CN111662829B - 一株绿僵菌chma-005及其在防治茶尺蠖中的应用 - Google Patents

一株绿僵菌chma-005及其在防治茶尺蠖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株绿僵菌CHMA‑005及其在防治茶尺蠖中的应用，属于生物防治技术领域。本发明公开的绿僵菌CHMA‑005，培养简单、培养基上生长快、产孢量大、孢子萌发率高，对茶尺蠖幼虫的侵染致死效果可达80％以上，且对天敌相对安全，具代替部分茶尺蠖化学农药的潜力，可减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。

Description

一株绿僵菌CHMA-005及其在防治茶尺蠖中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，更具体的说是涉及一株绿僵菌CHMA-005及其在防治茶尺蠖中的应用。
背景技术
茶尺蠖(Ectropis obliqua hypulina Wehrli)俗名拱拱虫、量寸虫、吊丝虫，属鳞翅目(Lepidoptera)尺蠖蛾科(Geometridae)；是茶园中发生最普遍、为害最严重的害虫之一。茶尺蠖繁殖快，蔓延迅速，易爆发成灾，低龄幼虫咬食嫩叶边缘造成网状半透明膜斑，高龄幼虫咬食叶片引起缺刻；发生严重时，将茶树新梢、老叶吃成光秃，仅留秃枝，直接影响了茶叶的的产量、品质和经济价值。目前，该虫的防控偏重于使用化学农药，易造成“3R”问题和药害问题。
生物防治是一种利用有益生物控制有害生物的方法，具有安全、持久的特点，而虫生真菌挖掘利用已成为害虫生防的重要发展方向之一。目前，虽有一些生防菌株用于防控害虫，但由于种群和寄主来源的菌株具有一定的寄主专化性，对目标害虫的致病力也存在差异，有必要再探寻一些相对广谱的虫生真菌菌株用于防控茶尺蠖。
因此，提供一株绿僵菌CHMA-005及其在防治茶尺蠖中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株绿僵菌CHMA-005及其在防治茶尺蠖中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005，其保藏编号为CGMCCNo.19619。已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年04月09日，分类命名为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae。
进一步，所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005在防治茶尺蠖中的应用。
进一步，一种生物菌剂，以所述的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005作为活性成分，还包括菌剂制备中常用的载体和辅料。
进一步，所述的生物菌剂在防治茶尺蠖中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株绿僵菌CHMA-005及其在防治茶尺蠖中的应用，绿僵菌CHMA-005培养简单、培养基上生长快、产孢量大、孢子萌发率高，对茶尺蠖幼虫的侵染致死效果可达80％以上，且对天敌相对安全，具代替部分茶尺蠖化学农药的潜力，可减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明金龟子绿僵菌CHMA-005第10d菌落形态；
图2附图为本发明金龟子绿僵菌CHMA-005对茶尺蠖幼虫的侵染致死效果；
图3附图为本发明金龟子绿僵菌CHMA-005对茶尺蠖幼虫的侵染症状；
图4附图为本发明金龟子绿僵菌CHMA-005孢子粉剂对茶尺蠖幼虫的侵染致死效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005的分离和鉴定及其产孢量和孢子萌发率测定
(1)菌株分离：从福建福州北峰茶园的腐殖土中，采集自然罹病死亡的茶尺蠖幼虫。在超净工作台内，用无菌手术刀将虫体表面的孢子粉刮入10mL无菌水中，经脱脂纱布过滤得孢子原液，再取100μL孢子原液均匀涂布于PDA平板培养基上，后置于温度(28±1)℃、相对湿度(90±5)％、光周期L：D＝12：12的光照培养箱内培养10d。
(2)形态学鉴定：所分离菌株培养10d后，先观察菌落和分生孢子层的特性，后用生物显微镜观测菌株、分生孢子及分生孢子梗的形态特征。
结果发现，所分离菌株的菌落近圆形，培养5d时，菌落为淡黄色、圆形放射状生长、边缘为短绒状白色菌丝。培养10d时，菌落形态见图1，在菌落外半部产生黄绿色分生孢子层，呈环形堆积状向四周扩散，并形成皱褶。显微镜下进行观察，菌丝透明，宽1.6-2.1μm，具分支和分隔；分生孢子梗为圆柱状瓶梗，宽1.9-2.7μm，单生或聚集，从小梗基部形成念珠状或长链状排列的分生孢子，分生孢子单细胞，淡绿色，长椭圆形至短棒状，大小为(6.2-8.9μm×2.1-3.1μm)。通过形态学初步鉴定为绿僵菌(Metarhizium spp.)。
