CN111662856A - 一种包含木醋液的复合微生物制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含木醋液的复合微生物制剂，复合微生物制剂为液体微生物制剂，包括阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液；其中，阿氏芽孢杆菌B295保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年10月16日，保藏编号为CGMCC NO.18691；短小芽孢杆菌B202保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年3月2日，保藏编号为CGMCC NO.5838。本发明提供的复合微生物制剂，克服了传统化学杀菌剂在根结线虫防治过程中防效差以及残留、污染和抗药性等缺陷，能够安全、高效、快速的杀灭根结线虫，并且其制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

Description

一种包含木醋液的复合微生物制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种包含木醋液的复合微生物制剂及其制备方法与应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp)是1855年由Berkeley发现的一类两侧对称的原体腔无脊椎植物病原线虫，根结线虫寄生范围广，涵盖小麦、水稻、玉米等粮食作物，花生、大豆等油料作物，烟草、茶叶、药材等经济作物以及其余的花卉、蔬菜等，主要寄生于寄主植物的根系。其中茄科、葫芦科、十字花科的植物所受损害尤其严重，发病率较其他科植物更高。病害发生后，可造成作物减产10％～20％，严重时可达75％以上。
根结线虫侵染植物根部主要是在二龄幼虫时期，迁移并固定在维管束，幼虫用口针吸食植物根部的汁液，刺激细胞分裂，会在受害植物的根部形成根瘤和根结。植物根部大量的根瘤和根结会影响植物吸水和吸收养分。根结线虫造成的伤口又会造成侵入概率增大，从而引起复合侵染。由于根结线虫在地下侵染危害植物，植株受侵害情况较轻时，植株地上部分症状不明显，使危害难于发现，这是根结线虫难以防治的原因之一。若受侵害情况较重，则植株出现发育缓慢、矮化，叶片发生变黄或变薄等症状；植株的地下部分会表现为须根或侧根膨大，形成形态大小不一的根瘤，有的根瘤单生，有的相连呈串珠状、鸡爪状等，至生长后期造成根系腐烂，当症状最为严重时，甚至会导致植株死亡而绝产绝收。
目前防治线虫药剂以化学制剂为主，生物制剂主要包括以阿维菌素为主要成分的各类农药，经调查统计，目前各地区均出现了对以上各药物成分具备抗药性的线虫品种，并且以噻唑膦为代表的化学制剂污染大，残留严重。因此，市场上急需一种高效的，对环境友好的杀根结线虫药剂。
发明内容
为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种复合微生物制剂及其制备方法与应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案。
在第一方面，本发明提供一种包含木醋液的复合微生物制剂，复合微生物制剂为液体微生物制剂，包括阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液；其中，阿氏芽孢杆菌B295保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年10月16日，保藏编号为CGMCC NO.18691；短小芽孢杆菌B202保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年3月2日，保藏编号为CGMCCNO.5838。
优选的，木醋液为山杏壳木醋液。
每毫升复合微生物制剂中阿氏芽孢杆菌B295的孢子个数为1.0×108～1.0×109个，短小芽孢杆菌B202的孢子个数为1.0×108～1.0×109个，木醋液为0.03～0.05g。
优选的，每毫升复合制剂中阿氏芽孢杆菌B295的孢子个数为1.0×109个，短小芽孢杆菌B202的孢子个数为1.0×109个，木醋液为0.05g。
在第二方面，本发明提供一种包含木醋液的复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料准备，使用单菌种纯发酵的方法分别制取阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液；
