CN114196551A - 一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢菌株及其应用，属于微生物技术领域。所述菌株分类命名为爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC‑f1，已于2020年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19601。该菌株对绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨具有强致病力，可被开发为生防菌制剂应用于对多种柑橘害虫的生物防治，较化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性等特征，且该爪哇棒束孢菌株生长速度快、产孢量大、易于制备，具有良好的市场应用前景。

Description

一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢菌株及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

绣线菊蚜（Aphis citricola）、柑橘吹绵蚧（Icerya purchasi）、柑橘木虱（Diaphorina citri）和柑橘全爪螨（Panonychus citri）是柑橘上的重要害虫。其中绣线菊蚜以成虫、若虫密集在幼芽、嫩枝和嫩叶背面上刺吸汁液，使幼叶反卷，严重发生时造成新芽短缩，嫩叶皱缩畸形，叶落芽秃，树势衰弱；此外，还可分泌蜜露，诱发煤烟病；更为重要的是，绣线菊蚜还是柑橘衰退病毒、柑橘黄脉病毒等病原物的自然传播媒介，害虫在病树和健树之间的辗转危害，造成柑橘衰退病和柑橘黄脉病等病害的蔓延扩散。柑橘吹绵蚧以若虫和雌成虫群集在柑橘等植物的枝干、叶背中脉两侧和果实上为害，吸食汁液，使叶黄枝枯，枝条萎缩，皮层粗糙，甚至枯死，引起落叶、落果；并能排泄大量蜜露，诱发煤烟病，影响光合作用。柑橘木虱是柑橘等芸香科植物新梢期的主要害虫，可直接取食危害新梢嫩叶及产生分泌物诱发煤烟病等；尤为严重的是，柑橘木虱是柑橘黄龙病的唯一自然传播媒介，而柑橘黄龙病则是柑橘生产上防治最难、威胁最大的毁灭性病害，其虫口密度与柑橘黄龙病发生的严重程度呈正相关。柑橘全爪螨以成螨、若螨和幼螨通过口器刺破寄主叶片表皮吸食汁液，被害叶面呈现无数灰白色小斑点，严重时全叶失绿变成灰白色，导致大量落叶，亦能为害果实及绿色枝梢，严重影响树势和产量。

对绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨等害虫进行有效防治，无论对于杜绝害虫本身对柑橘树体的危害还是抑制由其传播的柑橘衰退病、柑橘黄脉病等病害的扩散蔓延，都具有重要的意义。目前对于这些害虫的防治仍以化学农药为主，然而化学农药的频繁使用带来的3R（抗性（Resistance）、再增猖獗（Resurgence）和残留（Residue））问题日趋严重。而生物农药因具有无残留、特异性强、不杀伤害虫天敌及有益生物、不易产生抗药性、环境相容性好、生产工艺简单等特点越来越引起人们的重视。其中微生物农药是当前研究最多的生物农药，在真菌杀虫剂的应用上，利用白僵菌防治松毛虫、玉米螟和水稻叶蝉等40余种害虫，利用绿僵菌防治东亚飞蝗等多种蝗科害虫，利用金龟子绿僵菌防治甘薯沫蝉等，均取得了显著的效果，可见真菌杀虫剂生物农药在病虫害的防治中具有良好的应用前景。

爪哇棒束孢（Isaria javanica）是虫草科（Conlycipitaceae）棒束孢属（Isaria）真菌，已有研究报道爪哇棒束孢（Isaria javanica）不同菌株可侵染烟粉虱（Bemisia tabaci）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、美国白蛾（Hyphantria cunea）、埃及吹绵蚧（Icerya aegyptiaca）、扶桑绵粉蚧（Phenacoccus solenopsis）、普通大蓟马（Megalurothrips usitatus）、茶小绿叶蝉(Empoasca vitis)、褐飞虱（Nilaparvata lugens）等多种害虫，而关于该种真菌在柑橘害虫防治上的研究报道较少。本发明所提供的爪哇棒束孢（Isaria javanica）菌株MSC-f1，经研究证实其对绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨具有强致病力，具有被开发为生防菌制剂的潜能，应用于对绣线菊蚜等害虫的生物防治中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢菌株及其应用，该菌株具有被开发为生物农药的潜能，具有良好的市场应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供了一种爪哇棒束孢菌株，该菌株分类命名为爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1，已于2020年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 19601。

