CN102703338B - 杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌ybt-008及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物杀虫农药技术领域。具体涉及一株对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌的筛选及其在防治甘薯茎线虫中的应用。本发明从苏云金芽胞杆菌中筛选出一株对甘薯茎线虫具有高毒力的菌株YBT-008，该菌株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2011039。本发明还包括由YBT-008制备的微生物菌剂对甘薯茎线虫的防治效果应用，以及YBT-008可产生杀虫晶体蛋白的类型，包括Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba的验证，证明本发明中的微生物及其菌剂属于一种新的杀甘薯茎线虫微生物。

Description

杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌YBT-008及其应用

技术领域

本发明属于微生物杀虫农药技术领域，具体涉及一株对农业生产害虫甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌YBT-008的筛选及其应用。

技术背景

甘薯是重要的粮食、饲料和工业原料，种植广泛，在世界粮食生产中，总产量居第七位，在我国粮食生产中，仅次于水稻、小麦和玉米，居第四位(朱金亭，高建伟.国内外甘薯生产形势概述[J].农牧产品开发，1995，7：20-21)。目前我国甘薯常年种植面积在600万公顷左右，占世界总面积的65％左右，每年总产量占世界总产量85％左右(FAO bulletin of statistics.2002，3(1)：46-47)。

我国甘薯的种植面积和总产量居世界第一位，但是单产却居世界第十二位(朱金亭等，1995)，其原因除栽培和管理技术落后以外，甘薯生产中的隐蔽敌人---甘薯茎线虫病是导致甘薯产量和品质下降的一个重要原因。甘薯茎线虫病又称糠心病、空心病、空梆、糠裂皮等，是一种毁灭性灾害，其病原线虫为甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)。甘薯茎线虫病在我国的北京、天津、山东、河北、河南、江苏、安徽、浙江、福建、辽宁、甘肃等省市均有发生，其中山东、河南、河北、安徽等省发生最为严重。该病不仅在田间危害薯块和茎蔓，还引起贮藏期烂窖，育苗期烂炕，减产可达10％-50％，严重时绝收；除侵染甘薯外，还危害豌豆、菜豆、荞麦、蓖麻，中药材当归、薄荷、人参、胡萝卜和花生等(杨宝君，李静华.当归麻口病病因初步探讨.植物病理学报，1990，20(1)：20；陈品三，郑经武.当归麻口病中致病茎线虫的鉴定研究.植物保护，1988，14(6)：12-14)。该病害已被列为国内检疫对象。

目前针对甘薯茎线虫病的防治方法主要有化学防治、物理防治和抗性品种选育以及生物防治等。用于线虫防治的化学杀虫剂主要有用于土壤熏蒸处理的熏蒸剂和非熏蒸剂两类。熏蒸剂主要有卤代烃和施入土壤后能释放出异硫氰酸甲酯的化合物两类，施入土壤后能对土传线虫、土壤害虫等土内幼小昆虫具有杀伤作用。熏蒸剂为杀死性药物，杀虫效果彻底，防病增产效果明显，还不易诱发线虫产生抗性，但是累及捕食植物病原线虫的肉食线虫以及其他土栖动物，不利于土壤活化、天敌繁衍和环境保护。非熏蒸剂主要有除线磷(Dichlofenthion)、杀线威、克线磷、甲基异硫磷、氯唑磷等有机磷农药(Organophosphates)，一般均为内吸性。非熏蒸剂由于对植物也有危害，故只能在播种前空白地使用，使用时期有限，只能作为预防使用(陈品三.杀线虫剂主要类型、特性及其作用机制.农药科学与管理，2001，22：33-35)。

物理防治是指通过轮种、休闲、旱季翻耕和利用抗病、耐病品种等措施来避免线虫为害，但由于病害易传播造成再次感染和耕地面积限制等原因，轮作换茬的抗病方法受到很大制约；而选育抗病和耐病品种也因为甘薯遗传上的高度杂合性和种间、种内广泛存在的杂交不亲和性，限制了甘薯育种中亲本的自由选择，因此单纯使用抗性育种方法仍有局限性。

