CN103555589A

CN103555589A - 杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN103555589A
Application number: CN201310428019.1A
Authority: CN
Inventors: 杜立新; 曹伟平; 宋健; 冯书亮; 王金耀
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2013-09-22
Filing date: 2013-09-22
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明公开了一种针对林业重要害虫，特别针对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲具有高毒杀能力的白僵菌新菌株XWY-1。毒力测试表明，XWY-1菌株对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲具有极高的毒力，因而，可以将本发明白僵菌（Beauveriabassiana）XWY-1制成杀虫剂，用于林业害虫的防治，从而降低农药的使用量，减少环境污染，保护天敌，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体地说是一种白僵菌及其在林业害虫防治中的应用。

背景技术

白僵菌（Beauveria bassiana）是一类寄生昆虫的病原真菌，以粘附在虫体表皮或肠胃，快速繁殖，造成害虫死亡，并以分生孢子造成害虫流行感染。白僵菌是我国研究时间最长、应用面积较大的真菌杀虫剂。从上个世纪60年代起，国内开始研究利用白僵菌防治林业害虫松毛虫和农业害虫玉米螟，至70年代，开发出固相培养和液固两相生产方法和应用技术，并陆续建厂生产白僵菌粗产品，大面积防治松毛虫和玉米螟。目前，针对松毛虫、天牛、小蠹虫、象甲及木蠹蛾等重要林业害虫进行了较多的白僵菌研究及应用工作，尚未有白僵菌防治林业害虫榆蓝叶甲的研究报道。

榆蓝叶甲属鞘翅目叶甲科，又名榆绿叶甲、榆毛胸茧叶甲、榆蓝金花虫。榆蓝叶甲以成虫和幼虫危害榆树叶片，严重发生时可将叶片食成网状，甚至将树冠叶片全部食光；成虫还有进入公共场所、居民家中扰民的习性；榆蓝叶甲化蛹前大量老熟幼虫群集树干分叉处和树皮缝隙间，影响环境卫生，影响树木的树势和景观效果。上世纪六七十年代榆蓝叶甲曾在我国爆发，造成榆树在我国几乎绝种。叶甲类害虫对有机磷、有机氯、菊脂类农药较为敏感，此类药物虽然能够取得短期效果，但同时也带来一些弊端，如增强害虫抗药性、污染环境、杀伤鸟类、造成害虫再度猖獗的恶性循环，不能达到对害虫种群的有效控制。因此为了减少常规化学农药对城市环境的污染及对居民健康的影响，榆蓝叶甲防治需要安全有效、保护天敌的生物农药，筛选对榆蓝叶甲有高致病性的白僵菌是防治榆蓝叶甲的有效的方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对林业重要害虫，特别针对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲具有高毒杀能力的白僵菌新菌株。

本发明所提供新菌株是白僵菌（Beauveria bassiana）XWY-1，该菌株已于2012年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6626。

XWY-1菌株是2010年河北省农林科学院植物保护研究所在河北雄县甘薯田采集到的白色感病昆虫上分离得到的。将分离到的XWY-1菌株接种在SDAY（蛋白胨10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH）平板培养基上，观察菌落形态特征、产孢特征等。结果显示在SDAY培养基上培养7天，菌落初期白色茸状，产孢时乳白色，孢子层厚且均匀，中心至边缘呈丘状凸起，具同心纹。菌丝具分枝分隔，透明、光滑，有时成簇生长。产孢细胞浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，产孢细胞上部“之”字形，顶端渐变细长；分生孢子为近球形，单细胞，孢子大小为1.1-2.2×1.5-2.7μm。从以上特征看，菌株XWY-1为球孢白僵菌。XWY-1菌株菌落照片如图1 所示， XWY-1菌株孢子及菌丝照片如图2所示。

进一步的分析结果表明，与XWY-1菌株ITS序列最为接近的为球孢白僵菌，其ITS序列同源性为99%，结合XWY-1菌株的形态学特点，将该菌株鉴定为球孢白僵菌。

对XWY-1菌株进行毒力测试，发现该菌株浓度1×10⁸孢子/mL的孢悬液对榆蓝叶甲1龄、2龄、3龄幼虫、成虫、蛹7天的校正死亡率分别为92.3%、86.4%、82.3%、79.8%、38.5%。XWY-1菌株在第5~7 天对榆蓝叶甲2龄幼虫的LC50分别为3.14×10⁷、8.05×10⁶、7.57×10⁵孢子/mL，对榆蓝叶甲成虫的LC50为2.46×10⁷孢子/mL。因此，XWY-1菌株对榆蓝叶甲不同龄期的幼虫和成虫均有很高的杀虫活性。

上述毒力测试表明，XWY-1菌株对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲具有极高的毒力，因而，可以将本发明白僵菌（Beauveria bassiana）XWY-1制成杀虫剂，用于林业害虫的防治，从而降低农药的使用量，减少环境污染，保护天敌，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1 为XWY-1菌株菌落照片；

图2为XWY-1菌株孢子及菌丝照片；

图3为XWY-1菌株感染的榆蓝叶甲幼虫；

图4为XWY-1菌株感染的榆蓝叶甲成虫。

具体实施方式

实施例1：XWY-1菌株获取的工作流程

田间采集自然感病僵虫→直接分离纯化菌株→接种榆蓝叶甲幼虫测定杀虫毒力→获得高毒力菌株XWY-1→菌株形态、孢子形态、鉴定→提取菌株DNA，以真菌ITS序列通用引物扩增菌株DNA，将获得的扩增序列测序并在GenBank中对比→确定菌株XWY-1为球孢白僵菌。

