CN114134053A - 一株曲霉属子囊菌mr-86及其应用 - Google Patents

一株曲霉属子囊菌mr-86及其应用 Download PDF

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Abstract

一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR‑86及其应用，属于功能微生物筛选及应用领域，该菌株已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62083。该菌株MR‑86能明显抑制毁灭柱孢菌、械菌刺孢、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉，抗菌谱较广；其次生代谢产物能显著抑制木贼镰刀菌菌丝的生长和降低木贼镰刀菌孢子萌发率；菌株MR‑86在土壤中有良好的定殖能力；菌株MR‑86具有良好的防病效果；菌株MR‑86可作为拮抗剂和微生物制剂，对病原菌具有较好的拮抗能力。

Description

一株曲霉属子囊菌MR-86及其应用
技术领域
本发明属于功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86及其应用。
背景技术
防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schisck.为伞形科防风属植物，以未抽花茎植株的干燥根入药；味辛、微甘、性温，具有止痉、祛风解表、胜湿止痛的功效；主要分布在东北三省、河北、内蒙古等地。近年来，随着防风栽培面积增加，防风根腐病在栽培地区越来越严重，主要侵染防风的茎基部，发病后破坏维管束，导致叶片萎蔫、植株枯死，严重影响了防风的产量和质量。木贼镰刀菌是导致防风根腐病的重要病原菌，该菌为热带、亚热带地区常见病原菌，但由于气候变化影响，逐渐演变成致病力较强并能侵害多种寄主的病原菌。
目前，对植物病害的防治手段主要是使用化学农药，而防控根腐病的主要农药是代森锰锌、恶霉灵、多菌灵、甲基托布津等，使用这类农药进行化学防治，虽可以对病害进行有效的控制，但会形成抗药性，导致农药残留及生态失衡。由于生物防治可减少或抑制病害的发生，具有绿色安全、持续等特点，因此，如何筛选与使用生物菌剂是近年来研究的热点。
发明内容
为了解决现有采用化学农药防治植物病害所导致的生态平衡破坏、农药残留量增加、病原菌抗药性提高等问题，本发明旨在提供一株曲霉属子囊菌(Aspergillusmagaliesburgensis)MR-86及其应用，本发明所提供的菌株MR-86可有效解决植物抗药性、农药残留以及生态失衡等问题。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，该菌株已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62083。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在制备植物病原菌拮抗剂中的应用。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌拮抗剂为防风病原菌拮抗剂、人参病原菌拮抗剂、五味子病原菌拮抗剂、刺五加病原菌拮抗剂或细辛病原菌拮抗剂。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌包括：恶疫霉、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌、械菌刺孢、立枯丝核菌和灰葡萄孢。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在抑制木贼镰刀菌中的应用。
作为优选的实施方式，将所述一株曲霉属子囊菌(Aspergillusmagaliesburgensis)MR-86制备成菌株发酵液，能够抑制木贼镰刀菌菌丝生长和抑制木贼镰刀菌孢子萌发。
作为优选的实施方式，所述菌株发酵液的制备方法为：挑取菌株MR-86的单一菌饼接入含100mL PDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR-86无菌发酵液。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在制备微生物制剂中的应用。
作为优选的实施方式，所述微生物制剂用于防治植物病害。
作为优选的实施方式，所述微生物制剂用于防治防风根腐病、防风枯萎病和防风立枯病。