生物防治是指利用线虫天敌、一些微生物和高等植物产生的拮抗性代谢物以及基因工程手段培育抗性作物来防治。自然情况下，线虫主要是被土壤中存在的各种天敌杀死(陈品三，郝近大译，AL泰勒著.植物线虫学研究入门.北京：农业出版社，1976)。这些天敌生物主要有真菌、细菌、病毒、捕食性线虫、涡虫、昆虫、螨类和原生动物等(Brian R K.An assessment of progress toward microbial control ofplant-parasitic nematodes.Supplement J Nematol，1990，22：621-631)，其中真菌占了75％(张克勤，何世川，周薇，黄大飞，梅隆.真菌和细菌在线虫生防中的作用及研究进展.杀虫微生物，1991，3：55-61)。线虫天敌真菌主要有捕食性真菌和内寄生真菌，目前研究最多的是淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。利用微生物和高等植物产生的拮抗性代谢物也可以杀死线虫，比如吸水链霉菌(Streptomyceshygtoscopicus)产生的阿维菌素(Avermectin)是很有效的杀线虫剂，防效是普通熏蒸剂的10～20倍((张克勤，何世川，周薇，黄大飞，梅隆.真菌和细菌在线虫生防中的作用及研究进展.杀虫微生物，1991，3：55-61)。苏云金芽胞杆菌产生的苏云金素和伴胞晶体蛋白对线虫也有毒性(Prasad S S V，Tilak K V BR，Gollakota K G.Role of Bacillus thuringiensis var.thuringiensis on the larval survivabilityand egg hatching of Meloidogyne spp.，the causative agent of root-knot disease.J Invertebr Pathol，1972，20：377-378；Bone L W，Bottjer K P，Gill S S.Trichostrongylus colubriformis：Egg lethalitydue to Bacillus thuringiensis crystal toxin.Exp Parasitol，1985，60：314-322)。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是土壤中广泛存在的革兰氏阳性细菌，其在生长过程中会产生具有特异毒性的杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal Proteins，ICPs)，该蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门、疟原虫、血吸虫、螨类等具有毒杀活性(Schnepf H E，Crickmore N，Van Rie J，Lereclus D，Baum J，FeitelsonJ，Zeigler D R，Dean D H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.MicrobiolMol Biol Rev，1998，62：775-806)。由于苏云金芽胞杆菌对目标生物具有特异高毒力，对昆虫天敌、人畜安全，不污染环境而且昆虫不容易产生抗性等特点，因此被广泛应用于农、林、医、仓贮等领域的害虫生物防治。苏云金芽胞杆菌已成为世界上应用最广泛而且最为成功的生物杀虫剂(喻子牛.苏云金芽胞杆菌制剂的生产和应用.北京：农业出版社，1993)。自1972年Prasad首次报道苏云金芽胞杆菌对线虫有作用以来(Prasad S S V，Tilak K V B R，Gollakota K G.Role of Bacillus thuringiensis var.thuringiensis on the larval survivability and egg hatching of Meloidogyne spp.，the causativeagent of root-knot disease.J Invertebr Pathol，1972，20：377-378)，利用苏云金芽胞杆菌防治动植物寄生线虫越来越得到国内外的关注。上个世纪80年代Bone等人的研究首次证实了苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对线虫的杀虫活性(Bone L W，Bottjer K P，Gill S S.Trichostrongylus colubriformis：Egg lethality due to Bacillus thuringiensis crystal toxin.Exp Parasitol，1985，60：314-322)。之后，美国Mycogen公司的大量研究工作也进一步证实了苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对线虫的作用(Bradfish G A.Process for controlling lepidopteran pests.EP19920920639)。此外他们还克隆了多个杀线虫毒素蛋白的编码基因并申请了相关专利，而我们所能看到的关于苏云金芽胞杆菌对线虫防治的报道也多见于这些专利中的描述。