进一步的，上述一种爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1是从浙江省台州市黄岩区的橘园中采集的柑橘木虱虫体上分离获得的，该菌株的形态特征、培养特性、基因序列分析和菌种分类结果如下：

菌株MSC-f1的形态特征：菌株MSC-f1在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基生长良好，25℃下暗培养10 d其菌落直径可达4.62 cm。在PDA培养基平板上，培养初期菌落呈圆形，气生菌丝发达，白色棉絮状；培养中后期菌落分层，具同心轮纹，此时菌落边缘多为厚实的白色絮状菌丝，而菌落中间层较薄，为灰紫色孢子层；菌落背面为淡黄色。在光学显微镜下观察菌株MSC-f1的菌丝呈透明无色，宽度1.82 ± 0.48 μm；分生孢子梗较粗短，不成孢梗束，长10.38 ± 3.26 μm，宽3.26 ± 0.35 μm；产孢细胞瓶状，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，长7.52 ± 1.31 μm，最宽处直径2.75 ± 0.35 μm，轮状直接着生于菌丝或分生孢子梗顶端；分生孢子着生于瓶梗上，无色光滑，长椭圆形，排列成链状，长4.57 ± 1.43 μm，宽2.17 ± 0.36 μm。

菌株MSC-f1的生物学特性： 菌株MSC-f1在PDA培养基上于15 ℃-30 ℃的温度范围内均可生长，其中25 ℃和30 ℃时菌丝生长速率明显高于其他温度，低温5 ℃和10 ℃下菌落几乎不生长。菌株MSC-f1在供试PDA培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基、酵母膏麦芽膏琼脂（YMA）培养基、玉米粉琼脂（CMA）培养基、麦芽浸粉琼脂（MEA）培养基、察氏（CDA）培养基、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上均能生长，其中在SDAY、PDA和CDA等培养基上生长最快；在供试7种培养基上菌落背面均呈黄色，其中在SDAY培养基上颜色最深；在7种培养基上均能产孢，其中在SDAY培养基上产孢量最大，其次是PDA培养基。

菌株MSC-f1的基因序列分析：测序所得菌株MSC-f1的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列如SEQ ID NO:1所示，β-tubulin基因部分序列如SEQ ID NO:2所示，TEF1-α基因部分序列如SEQ ID NO:3所示。利用NCBI Blast进行比对分析发现，菌株MSC-f1的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列与GenBank中爪哇棒束孢菌（Isaria javanica）多个菌株对应基因序列（如KM234215、JN204422、MH532893等）的相似性达99.8%~100%；菌株MSC-f1的TEF1-α基因部分序列与GenBank中爪哇棒束孢菌（Isaria javanica）多个菌株对应基因序列（如KY587207、KT225600、KT225598等）的相似性最高也达100%；而其β-tubulin基因部分序列与GenBank中爪哇棒束孢（Isaria javanica）不同菌株对应基因序列（如KT225602、MN215882 、KT225605等）的相似性最高为99.41%，说明菌株MSC-f1的β-tubulin基因序列与已报道的菌株对应基因序列存在碱基差异。

根据以上关于菌株MSC-f1的形态特征、生物学特性及基因序列分析结果，可将菌株MSC-f1鉴定为盘菌亚门（Pezizomycotina）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocrellales）虫草科（Cordycipitaceae）棒束孢属（Isaria）的爪哇棒束孢（Isaria javanica）。

本发明还提供了上述一种爪哇棒束孢菌株在防治柑橘害虫中的应用。

进一步的，上述柑橘害虫包括绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨。

本发明还通了一种柑橘害虫的生防菌制剂，该生防菌制剂中含有上述的爪哇棒束孢MSC-f1的分生孢子。

进一步的，上述生防菌制剂中爪哇棒束孢MSC-f1的分生孢子含量为1×10⁸个分生孢子/mL。

本发明还提供了上述一种生防菌制剂在防治柑橘害虫中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：（1）本发明提供的爪哇棒束孢菌株MSC-f1是从浙江省台州市黄岩区柑橘园中被侵染的柑橘木虱虫体上分离获得的，经测定菌株MSC-f1不仅对柑橘木虱具有较强的致病力，而且对绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧和柑橘全爪螨也具有强致病力；（2）本发明所述的爪哇棒束孢MSC-f1是一种昆虫病原真菌，其分生孢子悬浮液可直接作用于绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨等害虫，较目前的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征；（3）菌株MSC-f1生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。综上所述，菌株MSC-f1在被开发为生防菌制剂用于对柑橘绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨等害虫的生物防治上，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1在PDA培养基上培养20 d后的菌落特征。