本发明的有益效果是：
本发明所筛选的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:62083。
本发明所筛选的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，是从健康防风的根际土壤中筛选而来，并经过培养特征鉴定、形态特征鉴定、分子生物学鉴定为Aspergillus magaliesburgensis。
本发明经过广谱抑菌试验证实，菌株MR-86能明显抑制毁灭柱孢菌、械菌刺孢、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉这8种供试病原菌，抑菌率为60％～90％，对毁灭柱孢菌与械菌刺孢的拮抗能力较强，抑菌率分别为84.44％与81.55％，而对立枯丝核菌与灰葡萄孢的抑菌率较低，抑菌率分别为40％和45.22％，由此表明菌株MR-86及其次生代谢产物具有广谱抑制常见植物病原菌的功能，抗菌谱较广。
本发明经过对木贼镰刀菌菌丝生长抑制试验证实，菌株MR-86的次生代谢产物能够显著抑制木贼镰刀菌菌丝的生长；经过对木贼镰刀菌孢子萌发影响试验证实，菌株MR-86可使木贼镰刀菌菌丝扭曲、畸形、局部膨大、内含物凝聚等异变，显著降低木贼镰刀菌孢子萌发率。
本发明经过菌株MR-86抗利福平筛选及在土壤内定殖试验证实，菌株MR-86在土壤中有良好的定殖能力；随后用盆栽法研究了菌株MR-86的田间盆栽防病效果；采用伤根灌溉法，以病情指数和防治效果为标准，田间盆栽防病实验表明菌株MR-86具有良好的防病效果，菌株MR-86处理防治效果65.41％与农药代森锰锌处理效果61.54％相当，明显强于菌剂枯草芽孢杆菌49.99％与哈茨木霉51.89％的防治效果。
本发明利用拮抗真菌筛选及鉴定方法获得的菌株MR-86，可以作为拮抗剂尤其是防风病原菌拮抗剂，对防风病原菌具有较好的拮抗能力，尤其是对恶疫霉、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱、械菌刺孢等病原菌，恶疫霉、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱、械菌刺孢等病原菌具有较强抑制作用。
本发明利用拮抗真菌筛选及鉴定方法获得的菌株MR-86，可作为生防菌源制备微生物制剂，能够防治由恶疫霉、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌、械菌刺孢等病原微生物引起的植物病害。
本发明能够为防风根腐病的生物防治提供理依据，为防风生物防治真菌的筛选提供新思路，为防风生防菌资源的深入研究和开发提供科学基础，为解决化学药品过量施用所导致的生态平衡破坏、农药残留量增加、病原菌抗药性提高等问题提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地解释本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中菌株MR-86分别在CYA、MEA、OA、DG18培养基中培养7d的形态特征。
图2为实施例1中菌株MR-86分生孢子头、顶囊、分生孢子的显微特征。图2中，a、b：分生孢子头；c：顶囊；d：分生孢子。
图3为实施例1中菌株MR-86基于ITS18建立的系统发育树。
图4为实施例2中菌株MR-86对不同病原菌的抑菌对峙图。图4中，a为菌株MR-86对峙灰葡萄孢的对峙图，b为菌株MR-86对峙鹅掌楸链格孢的对峙图，c为菌株MR-86对峙恶疫霉的对峙图，d为菌株MR-86对峙腐皮镰刀菌的对峙图，e为菌株MR-86对峙毁灭柱孢菌的对峙图，f为菌株MR-86对峙尖孢镰刀菌的对峙图，g为菌株MR-86对峙立枯丝核菌的对峙图，h为菌株MR-86对峙木贼镰刀菌的对峙图，i为菌株MR-86对峙细极链格孢的对峙图，j为菌株MR-86对峙械菌刺孢的对峙图。
图5为实施例3中菌株MR-86发酵液对木贼镰刀菌菌丝生长抑制作用。图5中，a：木贼镰刀菌在PDA培养基中生长7d，b：木贼镰刀菌在体积比为1:4的含药培养基中生长7d，c：木贼镰刀菌在PDA培养基中生长菌丝形态特征，d、e：木贼镰刀菌在MR-86含药培养基中生长菌丝状态。
图6为实施例4中菌株MR-86发酵液对木贼镰刀菌孢子萌发抑制作用。
具体实施方式
本发明所筛选的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:62083。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，其具体筛选方法如下：