目前，已经有越来越多的抗线虫的苏云金芽胞杆菌制剂在田间应用。Sharma等用苏云金亚种(subsp.thuringiensis)和以色列亚种(subsp.israelensis)菌剂处理大麦根际土壤，发现对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)起到了一定的防效；此外，他们还发现，用以色列亚种菌株Bti-H14的毒素蛋白处理大豆和玉米种子，能够使大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)的寄生率显著降低(Sharma R D.Bacillus thuringiensis：a biocontrol agent of Meloidogyne incognica on barely.NematologiaBrasilera，1994，18：79-84)。Ivanova则报道某种苏云金芽胞杆菌制剂能够用于防治黄瓜和番茄上的根结线虫(Ivanova T S.Efficiency of biopreparation in control of gall nematode in protected soil.Agrokhimiya，1996，3：101-106)；而Ensard则用苏云金杆菌制剂防治香蕉穿孔线虫也取得了显著效果(Ensard J.Effects of three microbial broth cultures on growth and populations of free livingand plant-parasitic nematodes on banana.European Journal of Plant Pathology，1998，104(5)：457-463)。虽然如此，到目前为止，利用苏云金芽胞杆菌防治甘薯茎线虫的研究工作开展很少，相关菌株和基因资源缺乏，国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服目前利用传统的化学、物理方法防治甘薯茎线虫的局限性，筛选一株对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌，同时也为高效杀虫工程菌和转基因植物的构建提供新型菌株和基因资源。筛选得到的苏云金芽胞杆菌应该具有杀虫毒力高、起效作用快、实施方法简单有效的特点，同时也能为以后的理论研究和实际应用奠定基础。

本发明通过以下技术方案实现：

目前利用苏云金芽胞杆菌防治甘薯茎线虫的研究工作鲜有开展，相关报道缺乏，申请人利用报道的苏云金芽胞杆菌相关菌株如YBT-007、YBT-008、YBT-017、YBT-020、YBT-021、YBT-027、YBT-032、YBT-037，苏云金芽胞杆菌以色列亚种(subsp.Israelensis，血清型H14)和库斯塔克亚种(subsp.kurstaki，血清型H3abc)，以及对北方根结线虫具有高毒力的两个苏云金芽胞杆菌工程菌株BMB171/pHT304-cry5Ba2和BMB171/pHT304-cry6Aa2(以下分别简称为Cry5和Cry6)进行微生物学筛选，得到杀甘薯茎线虫的候选菌株。

方法如下：

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白生物测定样品的制备。将苏云金芽胞杆菌YBT-007、YBT-008等12株菌株分别进行摇瓶培养，待芽胞完全成熟并脱落后，离心收集胞晶混合物。用1mol/L NaCl和无菌去离子水洗涤数次后，Na₂CO₃溶液(pH9.5，临用前加入20mMDTT)溶解其中的伴胞晶体蛋白，然后用4MNaAc(pH4.4)调节蛋白等电点至沉淀最大量析出，沉淀洗涤数次后用Na₂CO₃溶液溶解保存备用。此为对甘薯茎线虫进行生物测定的蛋白样品。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对甘薯茎线虫的生物测定程序。具体生物测定程序参考实施例三。室内生物测定过程在96孔细胞培养板上进行。生物测定的甘薯茎线虫用去离子水洗净，悬浮于无菌水中，调整虫口密度至10³条/ml。在每孔中加入40μl线虫(约40条)悬浮液和260μl蛋白溶解液样品，20μg/ml氯霉素抑制杂菌生长，每个处理3个重复，50mmol/L Na₂CO₃溶液做对照，置于28℃培养箱，每隔3天和7天观察并统计死亡率。