(2)将制得的阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液进行复配，在复配后的复合菌液中加入木醋液混合震荡，加入辅料，制得液体微生物制剂。
优选的，将液体微生物制剂附加固态载体和助剂制得固体微生物制剂。
在第三方面，本发明提供一种包含木醋液的复合微生物制剂，复合微生物制剂为固体微生物制剂，固体微生物制剂包含以下组分，各组分的含量以质量百分比表示如下：
有效成分 10-15％
固态载体 70-80％
助剂 5-20％；
其中有效成分包括阿氏芽孢杆菌B295、短小芽孢杆菌B202和木醋液。
固态载体包括草炭、麦麸、硅藻土和滑石粉中的一种或多种。
助剂包括十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠和聚乙烯醇丙烯酸钠中的一种或多种。
在第四方面，本发明提供一种包含木醋液的复合微生物制剂在防治根结线虫中的应用。
木醋液是木质材料干馏时的气相烟气经冷凝冷却得到的液体产物。它是一种纯天然、广谱性、活性态，有200余种成份组成的复合生物制剂，有独特的烟熏香味。而且由于木醋液来自天然，所以由它制成的产品和制剂均可在自然状态下分解，并不在土壤中残留，被认为是绿色产品，正在越来越受到世界各国的重视。之前的文献多报道木醋液有促进作物生长的作用，并且对真菌和病毒引起的病害有抑制作用。不同的原材料所得到的醋液组成有一定的差别，本申请采用从杏壳中提取的木醋液，对作物的根结线虫有良好的防治作用。
阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液的复配微生物制剂对作物根结线虫有良好防效，生防菌与生物源农药木醋液混用的防效均不同程度高于两者单独使用，表现出不同程度的增效作用。这是生防菌和生物源农药对根结线虫的作用机理不同，即生物源农药具有快速稳定的体外杀虫作用，主要作用于生活在土壤中的2龄幼虫；而生防菌株不仅对根结线虫2龄幼虫具有抑制作用，还能显著抑制根结线虫卵孵化，甚至有可能诱导植物产生抗性，抵制根结线虫2龄幼虫的侵入，并且生物农药可以加速生防菌溶解线虫体壁，对线虫虫体造成损伤。生防菌与生物源农药结合使用不仅可以发挥生物源农药安全高效的优势，同时还保持了生防菌在植物根周围定植、分泌抗生素、诱导植物产生抗病性等特点。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的包含木醋液的复合微生物制剂，通过阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液的复配以及木醋液的加入，对作物根结线虫有良好防效。
本发明提供的包含木醋液的复合微生物制剂，尤其是固体复合微生物制剂，防治效果高且长期稳定，适于农业生产的需求。
本发明提供的包含木醋液的复合微生物制剂，克服了传统化学杀菌剂在根结线虫防治过程中防效差以及残留、污染和抗药性等缺陷，能够安全、高效、快速的杀灭根结线虫，并且其制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
保藏信息
本发明分离鉴定的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295，己于2019年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.18691；短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)B202，己于2012年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.5838。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1(a)是温室盆栽条件下采用本发明方法制备的木醋液处理的番茄根部；
图1(b)是温室盆栽条件下采用本发明的液体复合微生物菌剂处理的番茄根部；
图1(c)是温室盆栽条件下空白对照清水处理的番茄根部。
图2(a)是田间采用本发明方法制备的木醋液处理的番茄根部；
图2(b)是田间采用本发明的液体复合微生物菌剂处理的番茄根部；
图2(c)是田间空白对照清水处理的番茄根部。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1
阿氏芽孢杆菌B295菌株的分离及筛选方法如下：
(1)样品采集：分别在河北省保定、石家庄、衡水、邢台、邯郸5个地区蔬菜生产基地大棚中，采集被根结线虫侵害的番茄植株和健康植株。将采集到的番茄植株带回试验室，置4℃低温保存，备用。
