CN109810907B

CN109810907B - 一株对柳杉毛虫末龄幼虫有强致病力的球孢白僵菌BbJL-01

Info

Publication number: CN109810907B
Application number: CN201910204261.8A
Authority: CN
Inventors: 韩小红; 梁光红; 林浩宇; 卢赐鼎; 周友军
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109810907A

Abstract

本发明提供了一种对柳杉毛虫末龄幼虫有较高致病力的球孢白僵菌Beauveria bassiana（BbJL‑01）的培养方法以及相关应用。此菌株培养方法简单，产孢量大，对柳杉毛虫末龄幼虫的致病力强，且为生物防治方法，较化学药剂相比，更加环保，同时该菌株可以重复利用，可降低成本，易于推广。

Description

一株对柳杉毛虫末龄幼虫有强致病力的球孢白僵菌BbJL-01

技术领域

本发明属于农业生物技术，具体涉及一株对柳杉毛虫末龄幼虫有强致病力的球孢白僵菌BbJL-01。

背景技术

柳杉毛虫（Dendrolimus houi Lajonquiere），又名云南松毛虫，属鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasiocampidae）。该虫是一种分布广、适应性强的食叶害虫，可危害柳杉、云南松等多种寄主。其幼虫共7个龄级，危害时间较长。在该虫爆发地区常常使柳杉等针叶树成片受害，轻者针叶和嫩梢被食，导致枝叶残缺影响其正常生长发育；重者蚕食枝叶，导致连片枯死、林分凋亡，对针叶树种的生长造成了不可忽视的影响；此外，其幼虫和茧上着生的毒毛亦会对人体产生伤害。

以往对柳杉毛虫的防治主要集中为化学药剂的使用，起到了一定作用，但随着化学药剂的频繁使用，害虫的抗药性逐步增强，这增加了害虫防治的成本，同时不利于环境保护。近年来，人们开始使用微生物或天敌等生物防治方法对其进行防治，取得了一定效果。其中白僵菌作为一种农林害虫防治的重要致病真菌，由于对人畜及农林作物无害，易传播，成本较低等特点，被广泛应用于害虫的生物防治中。

已有研究表明，不同地理种群或不同株系的球孢白僵菌对害虫的毒力存在较大的差异，即使同一株系的球孢白僵菌对不同种类害虫的毒力也不相同，因此在应用真菌进行生物防治的过程中针对不同种类的害虫经常要筛选高毒力菌株。另一方面目前白僵菌对害虫的防治使用情况主要针对的是初龄及中龄幼虫，对于末龄幼虫的防治较少，主要是由于末龄幼虫的抵抗力较强，没有合适的生物制剂对其防治，或者防治效果不佳，但末龄幼虫的危害更为严重。在柳杉毛虫末龄幼虫中的防治情况还未见相关报道，本发明使用多种分离得到的菌株对柳杉毛虫末龄（7龄）幼虫进行毒力测定，筛选出对7龄幼虫致病效果较好的菌株。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供了一株对柳杉毛虫末龄幼虫有强致病力的球孢白僵菌菌株BbJL-01，其培养方法简单，生长速度较快，产孢量大，可广泛应用于柳杉毛虫末龄幼虫的防治。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbJL-01，于2019年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：17182；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为中国，北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述的球孢白僵菌BbJL-01的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

球孢白僵菌BbJL-01的分离培养方法，具体包括以下步骤：

（1）采集感染白僵菌的虫尸；

（2）分离白僵菌菌株：将林间收集的僵虫表面消毒后切成约0.5 cm小块置于PDA培养基中央，25℃恒温培养；将分离得到的菌株采用分生孢子单菌落分离获得纯培养菌株，以PDA斜面培养基4℃保存备用；

（3）形态鉴定：将上述纯化培养菌株接于PDA培养基上培养，7d后观察菌落形态特征；采用玻片培养法，记录其菌丝隔膜、孢子形态和大小、产孢梗形状等形态特征；

（4）分子鉴定：将白僵菌进行ITS序列测序；

（5）菌株产孢量测定：用点滴法将不同菌株接种于PDA平板中央，置于25℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复，共观察15 d，比较不同菌株的菌落生长速度，同时记录开始产孢的时间，待产孢结束后，用直径1 cm的打孔器在固体平板培养基中央至边缘1/2处打孔取样，在菌落上打取菌饼，置于定量的0.1%吐温-80无菌水的离心管中，使用涡旋振荡仪进行振荡混匀，制成孢悬液，利用血球计数板对孢悬液计数测量，测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量，每个平板随机打三个孔，各设三个平板作为重复。