经过统计发现，苏云金芽胞杆菌YBT-008、YBT-032、H14在3天即取得良好杀虫效果(致死率50％以上)，第7天时致死率达到95％以上，相较其余菌株在杀虫效果上具有明显的优势。将蛋白样品稀释二倍后按同样方法进行生物活性的测定，发现苏云金芽胞杆菌YBT-008仍然具有很高的杀虫活性(3天时致死率仍能保持在90％以上)，而其余菌株杀虫效果并不明显。对苏云金芽胞杆菌YBT-008的防治效果测定显示，其对甘薯茎线虫的LC₅₀为203.76μg/ml。

申请人将筛选得到的对甘薯茎线虫具有明显防治效果的苏云金芽胞杆菌YBT-008菌株于2011年2月17日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011039。

苏云金芽胞杆菌YBT-008的生物学特征：

革兰氏染色阳性，营养体呈杆状，长约5-7μm，两端钝圆，通常2-8个呈链状。芽胞卵圆形，有光泽，通常在菌体一端，伴胞晶体在菌体另一端，形态不一。在含7％NaCl(w/v)的肉汤中生长，在柠檬酸培养基中不生长，最适生长温度为28℃，最适生长pH为7.0-7.2，在含有核糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、甘油、可溶性淀粉的培养基中产酸。

摇瓶培养苏云金芽胞杆菌YBT-008，每隔一段时间测量其OD600值，做出生长曲线，如图4所示。从图中可以看出，苏云金芽胞杆菌YBT-008在培养大约12个小时之后进入稳定期。

为了进一步鉴定苏云金芽胞杆菌YBT-008的杀虫晶体蛋白成分，对其进行的SDS-PAGE分析结果显示，此菌株产生包括130kDa杀虫晶体蛋白在内的多种晶体蛋白成分；挖取SDS-PAGE凝胶上蛋白表达量最高的六个电泳条带，进行LC-MS(液相色谱-质谱连用)检测，结果显示，这些晶体蛋白成分分别为Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba。为了进一步确认苏云金芽胞杆菌YBT-008含有上述四种杀虫晶体蛋白编码基因，根据EMBL数据库中cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba的保守序列设计特异性引物进行PCR扩增，得到了正确大小的片段，将得到的扩增片段进行T/A克隆、测序和Blast比对，结果显示测序的PCR扩增片段与数据库中已知cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba的保守序列同源性达到98％以上。可以证实，苏云金芽胞杆菌YBT-008含有编码Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba的杀虫晶体蛋白基因。

本发明筛选的苏云金芽胞杆菌YBT-008对甘薯茎线虫具有高毒力(3天即可杀死供试线虫)、起效作用快(3天即可发挥毒力效用)，实施方法便捷等优点，并含有多种杀虫晶体蛋白编码基因cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba等，预示着可以作为农业防治甘薯茎线虫的新型杀虫剂和转基因植物的基因资源。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