将受线虫侵染番茄植株和健康植株根部土壤小心分离，包括根围和根际土壤，同时标记来自不同地区植株、不同部位的土壤，用于统计区分生防菌来源。将分离下的土壤放置于通风橱中风干3天，用30-80目筛去除土壤中对试验不利的残渣，置于室温，备用。
(2)菌株分离：称取每份处理好的土壤样品各5g，并加入锥形瓶中，再分别加入45mL蒸馏水摇匀，置于160r/min的摇床中摇动20min。将摇好的土壤悬液取出，采用稀释涂布平板法对悬液进行梯度稀释，稀释倍数为10倍。
(3)菌株发酵液制备：将经上一步分离的株菌放置于培养基上进行活化培养24h。量取液体培养基，每份25mL，将其加入100mL的锥形瓶中，把对应的菌株接种至锥形瓶中，在30℃，160r/min的摇床上振荡发酵培养6h。使用移液枪吸取菌液至EP管中，在4℃，10000r/min的离心机中离心10min，取上清液，做好标记，得到菌株发酵液。
(4)初筛：取每份菌株发酵液1mL，加入24孔组织培养板管中，并每份加入0.2mL显微镜镜检约100条根结线虫二龄幼虫悬液，混匀，置于25℃的培养箱中，24h后，吸取上清液丢弃，并加入0.2mL(1mol/L)的NaOH溶液，该步骤的目的是防止假死的根结线虫影响试验结果(NaOH溶液可刺激假死的根结线虫，使其恢复活性)，混匀，显微镜观察。无菌蒸馏水处理为对照组，每个处理重复3次，统计处理组和对照组死亡的线虫数目，并计算校正死亡率。以校正死亡率超过70％为生防菌株筛选的指标。菌株对线虫的校正死亡率达到70％，则可认为其对根结线虫二龄幼虫的活性具有显著的拮抗作用。
线虫死亡率(％)＝死亡线虫数/供试线虫数×100
校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率—对照线虫死亡率)/(1—对照线虫死亡率)×100
(5)复筛：将初筛中抗线虫株菌株发酵液吸取0.2mL至PE管中，并对其浓度进行5倍稀释，将菌株发酵液分成4组，将处理的稀释溶液加入组织培养板中，每孔加250mL，然后每孔再加入0.2mL含约100条根结线虫二龄幼虫的悬液，混匀后置于25℃培养箱中，每组分别培养4h、8h、12h、24h，无菌蒸馏水处理作为对照组，重复3次。按初筛方法统计计算线虫死亡率和校正死亡率。经过复筛，得到校正死亡率最高的菌株，即为菌株B295。图2(a)是空白对照清水处理组培养24h的线虫。图2(b)是菌株B295处理组培养4h的线虫。
实施例2
阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295的鉴定
(1)菌株B295生物学形态特征
接种菌株B295在改良的NA培养基平板上培养48h，培养温度37℃，可以观察到芽孢，在显微镜下观察菌株(参见附图1(a)和附图1(b))为杆状，菌落不透明，菌落呈圆形或椭圆形，颜色为白色，表面光滑。通过革兰氏染色结果为革兰氏染色阳性菌。
(2)B295菌株的16S rDNA的鉴定
提取菌株B295基因组DNA为模板，用引物63F和1387R进行扩增，扩增出约1.4kb的片段。将纯化后的DNA片段连接到pMD-19T载体上，热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，得到了插入片段的转化子，摇菌后提取质粒，用通用引物进行测序，测序拼接后16S rDNA序列长度为1459bp，将所得序列在NCBI的genbank与其他细菌的16S rDNA序列比对得出：菌株B295和Bacillus aryabhattai相似度在99％以上。初步确定菌株B295为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，该菌株被命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B295。
实施例3山杏壳木醋液的制备
本申请采用从杏壳中提取的木醋液，对作物的根结线虫有良好的防治作用。该山杏壳木醋液的制备方法包括如下步骤：
(1)净化：将杏壳原料用净化机去除杂质；
(2)热解：将净化后的杏壳加入到热解器中，控制通入空气量，不完全燃烧，温度为273-500℃，分解；
(3)冷凝：从热解器中引出的气相产物经常温水冷凝管进行4级冷凝，取可凝性部分即为粗木醋液；
(4)静置：将粗木醋液放在容器中静置180天以上，分离出3层；
(5)净化：弃除上层、下层杂质部分，对剩余的中层进行活性炭吸附或蒸馏；碳吸附条件为：将活性炭与粗制木醋液混合，1000～1500r/min搅拌10～20min，静置48h后过滤3次，得到精制木醋液。
本申请中得到的山杏壳木醋液加入复配菌株发酵液中制成复合微生物制剂，对作物的根结线虫有良好的防治作用。
实施例4复合微生物制剂的制备
复合微生物制剂的方法，包括如下步骤：
(1)原料准备