实施例2：XWY-1菌株的筛选分离过程

XWY-1菌株是2010年河北省农林科学院植物保护研究所在河北雄县甘薯田调查时采集到的白色感病昆虫上分离得到的。将白色感病昆虫带回实验室后保湿处理，待其体表产生孢子时，将孢子接种在SDAY（蛋白胨10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH）平板培养基上培养至产生分生孢子，收集分生孢子，冷冻干燥后4℃备用。

实施例3：菌株培养及孢悬液配制

将XWY-1菌株接种于SDAY平板培养基上，25±1℃恒温光照（14L∶10D）培养。形成分生孢子后用0.05%(v/v)无菌吐温80水溶液收集孢子，经磁力搅拌器搅拌30 min，将孢子完全均匀打散后经4层无菌纱布过滤，获得纯孢子悬浮液，以血球计数板计数并配制成梯度浓度的孢悬液，用于致病力测定。

实施例4：XWY-1菌株对榆蓝叶甲的杀虫活性

XWY-1菌株对榆蓝叶甲成虫、幼虫及蛹的杀虫活性测定：饲养塑料盒用次氯酸钠100倍液浸泡1 h，晾干。挑取大小一致、健康活泼的榆蓝叶甲试虫，将不同浓度的XWY-1孢悬液分别喷洒于试虫体表，并用滤纸吸去多于水分，以 0.05％（V/V）吐温-80水悬液处理作为对照，置于26±1℃、光周期14 h：10 h（L：D）条件下饲养，将新鲜榆叶用脱脂棉保湿饲喂试虫。每处理30头试虫，设3次重复，施药后定期调查死亡虫数，并及时更换饵料。数据统计分析应用SPSS 18.0软件进行数据处理。

从表1、2、3中可以看出，XWY-1菌株对榆蓝叶甲幼虫及成虫均有较高毒力，浓度1×10⁸孢子/mL的孢悬液对榆蓝叶甲1龄、2龄、3龄幼虫、成虫、蛹7天的校正死亡率分别为92.3%、86.4%、82.3%、79.8%、38.5%。XWY-1在第5~7 天对榆蓝叶甲幼虫的LC50分别为3.14×10⁷、8.05×10⁶、7.57×10⁵孢子/mL，对榆蓝叶甲成虫的LC50为2.46×10⁷孢子/mL。可以看出，XWY-1菌株对榆蓝叶甲不同龄期的幼虫和成虫均有很高的杀虫活性。图3为榆蓝叶甲幼虫感染XWY-1菌株的情况；图4为榆蓝叶甲成虫感染XWY-1菌株的情况。

实施例5：XWY-1菌株的ITS序列扩增与序列测定

在铺有灭菌玻璃纸的SDAY培养基上刮取XWY-1菌丝体放入研钵中，加液氮后研磨成粉末，转移到10 mL的离心管中，加入1 mL的DNA抽提液[0.1g/2mL，抽提液配方：Tris-HCl（pH 7.5）0.2 mol/L，NaCl 0.5mol/L，SDS 1%，漩涡振荡混匀，加入200 μL Tris饱和酚，65℃水浴30min，每隔5-10 min混匀一次；变凉之后，加入1 mL的酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1），轻摇混匀，12000r/min，4℃离心5 min；重复一次上面步骤；将上清液转移到一新离心管，向该离心管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放30 min，12000 r/min离心10 min收集沉淀，75 %酒精冲洗，超净台吹风干燥，加入适量的TE溶解沉淀即得到DNA。加入3 μL的RNA酶，37℃水浴1 h；加500 mLddH2O，加入400 μL氯仿/异戊醇（24:1），12000 r/min离心10 min，取上清，重复两次。重复上面的步骤，沉淀DNA，溶于30 μl TE中，-20℃保存，备用。

所用引物为真菌ITS区通用引物（正向引物ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向引物 ITS-5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩增的 50 μL 反应体系包括：40 μL无菌水，1 μL DNA模板，5 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/L），1 μL10mmol/mL dNTP，1.5 μL10 mmol/mL ITS-4，1.5 μL10 mmol/L ITS-5。PCR 反应条件：95 ℃4 min，94 ℃1 min，54℃1 min，72℃2 min，35个循环，72℃延伸2 min。PCR产物3 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。北京华大基因完成测序。测序后，将ITS序列与 Genebank 数据库中的相关菌株进行同源性BLAST比对。

ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

对所测得的ITS序列与GenBank中已知序列对比，结果表明，与该菌株ITS序列最为接近的为球孢白僵菌，其ITS序列同源性为99%，结合XWY-1菌株的形态学特点，将该菌株鉴定为球孢白僵菌。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120>杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> 白僵菌（Beauveria bassiana）

<400> 1

ccggtactct acgcggaggg acattaccga gttttcactc cctaaccctt ctgtgaacct 60

acctatcgtt gcttcggcgg actcgcccca gcccggacgc ggactggacc agcggcccgc 120

cggggacctc aaactcttgt attccagcat cttctgaata cgccgcaagg caaaacaaat 180

gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gctctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 240

cgcgataagt aatgtgaatt gcagaatcca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 300

cgcccgccag cattctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc tcgacctccc 360

cttggggggg tcggcgttgg ggaccggcag cacaccgccg gccctgaaat ggagtggcgg 420

cccgtccgcg gcgacctctg cgcagtaata cagctcgcac cggaaccccg acgcggccac 480

gccgtaaaac acccaacttc tgaacgttga cctcgaatca ggtaggacta cccgctgaac 540

ttaagcatat caaaa 555

Claims

1.白僵菌（Beauveria bassiana）XWY-1，保藏号为 CGMCC No.6626。

2.含有权利要求1所述菌株的微生物杀虫剂。

3.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物杀虫剂在林业害虫防治中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述害虫为鞘翅目害虫。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述害虫为鞘翅目叶甲科害虫。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述害虫为榆蓝叶甲。