SEQ ID NO：1是cyt2Ba扩增片段经测序后得到的核苷酸序列，序列长度为455bp。

SEQ ID NO：2是cry11Aa扩增片段经测序后得到的核苷酸序列，序列长度为604bp。

SEQ ID NO：3是cry4Aa扩增片段经测序后得到的核苷酸序列，序列长度为1809bp

SEQ ID NO：4是cry4Ba扩增片段经测序后得到的核苷酸序列，序列长度为2541bp

图1：本发明实施例中苏云金芽胞杆菌对甘薯茎线虫的生物测定结果分析；

图2：本发明实施例中苏云金芽胞杆菌YBT-008、YBT-032、H14和YBT-007菌株蛋白样品在稀释二倍后对甘薯茎线虫的生物测定结果分析。

图3：苏云金芽胞杆菌YBT-008在相差显微镜下的菌体形态图；图中：Spore示芽胞，Crystal示其伴胞晶体蛋白。

图4：本发明中苏云金芽胞杆菌YBT-008的生长曲线；图中：横轴示培养时间，纵轴示不同培养时间下的OD600值。

图5：本发明实施例中苏云金芽胞杆菌YBT-008 SDS-PAGE检测图，图中①②③④⑤⑥示挖取的6个蛋白条带；

图6：本发明实施例中苏云金芽胞杆菌YBT-008抽提总质粒的琼脂糖凝胶电泳分析；图中：

M，1kb DNA分子量标准；1，苏云金芽胞杆菌YBT-008总质粒。

图7：本发明实施例中PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳分析；图中：M，1kb DNA分子量标准；1，杀虫晶体蛋白基因cyt2Ba的PCR扩增产物；2，杀虫晶体蛋白基因cry11Aa的PCR扩增产物；3，杀虫晶体蛋白基因cry4Aa的PCR扩增产物；4，杀虫晶体蛋白基因cry4Ba的PCR扩增产物；D，DL2000分子量标准。

图8：本发明实施例中cyt2Ba扩增片段的测序结果与数据库中其CDS序列的Blast比对结果。图中：Query示数据库中cyt2Ba CDS序列107～560段的核苷酸序列；Sbjct示测序得到的cyt2Ba扩增片段核苷酸序列。

图9：本发明实施例中cry11Aa扩增片段的测序结果与数据库中其CDS序列的Blast比对结果。图中：Query示数据库中cry11Aa CDS序列1210～1808段的核苷酸序列；Sbjct示测序得到的cry11Aa扩增片段核苷酸序列。

图10：本发明实施例中cry4Aa扩增片段的测序结果与数据库中其CDS序列的Blast比对结果。图中：Query示数据库中cry4Aa CDS序列626～1505和1716～2602段的核苷酸序列；Sbjct示测序得到的cry4Aa扩增片段核苷酸序列。

图11：本发明实施例中cry4Ba扩增片段的测序结果与数据库中其CDS序列的Blast比对结果；图中：Query示数据库中cry4Ba CDS序列中240～1422和1442～2584段的核苷酸序列；Sbjct示测序得到的cry4Ba扩增片段核苷酸序列。

具体实施方式

实施例1苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白生物测定样品的制备

筛选过程中利用的菌株资源为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室公开报道的苏云金芽胞杆菌株系，其原始编号分别为YBT-007、YBT-008、YBT-017、YBT-020、YBT-021、YBT-027、YBT-032、YBT-037(来源见文献：Yu Zi-Quan等，Bacillus thuringiensis crystal protein toxicity againstplant-parasitic nematodes.Chinese Journal of Agricultural Biotechnology.2008，5(1)：13-17)和苏云金芽胞杆菌以色列亚种和库斯塔克亚种，以及两个苏云金芽胞杆菌工程菌株BMB171/pHT304-cry5Ba2(Suxia Guo等，New strategy for isolating novel nematicidal crystalprotein genes from Bacillus thuringiensis strain YBT1518.Applied and Environment Microbiology.2008，74：6997-7001)和BMB171/pHT304-cry6Aa2(余子全等，苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白cry6Aa的克隆与表达.微生物学报，2007，47：865-868)。

1、苏云金芽胞杆菌供试菌株的培养

将上述12株待试苏云金芽胞杆菌菌株接5ml液体LB培养基(LB培养基配方：胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L；pH 7.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min)经过夜活化后，按1/100(v/v)接种量转接至50ml新鲜灭菌PM培养基中(PM培养基配方：胰蛋白胨，10g/L；葡萄糖，5g/L；酵母提取物，2g/L；KH₂PO₄，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.3g/L；FeSO₄·7H₂O，0.02g/L；ZnSO₄·7H₂O，0.02g/L；MnSO₄·7H₂O，0.02g/L；pH7.2，在115℃高压蒸汽下灭菌20min)，28℃，200rpm摇床培养。培养大约48-52h后，取发酵液制作镜检镜片，在相差显微镜下(所用型号为日本Nikon E600)观察，待视野中大部分芽胞脱落时即可收集。