(1)收集健康防风的根际土壤，风干后过20目筛；称取10g样品于含90mL无菌水和玻璃珠的250mL三角瓶中；充分振荡10～20min后取1mL上清液，加入9mL无菌水即得10倍稀释液，梯度稀释至10-3、10-4、10-5备用；分别吸取不同梯度溶液100～200μL稀释液涂布于含PDA培养基的平板中，每个处理3个重复；20～30℃倒置暗培养数天挑选表型差异的单菌落并传代3次，划线于PDA培养基进行纯化培养，分离出纯菌落，于4℃保藏。
(2)将供试病原菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusariumequiseti、腐皮镰刀菌Fusarium solani、细极链格孢Alternaria tenuissima、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、恶疫霉Phytophthora cactorum)置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取病原菌菌丝体分别接种于含PDA培养基的平板中央，25℃倒置培养5～7天。
(3)采用平板对峙法对分离纯化的根际土壤真菌进行抑菌活性测定，具体为：以供试木贼镰刀菌作为标靶菌，用打孔器取直径为8mm的木贼镰刀菌菌饼并接种至直径90mm的含PDA培养基的平板中央，同时将2片直径为8mm的上一步得到的菌株菌饼粘于距平板中心20～30mm处的2个对称点上，以单接种供试病原菌为对照，25℃培养7d，每个处理重复3次，测试抑菌率。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在制备植物病原菌拮抗剂中的应用。
优选的，所述植物病原菌拮抗剂为防风病原菌拮抗剂、人参病原菌拮抗剂、五味子病原菌拮抗剂、刺五加病原菌拮抗剂或细辛病原菌拮抗剂。
优选的，所述植物病原菌包括：恶疫霉、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌、械菌刺孢、立枯丝核菌和灰葡萄孢。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在抑制木贼镰刀菌中的应用。
优选的，将所述一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86制备成菌株发酵液，能够抑制木贼镰刀菌菌丝生长和抑制木贼镰刀菌孢子萌发。
更优选的，所述菌株发酵液的制备方法为：挑取菌株MR-86的单一菌饼接入含100mL PDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR-86无菌发酵液。
本发明的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在制备微生物制剂中的应用。
优选的，所述微生物制剂用于防治植物病害。
优选的，所述微生物制剂用于防治防风根腐病、防风枯萎病和防风立枯病。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料
防风根际土壤：采自于吉林农业大学药用植物园种植基地。
供试病原菌：尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、腐皮镰刀菌Fusarium solani、细极链格孢Alternaria tenuissima、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、恶疫霉Phytophthora cactorum，由吉林农业大学中药材学院植物生理生态实验室提供。
各培养基配方如表1所示：
表1
Figure BDA0003428473580000061
Figure BDA0003428473580000071
试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0：购自于长春海灵科贸有限公司。
实施例1菌株MR-86的筛选、鉴定和保藏
一、筛选
(1)收集健康防风的根际土壤，风干后过20目筛；称取10g样品于含90mL无菌水和玻璃珠的250mL三角瓶中；充分振荡20min后取1mL上清液，加入9mL无菌水即得10倍稀释液，梯度稀释至10-3、10-4、10-5备用；分别吸取不同梯度溶液200μL稀释液涂布于含PDA培养基的平板中，每个处理3个重复；25℃倒置暗培养7天挑选表型差异的单菌落并传代3次，划线于PDA培养基进行纯化培养，分离出纯菌落，于4℃保藏。