阿氏芽孢杆菌B295菌液：
将阿氏芽孢杆菌B295菌种活化后，接入摇瓶中培养，其中摇瓶培养基的PH值为7.2，包括：牛肉膏0.3重量份，NaCl 0.5重量份，蛋白胨0.7重量份，水100个重量份；将150ml的三角瓶中放入50ml的培养基，高压灭菌后接入活化后的菌种，置于30℃的摇床上，培养36个小时得到阿氏芽孢杆菌B295菌液；
短小芽孢杆菌B202菌液：
将短小芽孢杆菌B202菌种活化后，接入摇瓶中培养，其中摇瓶的培养基的PH值为7.1,包括1个重量份的酵母膏、0.2个重量份的蛋白胨、0.8个重量份的牛肉膏和0.5个重量份的淀粉、200个重量份的水，在培养基中加入2％的乙醇作为生长因子，将150ml的三角瓶放入50ml的培养基，高温灭菌后接入活化后的菌种，置于27℃的摇床上，培养72个小时得到短小芽孢杆菌菌液。
(2)将制得的阿氏芽孢杆菌菌液、短小芽孢杆菌菌液按1：1比例(体积比)进行复配，在复配后的复合菌液1000毫升中加入25g木醋液，混合震荡，制得防治根结线虫的复合微生物制剂的原液。加入适当辅料，制得液体微生物制剂。
实施例4固体微生物制剂的制备
将液体微生物制剂附加固态载体和助剂制得固体微生物制剂。
固体微生物制剂包含以下组分，各组分的含量以质量百分比表示如下：
有效成分 10-15％
固态载体 70-80％
助剂 5-20％；
其中，有效成分包括阿氏芽孢杆菌B295、短小芽孢杆菌B202和木醋液。
固态载体包括草炭、麦麸、硅藻土和滑石粉。
助剂包括十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠和聚乙烯醇丙烯酸钠。可以的
以下为A1-A5五组固体微生物制剂中各组分质量百分比：
表1固体微生物制剂中各组分质量百分比
A1 A2 A3 A4 A5
有效成分 10 11 12 14 15
固态载体 70 72 75 78 80
助剂 20 17 13 8 5
实验例1
复合微生物制剂在温室盆栽条件下的生防效果：
根据Benjumin D根结危害程度分级标准调查植株发病程度，根据记录的原始数据，按公式计算病情指数和防治效果。
表2根结危害程度分级标准
级数 分级标准
0级 无根结
Ⅰ级 根结占全根系的1％～25％
Ⅱ级 根结占全根系的26％～50％
Ⅲ级 根结占全根系的51％～75％
Ⅳ级 根结占全根系的76％～100％
病情指数＝100×∑(各级病根数×各级代表值)/(调查总根数×最高级代表值)；
防治效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100。
模拟冬季温室的环境，温室温度控制为15-18℃。实验共3组，每组设置3次重复，分别是复配菌株发酵液处理组、木醋液处理组、液体复合微生物制剂(含木醋液复合物微生物制剂，下同)处理组以及清水处理组。将番茄接种根结线虫，在接种后2日分别浇灌木醋液、复合微生物制剂、复配菌株发酵液以及清水，番茄种植90天，取番茄根部，根据病情级别确定根结线虫的发病情况，结果见表3。
表3不同处理对南方根结线虫的防治效果
试剂处理 病情指数 相对防治效果(％)
复配菌株发酵液 22.42 73.51a
木醋液 31.25 62.50b
液体复合微生物制剂 15.68 80.04c
清水对照 83.33 ——
注：数据SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性比较(P＜0.05)
实验例2液体复合微生物制剂在田间试验条件下的生防效果
2019年在河北省衡水市饶阳县吾固村番茄温室进行试验。采用随机区组方法，每个小区面积为30m2(5m×6m)，每个处理3次重复。处理设置为：1、复配菌株发酵液；2、木醋液；3、液体复合微生物制剂；4、清水对照。将番茄接种根结线虫，7d人工逐株浇灌稀释的木醋液、复合微生物制剂和清水。番茄种植90天，每个小区随机调查30株，番茄根部的泥土用水冲洗干净后，根据Benjumin D分级标准，记录每株根结的数量，根据公式计算计算发病率、病情指数和防治效果，结果见表4。
表4不同处理对番茄根结线虫病田间防治效果
处理 病情指数 防治效果(％)
复配菌株发酵液 3.49 70.12a
木醋液 5.67 56.82b
液体复合微生物制 3.02 75.24c
清水对照 28.72 —
注：数据用SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性的比较(P＜0.05)
实验例3液体微生物制剂与固体微生物制剂在田间的稳定性实验表5定植3个月后防治效果
Figure BDA0002613558570000091
Figure BDA0002613558570000101
