
将芸豆普通细菌性疫病病原菌(Xap、Xff)和拮抗菌分别在NA和LB固体平板上活化。28℃培养箱中培养12～24h后挑取单菌落转接到NB/LB液体培养基，置于28℃，180r/min摇床上培养24～36h后，调整病原菌Xap、Xff的OD600为0.5，拮抗菌的OD600为2.0，制备成菌悬液待用。盆栽芸豆长出对生真叶时，采用三种接种方式进行叶片接种，观察和测定拮抗菌对于芸豆普通细菌性疫病病原菌Xap、Xff的抑制活性。
种子处理：选取大小均匀、健康饱满的芸豆种子，使用芸豆普通细菌性疫病病原菌(Xap、Xff)菌液浸泡5min后，自然晾干。分别使用菌株KY2的发酵液、12％中生菌素1000倍液浸泡芸豆种子30min，自然晾干后播种，设置清水处理为阴性对照，芸豆普通细菌性疫病病原菌(Xap、Xff)处理为阳性对照，三个重复。
叶片治疗处理：利用移液器枪头将病原菌Xap、Xff的菌液5μL穿刺接入芸豆对生真叶中，2h后再接种同体积的拮抗菌KY2菌液。
叶片预防处理：利用移液器枪头将拮抗菌的菌液5μL穿刺接入芸豆叶片中，2h后再接种同体积的病原菌Xap、Xff菌液。以12％中生菌素可湿性粉剂为药剂对照，清水对照只接致病菌不接生防菌。每种方法接种6张叶片，接菌后将芸豆苗放入相对湿度95％、28℃12h/20℃12h人工气候箱中培养至有接种幼苗发病，之后调整相对湿度50％继续培养，期间随时根据基质干湿情况补充水分。连续15d观察病斑的形成。根据叶片病斑所占叶片表面积，记录植株病级，并计算病情指数。病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)，防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。
结果表明，淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2通过种子处理、叶片治疗处理、叶片预防处理均能较好的防治芸豆普通细菌性疫病，参见图4、图5，其中，叶片治疗处理对病原菌Xap的防效为71.9％，对病原菌Xff的防效为63.6％；叶片预防处理中对病原菌Xap的防效为54.5％，对病原菌Xff的防效为66.1％。
实施例3
试验采用随机区组设计，每处理3次重复。每小区5垄，垄宽0.65m，垄长6m，约20m2。每小区区间设隔离区1垄，小区周围设置保护行。采用种子处理处理，以清水为空白对照，在对照发病后进行发病情况调查，收获后，进行产量调查。结果表明，通过田间使用淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2拌种试验发现，芸豆普通细菌性疫病发病率下降18.5％，产量提高9.9％。
上述实施例2和实施例3已经证实了淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2能够防治芸豆普通细菌性疫病，为了分析说明淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KY2拮抗芸豆普通细菌性疫病的机制，分别在CAS检测平板、纤维素检测平板、蛋白酶检测平板和淀粉水解平板中央点样5μL菌株KY2的发酵液，重复3次，28℃培养2-3d，观察是否有水解圈产生，初步分析菌株KY2的植物根际促生菌特性的嗜铁素、纤维素水解、蛋白酶水解、淀粉水解能力。
使用大小均匀、健康饱满的芸豆种子，经过75％的酒精、1％次氯酸钠浸泡消毒后，用自来水冲洗多次。以菌株KY2的发酵液浸泡芸豆种子6h，以蒸馏水浸泡的为对照组。将处理后的种子放入铺有2层含饱和水分滤纸的发芽盒中，每个发芽盒中均匀摆入15粒种子，4次重复。在恒温培养箱25℃条件下进行萌发试验，每天喷洒蒸馏水，保持种子湿润，培养7d，定期观察并记录种子发芽情况，计算发芽率、发芽指数、活力指数。
结果表明，菌株KY2在蛋白酶检测平板上出现明显的透明圈，在纤维素和CAS检测平板上并没有出现透明圈，这些说明菌株KY2具有强的蛋白水解酶活性，不具有水解纤维素酶活性，不产生嗜铁素，参见图6。菌株KY2对处理的芸豆与对照的发芽率均为100％，但菌株KY2对处理的芸豆发芽指数为21.0，显著高于对照的19.8，菌株KY2对处理的芸豆的活力指数为398.6，显著高于对照的332.9，如图7、表1所示，A为菌株KY2的发酵液浸泡芸豆种子的萌发状态，B为对照组蒸馏水浸泡的芸豆种子的萌发状态，由图7和表1可知，菌株KY2对芸豆生长具有促生作用。
表1为菌株KY2对菜豆种子萌发促生的影响
Figure SMS_1
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，其命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2，已于2023年2月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2023132，保藏地址为中国武汉大学。
2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KY2在防治芸豆普通细菌性疫病中的应用。
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