(2)将供试病原菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusariumequiseti、腐皮镰刀菌Fusarium solani、细极链格孢Alternaria tenuissima、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、恶疫霉Phytophthora cactorum)置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取病原菌菌丝体分别接种于含PDA培养基的平板中央，28℃倒置培养7天。
(3)采用平板对峙法培养法对上一步得到的菌株进行筛选，筛选出具有抑菌活性的真菌。首先用打孔器取直径为8mm的木贼镰刀菌菌饼并接种至直径90mm的含PDA培养基的平板中央，同时将2片直径为8mm的上一步得到的菌株菌饼粘于距平板中心20mm处的2个对称点上，以单接种供试病原菌为对照，25℃培养7d，每个处理重复3次，测试抑菌率。抑菌率计算公式为：(RC-RP)/RC*100％，RC为对照趋势半径，RP为处理趋势半径。
通过分析，筛选出共8株菌株，分别命名为MR-16、MR-34、MR-43、MR-47、MR-57、MR-68、MR-86和MR-97，抑菌率均达到55％以上，各菌株抑菌率如表2所示；其中MR-86抑菌效果最好，抑菌率约为73％。
表2
菌株 抑菌率
MR-3 66.67±1.92c
MR-24 61.85±0.64d
MR-34 56.67±1.11e
MR-60 67.04±0.64bc
MR-82 65.93±2.57c
MR-85 60.37±0.64d
MR-86 73±1.75a
MR-93 70±2.94b
二、鉴定
鉴定方法包括培养特征鉴定、形态特征鉴定、分子鉴定，具体如下：
(1)MR-86的培养特征鉴定：选用CYA、MEA、OA、DG184种培养基于25℃培养，7天后测量菌落直径，描述曲霉菌包括菌落质地、菌丝的丰富度、纹理和色彩，可溶性色素的存在和颜色及渗出液等，菌落颜色通过与国际社会颜色委员会(ISCC)和国家标准局(NBS)颜色名称图表进行比较进行确定。
MR-86的培养特征鉴定结果如图1所示：菌落在CYA上培养，直径为75-80mm，菌落中部为白色，棉絮状，菌核初步形成，菌丝为白色，含有少量黄色气生菌丝，无孢子形成，无渗出液，无可溶性色素，菌落背面为深桔黄色、亮桔黄色形成放射状皱纹；菌落在MEA上培养，直径为75-85mm，菌丝絮状，菌落中部隆起，少量菌核初步形成，无孢子形成，无渗出液，无可溶性色素，正面少量深黄色气生菌丝形成，背面为亮橘黄色；菌落在OA上培养，直径为55-60mm，菌丝平铺，程粘结状，菌丝稀疏，形成大量分生孢子，菌落白色，无渗出液，无可溶性色素，菌落背面为白色；菌落在DG18上培养，直径为75-80mm，菌落中部白色絮状，渐变为淡黄色绒状，菌落背面鲜黄色、浅黄色，形成放射状皱纹。
(2)MR-86的形态特征鉴定：用ZEISS sigma300场发射扫描电子显微镜观察MR-86菌丝、分生孢子、菌核等显微形态特征。
MR-86的显微特征鉴定结果如图2所示：分生孢子头幼时多呈辐射状，老时疏松或裂成疏松的圆柱状结构；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎400-1200×8-14μm；顶囊球形或近球形，分生孢子椭圆形、光滑，直径为2-4×1.5-3.5μm；菌核初时白色，老熟时黑色。
(3)MR-86的分子鉴定：将MR-86在PDA培养基培养数天后，用试剂盒TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0进行真菌菌丝DNA提取，使用ITS序列对真菌进行种、属水平鉴定，引物为ITS1、ITS4(ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR扩增反应体系为：Master Mix 12.5μL、ITS11μL、ITS41μL、rDNA 2μL、ddH2O 8.5μL，扩增程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；扩增的PCR产物交由上海生工进行测序；所获得基因序列提交至GenBank，采用MEGA-5软件Neighb or-Joining法进行建立系统发育树。