图2为在光学显微镜下观察的爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1的菌丝、产孢结构和分生孢子特征。

图3为在体视显微镜下观察的爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1对绣线菊蚜（A）、柑橘吹绵蚧（B）、柑橘木虱（C）和柑橘全爪螨（D）的侵染致病情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明所述的一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢，其分类命名为爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1，已于2020年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19601。

本发明中所用到的培养基如下：

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基：去皮马铃薯200g，加水1000 mL煮沸半个小时后纱布过滤，向滤液中加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min；

沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基：酵母浸膏10 g、葡萄糖40 g、蛋白胨10g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH6.0；

酵母膏麦芽膏琼脂（YMA）培养基：酵母浸膏4 g、麦芽浸膏10g、葡萄糖4 g、琼脂20g、蒸馏水1 L，pH7.2；

玉米粉琼脂（CMA）培养基：玉米浸粉7g、琼脂15g、蒸馏水1L，pH6.0；

麦芽浸粉琼脂（MEA）培养基：麦芽浸粉30 g、大豆蛋白胨3 g、琼脂15 g、蒸馏水1L，pH5.6；

察氏（CDA）培养基：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH7.3；

沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH5.6。

实施例1：昆虫病原真菌的分离和筛选

1 病菌的分离纯化：

从浙江省台州市黄岩区柑橘园内采集柑橘木虱虫尸，于实验室超净工作台中进行如下操作：先将虫体放于70vol%的乙醇中浸泡30 s，再经过0.1wt%的升汞浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基平板中；将培养皿置于微生物培养箱中25℃恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养（重复此操作2~3次），持续培养10 d左右，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液（浓度为3.0×10⁹ 个孢子/mL），然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法（方中达. 植病研究方法(第三版)[M]. 北京: 中国农业出版社,1998: 122-140）对病菌进行单孢分离，最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养5 d左右，置于4℃冰箱保存。

2 致病菌的筛选

将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于25℃恒温培养10 d左右后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备获得分生孢子悬浮液（浓度为3.0×10⁹ 个孢子/mL），向其中加入终浓度为0.1vol%的吐温-80；取30头健康柑橘木虱成虫浸没于含0.1vol%吐温-80的分生孢子悬浮液中10~15 s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上（培养皿底部铺有2层用无菌水湿润过的滤纸，其上放置一个带10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水湿润的脱脂棉包裹），然后放于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱作为对照，培养7 d后观察致病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况。之后再按前述病菌的分离纯化方法从处理后的柑橘木虱虫体中分离病菌，比较再分离的病菌与初始接种的病菌的形态特征和培养特征。

通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，获得1株对柑橘木虱具有致病力的菌株，将其命名MSC-f1。

3 菌株的复壮：

制备上述筛选到的对柑橘木虱具致病力的菌株MSC-f1的分生孢子悬浮液（浓度为3.0×10⁹ 个孢子/mL），接种到健康柑橘木虱虫体上，然后再从发病的柑橘木虱虫体上分离纯化病菌，具体操作方法同前述，最后获得分离纯化的菌株MSC-f1。

实施例2：菌株MSC-f1的鉴定分析

1 菌株MSC-f1的形态特征

将上述分离纯化的菌株MSC-f1接种到PDA培养基平板中央，置于25℃恒温培养，每天观察菌落生长情况并记录菌落颜色和形态。将菌株MSC-f1接种到另一PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片（1 cm×1 cm）斜插入距接种点约1 cm左右处的培养基内，置于25 ℃恒温培养至菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株MSC-f1的菌丝和孢子形态。

菌株MSC-f1在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基生长良好，25℃下暗培养10 d其菌落直径可达4.58 cm。

如图1所示，菌株MSC-f1在PDA培养基上25 ℃恒温培养20 d后的菌落特征，可见其气生菌丝发达，白色棉絮状；菌落呈圆形，分层，具同心轮纹；菌落边缘多为厚实的白色絮状菌丝，而菌落中间层较薄，为灰紫色孢子层；菌落背面为淡黄色。