进一步地，将所述的球孢白僵菌BbJL-01应用于在防治柳杉毛虫末龄幼虫中。

具体包括以下步骤：

（1）将分离获得的白僵菌菌株分别转至PDA培养基上，于25℃恒温产孢培养；

（2）10d后收集孢子，从各菌株平板上刮取一定量孢子，置于灭菌的0.1%吐温-80无菌水中，配制1.0 ×10⁷个/mL的孢子悬液，以0.1%吐温-80无菌水作对照；

（3）将野外采集的柳杉毛虫7龄幼虫在配制好的孢子悬液中浸渍10s，用滤纸吸去多余水分，然后将虫放入装有柳杉枝条的广口瓶中，以纱布封口，置于培养箱中饲养；每处理15头幼虫，3次重复；接种72 h后每天统计死亡虫数；

（4）通过筛选得到毒力较强的白僵菌菌株，死亡的僵虫置于无菌培养皿内25℃保湿培养，观察虫体上菌丝生长情况，以区分白僵菌致死和非白僵菌致死；以死亡后虫体表面产生白色菌丝记为被白僵菌感染有效致死，观察菌丝生长及产孢情况，统计死亡率，致死中时。

步骤（3）所述培养箱饲养条件为温度25 ℃，湿度90%，L:D=14 h:10 h。

本发明的优点在于：本发明白僵菌菌株的分离纯化培养与对柳杉毛虫末龄幼虫的防治方法，其各项综合指标良好，可以有效的进行柳杉毛虫末龄幼虫的防治，同时，菌株来源于天然感染的虫体，经分离培养后用于害虫的防治，是一种无污染、环保的防治方法。可广泛应用于柳杉毛虫的生物防治。

附图说明

图1白僵菌菌株BbJL-01在PDA培养基上培养10d的菌落形态图。

图2本发明BbJL-01菌株分子鉴定的NJ系统发育进化树图。

图3正常状态下的柳杉毛虫末龄幼虫图。

图4柳杉毛虫末龄幼虫感染白僵菌BbJL-01菌株后的感染症状图。

图5白僵菌BbJL-01菌株对柳杉毛虫蛹的亚致死感染图。

图6分离的白僵菌菌株对柳杉毛虫7龄幼虫20天的累积死亡率和致死中时。

具体实施方式

为了使本发明的目的更加清楚明白，下面结合附图以及具体实施例对本发明进行详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 病原真菌的分离与鉴定

1、供试菌株

本试验所用菌株来源于被白僵菌感染的天然虫体上，将分离纯化后的菌株接种于斜面培养基上保存于福建农林大学生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室内，样品信息见表1。

表1 样品信息

2、不同菌株生长速度及产孢量测定

用点滴法将不同菌株接种于PDA平板中央，置于25℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复，共观察15 d，比较不同菌株的菌落生长速度。同时记录开始产孢的时间，待产孢结束后，用直径1 cm的打孔器在固体平板培养基中央至边缘1/2处打孔取样，在菌落上打取菌饼，置于定量的0.1%吐温-80无菌水的离心管中，使用涡旋振荡仪进行振荡混匀，制成孢悬液，利用血球计数板对孢悬液计数测量，测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量，每个平板随机打三个孔，各设三个平板作为重复。

3、菌株鉴定

（1）形态学鉴定

将上述纯化培养菌株接于PDA培养基上培养，7d后观察菌落形态特征。使用显微镜进行观察记录，培养10d后白僵菌菌株BbJL-01在PDA培养基上的菌落形态图见图1。

（2）分子生物学鉴定

将培养好的菌株，进行分子生物学的鉴定，提取其DNA按TSP101试剂盒提取，使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增体系使用真菌通用引物ITS1和ITS4：

ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3；

ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3；

引物由福州擎科公司进行合成。其PCR扩增体系为：Taq PCR Master Mix 15uL，模板DNA1uL，ITS1和ITS4各1uL，ddH₂O 补至25uL。PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10 s，55℃退火15 s，延伸72℃ 15 s，35 个循环；72℃ 延伸5 min，反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳检测后确认为白僵菌样品ITS区域的PCR扩增产物样品，送往擎科公司进行序列测定。测序结果与NCBI数据库进行比对。

（3）菌株生长情况与产孢量

14株菌株总体菌落接近圆形，边缘均很整齐，具有同心纹。菌株1-3主要为白色，茸毛状；菌株4-14主要为乳白色，薄粉状。菌株3、4、5、12、13较其他菌株生长较快，菌株12开始产孢的时间最早，在分离后第4-5d开始产孢，且较其他菌株其孢子层更加紧密均匀。14株菌株总体产孢量的范围在（2.25±0.16~4.98±0.17）×10⁸个/cm²孢子之间，其中12号菌株产孢量最大。