MR-86的分子鉴定结果：菌株MR-86 ITS rDNA基因PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行ITS测序，获得599bp大小的序列(SEQ ID NO.1)；在NCBI上进行检索，结果发现，与现有序列MK450649.1比较，相似度为99.43％，并采用MEGA-5软件Neighbor-Joining法进行建立系统发育树，如图3所示。菌株MR-86与MK450649.1Aspergillus magaliesburgensis聚为同一支，结合形态与显微鉴定以及18SDNA，鉴定为Aspergillus magaliesburgensis(Aspergillus magaliesburgensis是曲霉属中的一种子囊菌)，获得登录号为OK287151.1，为中国新纪录种。
三、保藏
本发明所筛选的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:62083。
实施例2菌株MR-86的广谱抑菌试验
以尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、毁灭柱孢菌、械菌刺孢、鹅掌楸链格孢、立枯丝核菌、灰葡萄孢、恶疫霉这10种供试病原菌为标靶菌，运用平板对峙法对菌株MR-86进行抗菌谱试验。具体如下：
通过培养皿内对峙培养法，用打孔器取直径为8mm的供试病原菌菌饼(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、腐皮镰刀菌Fusarium solani、细极链格孢Alternaria tenuissima、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、恶疫霉Phytophthora cactorum)并接种至直径90mm的含有PDA培养基的平板中央，同时将2片直径为8mm的菌株MR-86菌饼粘于距平板中心30mm处的2个对称点上，以单接种供试病原菌为对照，25℃培养7d，每个处理重复3次，结果如图4所示(图4中，a为菌株MR-86对峙灰葡萄孢的对峙图，b为菌株MR-86对峙鹅掌楸链格孢的对峙图，c为菌株MR-86对峙恶疫霉的对峙图，d为菌株MR-86对峙腐皮镰刀菌的对峙图，e为菌株MR-86对峙毁灭柱孢菌的对峙图，f为菌株MR-86对峙尖孢镰刀菌的对峙图，g为菌株MR-86对峙立枯丝核菌的对峙图，h为菌株MR-86对峙木贼镰刀菌的对峙图，i为菌株MR-86对峙细极链格孢的对峙图，j为菌株MR-86对峙械菌刺孢的对峙图)，挑取拮抗交界处菌丝，显微观察与供试病原菌相互作用后菌落边缘的菌丝形态特征，检测菌株MR-86对不同供试病原菌的抑制作用。
结果显示，菌株MR-86能明显抑制毁灭柱孢菌、械菌刺孢、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉这8种供试病原菌，抑菌率为60％～90％，具体为：对恶疫霉的抑制率为66.33％，对尖孢镰刀菌的抑制率为72.66％、对木贼镰刀菌的抑制率为73％、对腐皮镰刀菌的抑制率为74.44％、对细极链格孢的抑制率为77.11％、对鹅掌楸链格孢的抑制率为75.22％、对毁灭柱的抑制率为84.44％、对械菌刺孢的抑制率为81.55％；其中，对毁灭柱孢菌与械菌刺孢的拮抗能力较强，抑菌率分别为84.44％与81.55％，而对立枯丝核菌与灰葡萄孢的抑菌率较低，抑菌率分别为40％和45.22％，由此表明菌株MR-86的抗菌谱较广。
表3菌株MR-86对10种供试病原菌的抑菌率
病原真菌 抑菌率
恶疫霉 66.33±1.13f
尖孢镰刀菌 72.66±1.19e
木贼镰刀菌 73±1.75de
腐皮镰刀菌 74.44±0.64d
细极链格孢 77.11±0.21c
鹅掌楸链格孢 75.22±0.56d
毁灭柱孢菌 84.44±0a
械菌刺孢 81.55±0.21b
立枯丝核菌 40±0.64h
灰葡萄孢 45.22±0.56g
实施例3菌株MR-86发酵液对木贼镰刀菌菌丝生长抑制试验
(1)供试病原菌活化及菌株MR-86发酵液的制备
将木贼镰刀菌置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取木贼镰刀菌菌丝体分别接种于含有PDA培养基的平板中央，25℃倒置培养，待菌株长满平板，取菌丝体传代培养至第4代备用。
挑取菌株MR-86的单一菌落接入含100mLPDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR-86无菌发酵液。
(2)将菌株MR-86发酵液与PDA培养基按照1:4(体积比)比例混合配置成含药培养基，在含药培养基中心接入木贼镰刀菌菌饼(d＝8mm)，以正常PDA培养基为对照，计算抑菌率；并在光学显微镜下观察菌丝形态。