2、苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的提取

(1)将发酵液在4℃下经8,000rpm离心10min，所得沉淀即为苏云金芽胞杆菌胞晶混合物；

(2)分别用预冷的1mol/L NaCl溶液和无菌去离子水洗涤3次(8,000rpm离心10min，4℃)，期间充分去掉芽胞；

(3)洗涤后的胞晶混合物加入50mmol/L Na₂CO₃溶液(pH9.5，临用前加入20mmol/L DTT)，37℃处理45min；

(4)8,000rpm离心10min收集上清，加入约1/10体积的4mol/L乙酸钠(pH4.4)，冰上静置1～2h；

(5)8,000rpm离心10min收集沉淀，经去离子水洗涤1～2次后，即可得到用作生物测定的杀虫晶体蛋白样品。生物测定前，加入适量50mmol/L Na₂CO₃溶液(pH9.5)溶解即可。

实施例2甘薯茎线虫的接种、培养和收集

依据甘薯茎线虫的生活方式，申请人提供了一种简便的人工培养甘薯茎线虫的方法，其中甘薯茎线虫由中国科学院上海植物生理研究所提供。

1、甘薯茎线虫的接种和培养

无菌去离子水洗净甘薯茎线虫，悬浮于无菌水中，并稀释至虫口密度约5000条/ml备用。将形状均匀、表面无破损的新鲜甘薯用水洗净表面，再用75％酒精擦洗2次后，超净台内吹干备用。用无菌手术刀在甘薯的中间部分切一小块，吸取约200μl线虫悬浮液缓慢打入甘薯凹孔内，静置片刻，待水完全渗入甘薯内后，将切下的甘薯小块放回凹孔内，用蜡封口。

接种后的甘薯用报纸包裹，26℃培养。

2、甘薯茎线虫的收集

线虫接种后，约2个半月后即可进行收集，超过三个月培养的甘薯收集的线虫量会大大降低。

感染甘薯茎线虫的病薯变软，表面有褐色龟裂斑块，内部呈褐色糠心，纵剖面有点状空隙，密集成条，空隙中有白粉状物，严重的呈褐色干腐状。

将感染线虫的甘薯切成小立方体状，两层抽纸包裹置于平皿中央，放入自来水，水尽量浸没抽纸中的甘薯小块。静置数小时后待线虫游出，先用5ml枪将平皿底部白色絮状密集的线虫缓慢吸出，置于15ml离心管中3000rpm离心2-3min，将离心管底部线虫混合入一管。再将大平皿中的抽纸放入新的平皿中，同样方法再收集一次，可过夜收集。

初步收集的线虫用蒸馏水多次洗涤去掉杂质，洗干净后，灭菌水配制1％次氯酸钠溶液消毒5min，洗涤干净后分装于1.5ml离心管中，4°保存。保存的甘薯茎线虫每隔2～3周左右需要换水洗涤2～3次，此种方法保存的甘薯茎线虫可保存数月甚至半年。

实施例3苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对甘薯茎线虫生物活性的测定

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对甘薯茎线虫生物活性的测定程序参考文献：余子全等，苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选，农业生物技术学报，2007(15)：867-871。

此实施例中使用的供试线虫为老、幼混杂的甘薯茎线虫，生物测定过程在96孔细胞培养板上进行。

1、苏云金芽胞杆菌对甘薯茎线虫的生物活性测定

(1)甘薯茎线虫和杀虫晶体蛋白样品的准备。使用前将线虫充分混匀，并用无菌去离子水洗涤数次后，悬浮于水中，同时调整其虫口密度至10³条/ml备用。制备好的杀虫晶体蛋白样品加入适量50mmol/LNa₂CO₃溶液(pH9.5)充分溶解。

(2)生物测定过程。整个生物测定过程在超净工作台中进行。每孔中加入40μl稀释好的线虫悬浮液(约40条)，然后加入260μl杀虫晶体蛋白样品，同时加入20μg/ml氯霉素抑制杂菌生长。每组处理3个重复，以50mmol/L Na₂CO₃(pH9.5)溶液做阴性对照。置于28℃培养箱中，用平皿盖住细胞培养板，减少水分的蒸发。3天和7天时分别统计其死亡率，将死亡率换算成校正死亡率。校正死亡率＝处理组死亡率/(1-对照组死亡率)×100％。