4、鉴定结果

（1）形态学鉴定

14株菌株总体菌落接近圆形，边缘均很整齐，具有同心纹。菌株1-3主要为白色，茸毛状；菌株4-14主要为乳白色，薄粉状。镜检结果可以看出，分生孢子的大小几乎无差别，其形态与球孢白僵菌最为相似，14株菌株经形态学初步鉴定为白僵菌。

（2）分子生物学鉴定

将测序所得的序列用BLAST进行同源性比对，其相似性达到99%以上，比对得到所测菌株为白僵菌，其中菌株BbJL-01的ITS序列长度为541bp，与球孢白僵菌的同源性最高。其序列为：

GATCGAGTTACTCCCTACCCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGGGGGGAGGAAAA

从NCBI上下载了与其同源性最高的10条序列，利用MEGA5.1软件进行进化分析，采用NJ法构建进化树，Bootstrap值为1000，结果见图2。

实施例2

1、毒力测定

将分离获得的白僵菌菌株分别转至PDA培养基上，于25℃恒温培养。10d后收集孢子，从各菌株平板上刮取一定量孢子，置于灭菌的0.1%吐温-80无菌水中，配制1.0 ×10⁷孢子悬液，以0.1%吐温-80无菌水作对照。将柳杉毛虫7龄幼虫在配制好的孢子悬液中浸渍10s，用滤纸吸去多余水分，然后将虫放入装有柳杉枝条的广口瓶中，以纱布封口，置于培养箱（25 ℃，RH 90%，L:D=14 h:10 h）中饲养。每处理15头末龄幼虫，3次重复。图3为正常状态下的柳杉毛虫末龄幼虫图；图4为柳杉毛虫末龄幼虫感染白僵菌BbJL-01菌株后的感染症状图；图5为白僵菌BbJL-01菌株对柳杉毛虫蛹的亚致死感染图。接种72 h后每天统计死亡虫数，通过筛选得到毒力较强的白僵菌菌株。记录死亡虫体数量，统计感染20天后的累积死亡率（%），致死中时（LT₅₀）。

2、结果

使用14株分离得到的球孢白僵菌对柳杉毛虫7龄幼虫进行生测试验，统计其累积死亡率及致死中时。14株菌株的毒力均有所不同，对柳杉毛虫的毒力测定结果见图6。不同菌株之间对柳杉毛虫7龄幼虫的毒力有显著性的差异，14株菌株中20天的累积死亡率大于60%的有6株，其中BbJL-01菌株对柳杉毛虫7龄幼虫在20天内的累积死亡率最高（82%），其致死中时LT₅₀为8.99天。

实施例1、2的结果表明，菌株BbJL-01对柳杉毛虫7龄幼虫具有较强的致病力，该菌株生长快，产孢量大，累积死亡率高且致死中时短，对于柳杉毛虫末龄幼虫的防治具有潜在意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株对柳杉毛虫末龄幼虫有强致病力的球孢白僵菌BbJL-01

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 541

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatcgagtta ctccctaccc ttctgtgaac ctacctatcg ttgcttcggc ggactcgccc 60

cagcccggac gcggactgga ccagcggccc gccggggacc tcaaactctt gtattccagc 120

atcttctgaa tacgccgcaa ggcaaaacaa atgaatcaaa actttcaaca acggatctct 180

tggctctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatc 240

cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc agcattctgg cgggcatgcc 300

tgttcgagcg tcatttcaac cctcgacctc cccttgggga ggtcggcgtt ggggaccggc 360

agcacaccgc cggccctgaa atggagtggc ggcccgtccg cggcgacctc tgcgtagtaa 420

tacagctcgc accggaaccc cgacgcggcc acgccgtaaa acacccaact tctgaacgtt 480

gacctcgaat caggtaggac tacccgctga acttaagcat atcaaaaagg ggggaggaaa 540

a 541

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbJL-01，于2019年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：17182。

2.一株如权利要求1所述的球孢白僵菌BbJL-01的ITS序列，其特征在于，所述ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一株如权利要求1所述的球孢白僵菌BbJL-01在防治柳杉毛虫末龄幼虫中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

（4）通过筛选得到毒力较强的白僵菌菌株，死亡的僵虫置于无菌培养皿内25℃保湿培养，观察虫体上菌丝生长情况，以区分白僵菌致死和非白僵菌致死；以死亡后虫体表面产生白色菌丝记为被白僵菌感染有效致死，观察菌丝生长及产孢情况，统计死亡率、致死中时。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述培养箱饲养条件为温度25℃，湿度90%，L:D=14 h:10 h。