(3)分子生物学鉴定：采用基因序列分析。所分离菌株培养10d后，用无菌手术刀刮取绿僵菌菌粉0.1-0.2g于2mL离心管中，采用真菌基因组提取试剂盒提取菌体DNA。PCR扩增采用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4对菌株基因组DNA进行PCR扩增。
其中，ITS1/ITS4引物序列如下：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；SEQ ID NO.1；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；SEQ ID NO.2。
PCR反应体系(25μl)：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，模板DNA 2μL(100ng/μL)，10μmol/L引物各1μL，加ddH2O至总体积达25μL；对照用ddH2O代替模板DNA。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性35s、55℃退火55s、72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，送至上海生物有限公司测序。利用NCBIBlast对所测序列(SEQ ID NO.3)进行比对分析，下载GenBank中与之同源性较高的菌株的ITS序列，利用Clustal X软件对其进行多重比对，分析所分离菌株与参比菌株之间的序列相似性，得出所分离菌株为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。
(4)产孢量和孢子萌发率测定：所分离菌株接种到3皿PDA培养基平板上，置于温度(28±1)℃、相对湿度(90±5)％、光周期L：D＝12：12的HGZ-150型光照培养箱内培养10d，后加入5mL含0.05％吐温-80的无菌水脱溶孢子，经3层脱脂纱布过滤得3份孢子原液；用纽鲍尔血细胞计数板在NIKON E200型生物显微镜下统计每个培养基的产孢量；再将3份孢子原液稀释300倍，各取100μL稀释液分别均匀涂布于2％水琼脂培养基上，置于与菌株分离相同条件的光照培养箱内培养15h，后用400倍生物显微镜随机观察每个培养基5个视野，每个视野至少20个孢子，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发率，结果见表1。
表1绿僵菌CHMA-005的产孢量和孢子萌发率
Figure BDA0002577277400000041
实施例2金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005对茶尺蠖(Ectropisobliqua hypulina Wehrli)幼虫的侵染致死效果
取(实施例1)所分离菌株接种到PDA培养基平板上，置于温度(28±1)℃、相对湿度(90±5)％、光周期L：D＝12：12的HGZ-150型光照培养箱内培养10d，后加入5mL含0.05％吐温-80的无菌水脱溶孢子，经3层脱脂纱布过滤得孢子原液；用纽鲍尔血细胞计数板在NIKONE200型生物显微镜下统计孢子原液的孢子数并计算孢子浓度，再用无菌水将孢子原液稀释成1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107和1.00×108cfu/mL等5个浓度，以10％高效氯氟氰菊酯水乳剂1500倍液作药剂对照组，共6个处理，每个处理重复3次；取直径为12cm的塑料盘，在底部铺上直径为10cm的吸水棉，再盖上一层相同直径的滤纸片，加入10mL无菌水，放2-3片的茶嫩叶，用软毛笔向每个处理挑取供试茶尺蠖4龄幼虫15只，浸泡10s后挑到滤纸上，晾干2min后再挑到叶片上，保鲜膜封口；扎孔通气，后置于温度(28±1)℃的HGZ-150型光照培养箱内，每24h观察，记录死虫数，(死亡虫体长出菌丝计为有效感染，每次记录后挑除死亡虫体)，并及时更换茶嫩叶，10d后统计试虫的累计校正死亡率，结果见图2。
从图2可知，供试菌株5个处理浓度对茶尺蠖的毒力各不相同。随着浓度的提高，致死能力增强，其中1.00×108浓度处理的茶尺蠖幼虫的死亡率在第8d时达到100％；1.00×107和1.00×106浓度处理的茶尺蠖幼虫的死亡率在第10d时达到100％；而1.00×105和1.00×104浓度处理的茶尺蠖幼虫的死亡率在第10d时仅为83.33％和75％。绿僵菌CHMA-005处理组浓度达1.00×106cfu/mL以上时，致死率均高于10％高效氯氟氰菊酯对照组。可见，绿僵菌CHMA-005对茶尺蠖幼虫具良好的侵染致死效果，且相比10％高效氯氟氰菊酯具有绿色环保、毒力更高的优点。推荐使用1.00×106cfu/mL或更高的处理浓度。
其中，金龟子绿僵菌CHMA-005(浓度为1.00×108cfu/mL)对茶尺蠖幼虫的侵染症状见图3。
实施例3