如图2所示，在光学显微镜下观察的菌株MSC-f1的形态特征，可见其菌丝透明无色，宽度1.82 ± 0.48 μm；分生孢子梗较粗短，不成孢梗束，长10.38 ± 3.26 μm，宽3.26± 0.35 μm；产孢细胞瓶状，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，长7.52 ± 1.31 μm，最宽处直径2.75 ± 0.35 μm，轮状直接着生于菌丝或分生孢子梗顶端；分生孢子着生于瓶梗上，无色光滑，长椭圆形，排列成链状，长4.57 ± 1.43 μm，宽2.17 ± 0.36 μm。

2 菌株MSC-f1的生物学特性

（1）菌株MSC-f1在不同温度下的生长情况：以10 mL无菌水洗脱在PDA平板上培养10 d后的菌株MSC-f1，经无菌纱布过滤除去菌丝，收集滤液制成分生孢子悬浮液（浓度为3.0×10⁹ 个孢子/mL）。用移液器移取1 mL孢子悬浮液加入到冷却至50 ℃以下的PDA培养基中混匀，在超净工作台下倒入无菌培养皿中制成带菌平板，然后放入25℃恒温培养下中培养至有肉眼可见的菌丝长出，即用直径0.5 cm的打孔器打取菌饼，分别将菌饼置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，分别于5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃恒温培养箱中倒置培养，每个温度下设3个重复。培养10 d，每24 h观察菌落生长情况并采用十字交叉法记录菌落直径。

结果见表1，可以看出：菌株MSC-f1在PDA培养基上于15 ℃-30 ℃的温度范围内均可生长，其中25 ℃和30 ℃时菌丝生长速率明显高于其他温度，低温5 ℃和10 ℃下菌落几乎不生长。因此，可确定25- 30 ℃为菌株MSC-f1的适宜生长温度。

表1 菌株MSC-f1在不同温度下的生长情况

（2）MSC-f1在不同培养基中的生长和产孢情况：

分别配制马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基、酵母膏麦芽膏琼脂（YMA）培养基、玉米粉琼脂（CMA）培养基、麦芽浸粉琼脂（MEA）培养基、察氏（CDA）培养基、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基，经高压灭菌后于超净工作台下制备培养基平板。以无菌打孔器在培养后的菌株MSC-f1的带菌PDA平板上打取0.5 cm大小的菌落（如前所述），然后将菌饼分别置于上述各培养基平板中央，将培养皿密封后置于培养箱中暗培养10 d后，采用十字交叉法测量记录菌落直径。最后用10 mL无菌水洗脱分生孢子，用血球计数板在光学显微镜下记录孢子数量后计算孢子浓度。

结果见表2，可以看出：菌株MSC-f1在供试7种培养基上均能生长，其中在SDAY、PDA和CDA等培养基上生长最快；在供试7种培养基上菌落背面均呈黄色，其中在SDAY培养基上颜色最深，CDA培养基次之，在其余培养基上颜色较浅；菌株MSC-f1在7种培养基上均能产孢，其中在SDAY培养基上产孢量最大，其次是PDA培养基。

表2 菌株MSC-f1在不同培养基上的生长和产孢情况

3 菌株MSC-f1的基因序列分析

将菌株MSC-f1接种至PDA培养基平板，置于25℃恒温培养至菌落长满整个培养皿，以无菌药匙刮取PDA平板上生长的真菌菌丝于无菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用改良的CTAB法提取菌株MSC-f1的总DNA。

以纯化的DNA为模板，以真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增菌株MSC-f1的核糖体DNA内转录间隔区（ITS1-5.8S rDNA-ITS2），以通用引物Tub-T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）/ Tub-T22（5′-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3′）扩增菌株MSC-f1的β微管蛋白（β-tubulin）基因，以通用引物EF1-983F（5′-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3′）/ EF1-2218R（5′-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3′）扩增菌株MSC-f1的翻译延伸因子1-α（TEF1-α）基因。

PCR反应体系为：10 × Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，无菌水补足至总体积25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55~58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸10min。（具体操作参考：鹿连明等. 柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析.浙江大学学报, 2011, 37(2):125-132）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送交上海生工生物工程有限公司测序。