(3)抑菌率计算公式为：(Ac-Af)/Ac×100，Ac为供试病原菌在PDA培养基中生长菌落直径，Af为供试病原菌在含有菌株MR-86发酵液的含药培养基中生长菌落直径。
(4)结果表明：如图5所示，菌株MR-86发酵液对木贼镰刀菌的抑菌率为28％，挑取菌丝后经显微观察到，木贼镰刀菌菌丝扭曲、畸形变粗、粗细不均、内含物凝聚，颜色变深；由此表明菌株MR-86可能产生次生代谢产物抑制了木贼镰刀菌的生长。
实施例4菌株MR-86发酵液对木贼镰刀菌孢子萌发影响试验
(1)供试病原菌活化及菌株MR-86发酵液的制备
将木贼镰刀菌置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取木贼镰刀菌菌丝体分别接种于含有PDA培养基的平板中央，28℃倒置培养，待菌株长满平板，取菌丝体传代培养至第4代备用。
挑取菌株MR-86的单一菌落接入含100mLPDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR-86无菌发酵液。
(2)用无菌水将木贼镰刀菌分生孢子配置成1×106CFU/ml，然后将木贼镰刀菌孢子悬浮液与菌株MR-86发酵液以1:1(体积比)比例混匀，将木贼镰刀菌孢子悬浮液与PDB培养基以1:1(体积比)比例混匀作为对照，25℃培养，以芽管长度超过分生孢子直径的一半作为萌发的标准，处理6h、12h、24h和48h后在载玻片上镜检木贼镰刀菌孢子萌发情况。
(3)用显微镜观察菌株MR-86无菌发酵液处理后木贼镰刀菌孢子萌发情况，结果显示，菌株MR-86在第6h对木贼镰刀菌孢子萌发的抑制率最高为94.2％，48h后孢子萌发抑制率为84.46％，如图6所示。
实施例5菌株MR-86抗利福平筛选及在土壤内定殖试验
(1)对菌株MR-86进行利福平抗性诱变，将菌株MR-86依次在含有浓度为50、100、200、300μg/ml的利福平PDB培养基中培养，逐步进行利福平的抗性诱变，获得菌株MRRif-86；比较菌株MR-86与菌株MRRif-86对尖孢镰刀菌与木贼镰刀菌的抑菌活性；向300g土中接种浓度为5×107CFU/ml的菌株MRRif-86孢子悬液30ml，均匀拌土，置于室内，每隔7d取一次土样，3次平行，每次平行取土样10g；取5次土样，取5g土样加入45ml无菌生理盐水，混匀后静置；用梯度稀释法稀释3次，取最后1次稀释液200μL涂布于含有300μg/ml利福平的PDA平板中，置于25℃恒温培养箱中3d，统计和记录菌落数量。
(2)菌株MRRif-86接种10代后可稳定生长于含利福平300μL/mg的PDA平板上，且较菌株MR-86的形态无明显变化，表明菌株MR-86具有遗传稳定性；将菌株MRRif-86与木贼镰刀菌对峙7d后，抑菌率68.22％；与菌株MR-86与木贼镰刀菌对峙7d抑菌率73％相比差异不明显，说明利福平标记对菌株的抑菌能力无显著影响；菌株MR-86定殖在土壤中后，土壤含菌量呈现先下降后上升并最终平缓下降的趋势，且在第14天达到最大含菌量为3.9×106CFU/ml，35d后土壤含菌量依然可以达到2.6×106CFU/ml，说明菌株MR-86在土壤中具有良好的定殖效果，可将其用于盆栽防病实验，结果见表4。
表4菌株MR-86在土壤中的定殖能力
Figure BDA0003428473580000131
实施例6菌株MR-86对防风根腐病的室外防效及其对防风的促生作用
(1)取长势一致的1年生防风植株进行盆栽实验，每处理7盆；配置孢子悬液木贼镰刀菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、菌株MR-86均为1×107CFU/ml，农药代森锰锌为800倍液；盆栽实验共设置五种处理：A组对照为单接种木贼镰刀菌、B组为接种木贼镰刀菌与哈茨木霉、C组为接种木贼镰刀菌与枯草芽孢杆菌、D组为接种木贼镰刀菌并喷施农药代森锰锌、E组为接种木贼镰刀菌与菌株MR-86；取长势一致的1年生防风，采用伤根灌溉法，对根茎部位划伤处理接种木贼镰刀菌孢子悬液10ml，然后分别接种MR-86孢子悬液10ml、代森锰锌50ml、枯草芽孢杆菌50ml、哈茨木霉50ml；进行常规管理，30d后进行统计发病程度以及防风的株高、根长、根鲜重、全株鲜重、根干重、全株干重等生物量指标，并计算发病指数与防效。
2)防风根腐病发病分为等级9级；0级：健株，无病斑；1级：全株10％以下的叶片发病；3级：全株11～25％的叶片发病；5级：全株26～50％的叶片发病；7级：全株51～75％的叶片发病；9级：全株76％以上的叶片发病。
3)病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100；