以金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005为活性成分的生物菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将分离纯化到的金龟子绿僵菌CHMA-005菌株接种在PDA平板上，在28℃培养8天；
(2)收集在PDA平板上培养的成熟孢子，用0.05％(0.05g/100ml)吐温-80水溶液分散；
(3)配制成终浓度为1×108cfu/ml的孢子悬浮液，在预先进行空间灭菌的房间内，将10-12块灭菌海绵块(长度为4-6cm，宽度为2-4cm，高度为0.3-0.5cm)浸入孢子悬浮液，充分吸收后，将海绵块放入无菌培养皿(直径9cm)内，置于恒温培养箱内，28℃培养6天；
(4)待浸有孢子悬浮液的海绵块的表面长满绿僵菌分生孢子后，置于30℃烘箱中烘12-24h，至含水率≤10％；
(5)最后使用200目振动筛进行筛分，筛分时将振动筛的出料口封闭，待海绵块上的孢子粉筛分完后打开出料口，制得绿僵菌孢子粉剂，其技术指标为100亿孢子/g。
实施例4金龟子绿僵菌CHMA-005孢子粉剂对茶尺蠖(Ectropis obliqua hypulinaWehrli)幼虫的侵染致死效果
取100亿孢子/g(1.00×1010cfu/g)金龟子绿僵菌CHMA-005孢子粉剂、用无菌水将其稀释成1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107和1.00×108cfu/mL等5个浓度，以10％高效氯氟氰菊酯水乳剂1500倍液作药剂对照组，共6个处理，每个处理重复3次；取长为35cm、宽为24cm、高为12cm的塑料盒，在底部用茶嫩叶铺满，用软毛笔向每个处理挑取供试茶尺蠖4龄幼虫30只，每处理喷雾施用对应浓度药剂50ml后，用100目防虫网封口，用绳子扎紧；后置于温度(28±1)℃的HGZ-150型光照培养箱内，每24h观察，记录死虫数，(死亡虫体长出菌丝计为有效感染，每次记录后挑除死亡虫体)，并及时更换茶嫩叶，10d后统计试虫的累计校正死亡率，结果见图4。
从图4可知，供试菌株5个处理浓度对茶尺蠖的毒力各不相同。随着孢子粉剂稀释倍数的提高，致死能力减弱，当浓度为1.00×108和1.00×107时，茶尺蠖幼虫在第10d死亡率分别为100％和96.67％；而浓度为1.00×106和1.00×107时、第10d死亡率仅为80.00％和75.00％；1.00×104最低，第10d死亡率为63.33％。此外，10％高效氯氟氰菊酯对照组在10d内致死率曲线与绿僵菌CHMA-0051.00×107cfu/mL浓度处理组相差不大，且低于1.00×108浓度处理组。
相比实施例2，实际应用中绿僵菌CHMA-005孢子粉剂在同浓度的处理下致死率较低，可能是制剂后孢子活性降低。根据实验结果、实际应用时、推荐使用100-1000倍数进行稀释。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一株绿僵菌CHMA-005及其在防治茶尺蠖中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 527
<212> DNA
<213> Metarhizium anisopliae
<400> 3
gtggggagtc tactgattcg aggtcactat aaaaagttgg ggggttttac ggcagtggac 60
cgcgccgggc tcctgttgcg agtgctttac tactgcgcag aggagggcca cggcgagacc 120
gccaattaat ttaagggacg gctgtgctgg aaaaccagcc tcgccgatcc ccaacaccaa 180
gtccacaggg gacttgaggg gcgtaatgac gctcgaacag gcatgcccgc cagaatactg 240
acgggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacattact 300
tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt 360
ttgattcatt ttttttaacc actcagaaga tacttattaa aaaattcaga aggtttgggt 420
ccccggcggg cgcgaagtcc cgccgaagca acaattaaag gtatgattca caggggttgg 480
gagttggata actcggtaat gatccctccg caggttcacc tacggag 527

Claims (2)

1.金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CHMA-005在防治茶尺蠖中的应用，其特征在于，所述金龟子绿僵菌CHMA-005的保藏编号为CGMCC No.19619。
2.生物菌剂在防治茶尺蠖中的应用，其特征在于，以权利要求1所述的金龟子绿僵菌CHMA-005作为活性成分。
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