测序所得菌株MSC-f1的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列如SEQ ID NO:1所示，β-tubulin基因部分序列如SEQ ID NO:2所示，TEF1-α基因部分序列如SEQ ID NO:3所示。利用NCBI Blast进行比对分析发现，菌株MSC-f1的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列与GenBank中爪哇棒束孢菌（Isaria javanica）多个菌株对应基因序列（如KM234215、JN204422、MH532893等）的相似性达99.8%~100%；菌株MSC-f1的TEF1-α基因部分序列与GenBank中爪哇棒束孢菌（Isaria javanica）多个菌株对应基因序列（如KY587207、KT225600、KT225598等）的相似性最高也达100%；而其β-tubulin基因部分序列与GenBank中爪哇棒束孢（Isaria javanica）不同菌株对应基因序列（如KT225602、MN215882 、KT225605等）的相似性最高为99.41%，说明菌株MSC-f1的β-tubulin基因序列与已报道的菌株对应基因序列存在碱基差异。

根据以上关于菌株MSC-f1的形态特征、生物学特性及基因序列分析结果，结合相关文献（Cabanillas HE, et al. Isaria poprawskii sp. nov. (Hypocreales:Cordycipitaceae), a new entomopathogenic fungus from Texas affecting sweetpotato whitefly. Mycoscience, 2013, 54(2):158-169等）报道，最终将菌株MSC-f1鉴定为盘菌亚门（Pezizomycotina）粪菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocrellales）虫草科（Cordycipitaceae）棒束孢属（Isaria）的爪哇棒束孢（Isaria javanica）。

实施例3：菌株MSC-f1对柑橘害虫的致病性测定

将菌株MSC-f1接种到PDA固体培养基平板上，置于25℃恒温培养箱中培养10 d以上，将10 mL无菌水加入到PDA平板中洗脱培养后的菌株MSC-f1，洗脱产物经无菌纱布过滤除去菌丝，收集滤液制成分生孢子悬浮液。将分生孢子悬浮液用血球计数板在光学显微镜下计数确定孢子浓度后，以无菌水进行适当稀释，最终获得浓度为1.0×10⁸个孢子/mL的孢子悬浮液，并向其中加入终浓度为0.1vol%的吐温-80，备用。

对绣线菊蚜致病性测定：剪取新抽发的椪柑枝条，枝条总长约12 cm，下部老枝长3~5 cm，保留5~6片叶，将其插入到装有10 mL水培营养液的离心管中，离心管底部固定在边长大约8 cm的正方形珍珠棉上，在珍珠棉正下方铺一张白纸。将健康绣线菊蚜用毛笔挑取到准备好的椪柑枝条上，每个枝条50头。将30 mL上述制备的菌株MSC-f1孢子悬浮液装入小型无菌喷雾器中，对准枝条上的供试害虫均匀喷雾，同时以仅含0.1vol%吐温-80的无菌水喷雾处理绣线菊蚜为对照，均设5个重复。最后套上容积5 L的透明塑料瓶（该塑料瓶两端开口，一端罩有80目防虫纱网）后，放置于温度25 ℃、湿度90%以上的人工气候箱中培养。

对柑橘吹绵蚧致病性测定：田间剪取带有吹绵蚧的柑橘枝条若干，在枝条剪口处包裹用无菌水浸湿的棉球，然后将其放置于不同的保鲜盒中，每个保鲜盒中柑橘吹绵蚧数量不低于50头。将30 mL上述制备的菌株MSC-f1孢子悬浮液装入小型无菌喷雾器中，对准枝条上的供试害虫均匀喷雾，同时以仅含0.1vol%吐温-80的无菌水喷雾处理柑橘吹绵蚧为对照，均设5个重复。最后在各保鲜盒开口处罩上40目防虫网后，放置于温度25 ℃、湿度90%以上的人工气候箱中培养。