防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100。
4)菌株MR-86对防风根腐病的防治效果：由表5可知，菌株MR-86表现了较为理想的防病效果，防效可达65.41％。
田间盆栽防病实验表明，菌株MR-86具有良好的防病效果(表5)。病情指数为22.18，显著低于木贼镰刀菌；菌株MR-86处理防治效果65.41％与农药代森锰锌处理效果61.54％相当，明显强于菌剂枯草芽孢杆菌49.99％与哈茨木霉51.89％的防治效果。
表5不同处理对防风根腐病盆栽防治效果
病情指数 防效
木贼镰刀菌 64.14±2.18a
哈茨木霉+木贼镰刀菌 30.85±4.29bc 51.89±6.7b
枯草芽孢杆菌+木贼镰刀菌 32.07±5.66b 49.99±8.82b
代森锰锌+木贼镰刀菌 24.66±2.11cd 61.54±3.3ab
菌株MR-86+木贼镰刀菌 22.18±3.72d 65.41±5.8a
菌株MR-86处理对防风株长、株鲜重、根鲜重、株干重、根干重具有明显差异(表6)，MR-86处理防风株高达到59.66cm，显著高于其他处理组；根鲜重和根干重达到8.35g和1.63g，显著高于其他处理组；株鲜重和株干重生物量分别达到25.58和5.54g，显著高于其他处理组；但是对防风根长生长差异不明显。
表6不同处理对防风盆栽促生效果
株长cm 根长cm 株鲜重g 根鲜重g 株干重g 根干重g
木贼镰刀菌 52.01±7.89b 29.88±4.75a 9.5±5.31b 2.66±1.22b 2.41±0.78b 0.56±0.07b
代森锰锌 53.54±2.21b 29.36±1.72a 10.81±2.84b 3.39±0.34b 2.48±0.57b 0.73±0.24b
哈茨木霉 53.9±0.49b 29.03±0.49a 11.97±4.56b 3.58±1.01b 3.18±0.14b 0.86±0.09b
枯草芽孢杆菌 56.64±1.6ab 30.34±0.24a 10.44±0.79b 3.43±0.42b 2.56±0.72b 0.71±0.36b
菌株MR-86 59.66±0.46a 31.38±2.02a 25.58±0.27a 8.35±1.52a 5.54±0.02a 1.63±0.36a
实施例7菌株MR-86对人参病原菌的抑菌试验
试验过程参考实施例2。利用菌株MR-86分别对人参锈腐病病原菌毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、人参疫病病原菌恶疫霉(Phytophthora cactorum)进行抑菌试验，结果显示：人参锈腐病病原菌毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)抑菌率84.44％；人参疫病病原菌恶疫霉(Phytophthora cactorum)抑菌率66.33％。
实施例8菌株MR-86对五味子病原菌的抑菌试验
试验过程参考实施例2。利用菌株MR-86分别对五味子黑斑病病原菌鹅掌楸链格孢(Alternaria liriodendra)、五味子茎基腐病病原菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、五味子叶枯病病原菌细极链格孢(Alternaria tenuissima)进行抑菌试验，结果显示：五味子黑斑病病原菌鹅掌楸链格孢(Alternaria liriodendra)抑菌率75.22％；五味子茎基腐病病原菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)抑菌率74.44％；五味子叶枯病病原菌细极链格孢(Alternaria tenuissima)抑菌率77.11％。
实施例9菌株MR-86对刺五加病原菌的抑菌试验
试验过程参考实施例2。利用菌株MR-86对刺五加黑斑病病原菌细极链格孢(Alternaria tenuissima)进行抑菌试验，结果显示：刺五加黑斑病病原菌细极链格孢(Alternaria tenuissima)抑菌率77.11％。
实施例10菌株MR-86对细辛病原菌的抑菌试验
试验过程参考实施例2。利用菌株MR-86对细辛叶枯病病原菌械菌刺孢(Mycocentrospora acerina)进行抑菌试验，结果显示：细辛叶枯病病原菌械菌刺孢(Mycocentrospora acerina)抑菌率81.55％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 一株曲霉属子囊菌MR-86及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 599