注：数据用SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性的比较(P＜0.05)
表5定植5个月后防治效果
处理 病情指数 防治效果(％)
固体微生物制剂 18.37 77.65a
液体微生物制剂 28.61 63.56b
空白对照 78.56 —
注：数据用SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性的比较(P＜0.05)
由上述实施例1-4以及实验例1-3可以看出：通过实验例1和实验例2可以看出，经过本申请方法制备的木醋液和复配菌株发酵液均对南方根结线虫有一定的防效，本申请制备的复合微生物菌剂在木醋液和复配菌株发酵液的基础上对南方根结线虫有更好的防效。通过实验例3可以看出，固体和液体微生物制剂均有较稳定的防效。并且加入了载体和助剂的固体微生物制剂与液体微生物制剂相比表现出了更好的稳定性及更持久的防治效果，尤其是固体制剂的优势效果在定植5个月后表现得更加明显。本发明提供的复合微生物制剂，克服了传统化学杀菌剂在根结线虫防治过程中防效差以及残留、污染和抗药性等缺陷，能够安全、高效、快速的杀灭根结线虫，并且其制备工艺简单，成本低廉，使用方便，效果长期稳定，具有很好的应用前景。
需要说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种包含木醋液的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂为液体微生物制剂，包括阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液；
其中，所述阿氏芽孢杆菌B295保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年10月16日，保藏编号为CGMCC NO.18691；
所述短小芽孢杆菌B202保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年3月2日，保藏编号为CGMCC NO.5838。
2.根据权利要求1所述包含木醋液的复合微生物制剂，其特征在于，所述木醋液为山杏壳木醋液。
3.根据权利要求1所述包含木醋液的复合微生物制剂，其特征在于，每毫升复合微生物制剂中阿氏芽孢杆菌B295的孢子个数为1.0×108～1.0×109个，短小芽孢杆菌B202的孢子个数为1.0×108～1.0×109个，木醋液为0.03～0.05g。
4.根据权利要求1所述包含木醋液的复合微生物制剂，其特征在于，每毫升复合制剂中阿氏芽孢杆菌B295的孢子个数为1.0×109个，短小芽孢杆菌B202的孢子个数为1.0×109个，木醋液为0.05g。
5.一种根据权利要求1-4中的任意一项所述包含木醋液的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)原料准备，使用单菌种纯发酵的方法分别制取阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液；
(2)将制得的阿氏芽孢杆菌B295菌液、短小芽孢杆菌B202菌液进行复配，在复配后的复合菌液中加入木醋液混合震荡，加入辅料，制得液体微生物制剂。
6.根据权利要求5所述包含木醋液的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述液体微生物制剂附加固态载体和助剂制得固体微生物制剂。
7.一种根据权利要求6所述包含木醋液的复合微生物制剂的制备方法制得的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂为固体微生物制剂，所述固体微生物制剂包含以下组分，所述各组分的含量以质量百分比表示如下：
有效成分10-15％
固态载体70-80％
助剂5-20％；
其中有效成分包括阿氏芽孢杆菌B295、短小芽孢杆菌B202和木醋液。
8.根据权利要求7所述包含木醋液的复合微生物制剂，其特征在于，所述固态载体包括草炭、麦麸、硅藻土和滑石粉中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述包含木醋液的复合微生物制剂，其特征在于，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠和聚乙烯醇丙烯酸钠中的一种或多种。
10.一种根据权利要求1-4和7-9中的任意一项所述包含木醋液的复合微生物制剂在防治根结线虫中的应用。
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