对柑橘全爪螨致病性测定：田间剪取叶片上带有柑橘全爪螨的柑橘枝条若干，枝条总长约12 cm，下部老枝长3~5 cm，保留5~6片叶，柑橘全爪螨数量不低于50头。将其插入到装有10 mL水培营养液的离心管中，离心管底部固定在边长大约8 cm的正方形珍珠棉上，在珍珠棉正下方铺一张白纸。将30 mL上述制备的菌株MSC-f1孢子悬浮液装入小型无菌喷雾器中，对准枝条上的供试害虫均匀喷雾，同时以仅含0.1vol%吐温-80的无菌水喷雾处理为对照，均设5个重复。最后套上容积5 L的透明塑料瓶（该塑料瓶两端开口，一端罩有80目防虫纱网）后，放置于温度25 ℃、湿度90%以上的人工气候箱中培养。

对柑橘木虱致病性测定：处理方法同绣线菊蚜致病性测定，不同之处在于将供试害虫替换为柑橘木虱。

培养后不同时间观察菌株MSC-f1分生孢子悬浮液对供试害虫的侵染和致死情况，于培养7 d后分别统计处理和对照各供试害虫的死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。

菌株MSC-f1分生孢子悬浮液对各柑橘害虫的防治效果如表3所示。从表中可以看出，菌株MSC-f1分生孢子悬浮液对柑橘害虫防治效果显著，以浓度为1.0×10⁸ 个孢子/mL的孢子悬浮液处理后7 d，供试4种柑橘害虫校正死亡率均达90%以上，其中绣线菊蚜和柑橘吹绵蚧死亡率可达100%。在体视显微镜下观察的爪哇棒束孢（Isaria javanica）菌株MSC-f1对绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨的侵染致病情况分别如图3A、图3B、图3C和图3D所示。

表3 菌株MSC-f1分生孢子悬浮液对柑橘害虫的防治效果

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<110> 浙江省柑橘研究所

<120> 一种防治柑橘害虫的爪哇棒束孢菌株及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 爪哇棒束孢（Isaria javanica）

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaacgagt 60

tttttcaact ccctaaccct ttgtgaacat acctatcgtt gcttcggcgg actcgccccg 120

gcgtccggac ggccctgcgc cgcccgcgac ccggacccag gcggccgccg gagacccaca 180

aattctgttt ctatcagtct ttctgaatcc gccgcaaggc aaaacaaatg aatcaaaact 240

ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta 300

atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagc 360

attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct cgacacccct tcgggggagt 420