(3)线虫的观察。统计死亡率时，将细胞培养板置于倒置显微镜下观察线虫。死亡的甘薯茎线虫虫体僵直，略向腹部弯曲，呈半透明，易于与活虫区分。

经过3天和7天后统计的12株Bt菌株对甘薯茎线虫的生物活性测定结果如图1所示。

从图1可以看出，苏云金芽胞杆菌YBT-008、YBT-032和H14菌株相较其余菌株在3天时即可达到50％以上的致死率，在7天时可达到90％以上的致死率，杀虫效果明显。

2、苏云金芽胞杆菌YBT-008、YBT-032和H14对甘薯茎线虫的生物活性比较

将苏云金芽胞杆菌YBT-008、YBT-032、H14和YBT-007(做为对照)菌株的蛋白样品分别稀释二倍，按照同样的方法再次测定它们对甘薯茎线虫的生物活性。生物活性测定结果如图2。

从图2可以看出，将苏云金芽胞杆菌YBT-007、YBT-008、YBT-032和H14菌株的蛋白样品稀释二倍后，YBT-008在3天即达到90％以上的致死率，7天时即能完全杀死供试线虫；而其余三个菌株蛋白样品在稀释二倍后，杀虫效果并不显著。

本发明得到的苏云金芽胞杆菌YBT-008菌株相较其余菌株具有非常高的杀虫效率和杀虫效果，为甘薯茎线虫的生物防治提供了新型菌株资源，也为转基因抗虫甘薯品种提供了基因储备资源。

3、苏云金芽胞杆菌YBT-008对甘薯茎线虫的防治效果测定

以甘薯茎线虫做为靶标线虫检测苏云金芽胞杆菌YBT-008的生物活性。杀虫晶体蛋白待测样品和甘薯茎线虫的准备按实施例1、二中所述，生物测定过程按实施例三中所述。整个实验设置5～7个浓度梯度，每个浓度3个重复，50mmol/L Na₂CO₃(pH9.5)溶液做为阴性对照，20μg/ml氯霉素抑制杂菌生长，28℃培养，7天后统计死亡率，将死亡率校正后换算成几率值，蛋白浓度换算成对数值，求出二者之间的回归方程并计算LC₅₀，结果见表1。

表1苏云金芽胞杆菌YBT-008对甘薯茎线虫的防治效果测定

实施例4苏云金芽胞杆菌YBT-008杀虫晶体蛋白及其编码基因验证分析

1、苏云金芽胞杆菌YBT-008菌株蛋白的SDS-PAGE和LC-MS分析

苏云金芽胞杆菌YBT-008经摇瓶培养约48-52h后，相差显微镜下观察其菌体形态，芽胞和伴胞晶体均已形成，如图3所示。待芽胞和伴胞晶体完全脱落后进行收集。

杀虫晶体蛋白样品按照实施例一所述方法制备。

溶解于Na₂CO₃溶液(pH9.5)中的蛋白样品加入等体积的2×上样缓冲液(2×上样缓冲液配方：100mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，混匀后，沸水浴中处理3-5min，12,000rpm离心5min，取上清液进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳操作步骤参见Laemmli描述的方法(Laemmli，UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature，1970(227)：680-685)。

SDS-PAGE结果如图5所示，可以看出，YBT-008除可以产生130kDa大小的晶体蛋白外，尚能产生多种蛋白成分，对于这些未知成分蛋白进行LC-MS(液相色谱多级质谱联用仪，美国ThermoFisher Scientific生产)分析，通过LC-MS以期获知YBT-008未知晶体蛋白的信息。