<212> DNA
<213> 人工(The purpose gene)
<400> 1
cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttaccgagtg tagggttccc tcgtggagcc 60
cacctcccac ccgtgtatac tgtaccttcg ttgcttcggc gggcccgccg tcatggccgc 120
cggggggctt ctgcccccgg gcccgcgccc gccggagaca catgaactct gtctgatcta 180
gtgaagtctg agttgattgt cacacaatca gttaaaactt tcaacaatgg atctcttggt 240
tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataactaa tgtgaattgc agaattccgt 300
gaatcatcga gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc 360
cgagcgtcat tgctgcccat caagcacggc ttgtgtgttg ggtcctcgtc ccccccgggg 420
gacgtgcccg aaaggcagcg gcggcaccgc gtccggtcct cgagcgtatg gggctttgtc 480
acccgctctg caggcccggc cggcgctggc cgacgcgaaa gcaaccattt tttctccagg 540
ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggagaga 599

Claims (10)

1.一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86，其特征在于，该菌株已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62083。
2.如权利要求1所述的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在制备植物病原菌拮抗剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌拮抗剂为防风病原菌拮抗剂、人参病原菌拮抗剂、五味子病原菌拮抗剂、刺五加病原菌拮抗剂或细辛病原菌拮抗剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括：恶疫霉、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、细极链格孢、鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌、械菌刺孢、立枯丝核菌和灰葡萄孢。
5.如权利要求1所述的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在抑制木贼镰刀菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述一株曲霉属子囊菌(Aspergillusmagaliesburgensis)MR-86制备成菌株发酵液，能够抑制木贼镰刀菌菌丝生长和抑制木贼镰刀菌孢子萌发。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述菌株发酵液的制备方法为：挑取菌株MR-86的单一菌饼接入含100mL PDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR-86无菌发酵液。
8.如权利要求1所述的一株曲霉属子囊菌(Aspergillus magaliesburgensis)MR-86在制备微生物制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂用于防治植物病害。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂用于防治防风根腐病、防风枯萎病和防风立枯病。
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