cggcgttggg gaccggcagc ataccgccgg ccccgaaata cagtggcggc ccgtccgcgg 480

cgacctctgc gtagtactcc aacgcgcacc gggaacccga cgcggccacg ccgtaaaaca 540

cccaacttct gaacgttgac ctcggatcag gtaggactac ccgctgaact taagcatatc 600

aataatcgga gga 613

<210> 2

<211> 1358

<212> DNA

<213> 爪哇棒束孢（Isaria javanica）

<400> 2

ttcttgttga cccctcctcg acgcgttcct gagagcttgt gcagcccctg agtggtaccc 60

cgccgcgctc ccggcttgca ccagcacaaa cgctttcttc tcgagatgga gggcatccaa 120

gagctccgaa taccgtgaat tgttgctaac gacttgcgtc tttttgcgtc tgtaggttca 180

cctccaaacc ggtcagtgcg taagtagctt ccgaggtcct gcattgtggc aagtgtcggc 240

tctaacagtg tttgtttcga tagggtaacc aaattggtgc tgctttctgg caaaccatct 300

ctggcgagca cggcctcgac tccagcggtg tctacaatgg cacttctgag cttcagctcg 360

agcgcatgaa tgtctacttc aacgaggttt gctataccgg cacaacgcgt agcttggctt 420

cattgtggat actaaccgcg aatttcttca ggcctctggt aacaagtatg ttcctcgcgc 480

cgtcctcgtc gatcttgagc ccggtaccat ggacgctgtc cgtgccggtc ccttcggtca 540

gctcttccgc cccgacaact tcgttttcgg tcagtccggt gctggcaaca actgggccaa 600

gggtcactac actgagggtg cggagctcgt tgaccaggtc ctcgacgttg ttcgtcgcga 660

ggccgaaggc tgcgactgcc ttcagggttt ccagatcacc cactctctgg gtggtggtac 720

cggtgccggt atgggtactc tgctcatctc caagatccgc gaggagttcc ccgaccgcat 780

gatggccacc ttctccgttg tcccctcccc cggcaactcc gacaccgttg tcgagcccta 840

caacgccact ctctccgtcc accagctcgt tgagaactcc gacgagacct tctgtatcga 900

caaccaggcc ctttacgaca tctgcatgcg taccctgaag ctgtccaacc cctcgtacgg 960

tgacctgaac caccttgtct ccgtcgtcat gtccggcatc accacctgcc tgcgtttccc 1020

tggtcagctc aactctgacc ttcgcaagct cgccgtcaac atggttcctt tcccccgtct 1080

tcacttcttc atggtcggct ttgctcccct gaccagccgt ggtgctcact ccttccgcgc 1140

cgtctcggtt cctgagctca ctcagcagat gttcgacccc aagaacatga tggctgcttc 1200

tgacttccgt aacggtcgct acctgacctg ctctgccatt ttgtaagtgc accttgctag 1260

caccaattga cacacaacta acaacccatt agccgtggta aggttgccat gaaggaggtt 1320

gaggaccaga tgcgtaatgt gcagaacaag aactccac 1358

<210> 3

<211> 1017

<212> DNA

<213> 爪哇棒束孢（Isaria javanica）

<400> 3

ggccaccgtg atttcatcaa gaacatgatt actggtactt cccaggccga ttgcgctatt 60

ctcatcatcg ctgccggtac tggtgagttc gaggctggta tctccaagga tggccagacc 120

cgtgagcacg ctctgctcgc cttcaccctc ggtgtcaagc agctcatcgt tgccatcaac 180

aagatggaca ctgctcagtg ggccgaggct cgttaccagg aaatcatcaa ggagacttcc 240

aacttcatca agaaggtcgg ctacaacccc aagactgttg ccttcgtccc catctctggt 300

ttcaacggcg acaacatgct ggccccctcc accaactgcc cctggtacaa gggttgggag 360

aaggagacca aggccggcaa gtccaccggc aagaccctcc tcgaggctat tgacgccatc 420

gagcccccca agcgtcccct cgacaagccc ctccgtcttc ctcttcagga tgtctacaag 480

atcggtggta tcggaacggt gcccgtcggt cgtgtcgaga ctggtatcat caagcccggc 540

atggtcgtca cctttgctcc ttccaacgtc accactgaag tcaagtccgt cgagatgcac 600

cacgagcagc tgcccgaggg tgttcccggt gacaacgtcg gcttcaacgt gaagaacgtt 660

tccgtcaagg aaatccgtcg tggtaacgtc gctggtgact ccaagaacga ccctcccaac 720

ggtgctgcct ccttcaacgc ccaggtcatt gtcatcaacc accctggcca gatcggtaac 780

ggttacgccc ctgttcttga ctgccacact gcccacattg cttgcaagtt ctccgagctc 840

ctcgagaaga tcgaccgccg tactggtaag tcggttgaga acaaccccaa gttcatcaag 900

tctggtgact ccgccatcgt caagatggtt ccctccaagc ccatgtgcgt tgaggctttc 960

accgactacc cccctctggg ccgtttcgcc gtccgtgaca tgcgtcagac cgtcgcc 1017

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物ITS5

<400> 4

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物ITS4

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物Tub-T1

<400> 6

aacatgcgtg agattgtaag t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物Tub-T22

<400> 7

tctggatgtt gttgggaatc c 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物EF1-983F

<400> 8

gcyccygghc aycgtgaytt yat 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物EF1-2218R

<400> 9

atgacaccra crgcracrgt ytg 23

Claims (6)

1.一种爪哇棒束孢菌株，其特征在于：所述菌株分类命名为爪哇棒束孢（Isaria javanica）MSC-f1，已于2020年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19601。

2.如权力要求1所述的爪哇棒束孢菌株在防治柑橘害虫中的应用。

3.根据权利要求2所述的爪哇棒束孢菌株在防治柑橘害虫中的应用，其特征在于：所述柑橘害虫包括绣线菊蚜、柑橘吹绵蚧、柑橘木虱和柑橘全爪螨。

4.一种柑橘害虫的生防菌制剂，其特征在于：含有权利要求1所述的爪哇棒束孢MSC-f1的分生孢子。

5.根据权利要求4所述的生防菌制剂，其特征在于：所述生防菌制剂中爪哇棒束孢MSC-f1的分生孢子含量为1×10⁸个分生孢子/mL。

6.如权利要求4所述的生防菌制剂在防治柑橘害虫中的应用。

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