在上述操作制备的凝胶上选取六个表达量最高的蛋白条带，如图5中①②③④⑤⑥所示，用干净的刀片将其切下，置于1.5ml离心管中，送样进行LC-MS检测，检测单位为中国科学技术大学生命科学实验中心。

样品①②③④⑤⑥的LC-MS结果分别如表2、3、4、5、6和7所示。据LC-MS结果，苏云金芽胞杆菌YBT-008产生的晶体蛋白为Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba，其分子量分别为29kDa、72kDa、134kDa和128kDa，其对按蚊属(Anopheles)、伊蚊属(Aedes)和库蚊属(Culex)等均具有很高的毒性(喻子牛.苏云金杆菌.北京：科学出版社，1990)。

2、苏云金芽胞杆菌YBT-008杀虫晶体蛋白编码基因的分析

(1)苏云金芽胞杆菌YBT-008总质粒的抽提

苏云金芽胞杆菌YBT-008经过夜活化后，按1/100(v/v)的接种量转接至5mL新鲜的LB培养基中，28℃，200rpm培养至对数中期。STE溶液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA(pH 8.0))洗涤菌体1次后，加入90μL溶液I(50mmol/L蔗糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA)悬浮菌体，再加100mg/mL的溶菌酶(在溶液I中加溶菌酶)10μL，冰浴2h以上；加入200μL新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaOH溶液，1％十二烷基硫酸钠，即SDS)，轻缓混匀后置冰上5～10min；加150μL溶液III(5mol/LKAc溶液60mL，冰乙酸11.5mL，定容至100mL)，混匀后置冰上放5min；12,000rpm离心5min，吸取上清液到一个新的离心管，苯酚/氯仿/异戊醇溶液(体积比为25∶24∶1，v∶v∶v)抽提2次；上清液中加入2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，于室温静置5～10min；12,000离心5min，弃上清，加入70％乙醇，离心洗涤沉淀1次；真空干燥沉淀，用30μL含有20μg/mL RNase的TE溶液(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解沉淀。

抽提得到的总质粒经电泳检测，结果如图6所示。

(2)苏云金芽胞杆菌YBT-008杀虫晶体蛋白基因的PCR验证和序列比对分析

依据EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/)中cyt2Ba(序列登录号AAB63254)、cry11Aa(序列登录号CAD30081)、cry4Aa(序列登录号CAD30148)和cry4Ba(序列登录号BAA00178)的CDS序列分别设计特异性引物对，进行PCR扩增。引物对序列如下。

F-cyt2Ba：5’-CACTGTTCAGGACCTATT-3’

R-cyt2Ba：5’-TATTGCCATAAATCTACC-3’

F-cry11Aa：5’-AGCACCAGCAGACCTATT-3’

R-cry11Aa：5’-CTTGAAGTTGTAATCCCTAA-3’

F-cry4Aa：5’-ACACCCTTAGGACTTGCT-3’

R-cry4Aa：5’-GTGTTCCCAATGTTAGCC-3’

F-cry4Ba：5’-TAATACTCCAACGCCTGAAA-3’

R-cry4Ba：5’-ATGGGAATCCTGACATACGA-3’

25μl PCR反应体系为：10×buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 1μl，10umol/L的上下游引物各0.5μl，模板(YBT-008总质粒)0.5μl，Taq酶0.25μl，补加去离子水至25μl。

PCR扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步55℃复性45s，第4步72℃延伸2.5min；第5步转到第2步继续运行29个重复；第6步72℃延伸5min。

PCR扩增完成之后的电泳检测结果如图7所示，分别扩增得到了507bp(cyt2Ba)、699bp(cry11Aa)、2348bp(cry4Aa)和2341bp(cry4Ba)的特异性DNA片段，与预期目标片段大小一致。

将扩增得到的目标片段通过PCR产物回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司)纯化回收后通过T/A克隆连接到T载体pMD18-T Simple Vector上(购自宝生物工程大连有限公司)，之后将该连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，并涂布氨苄青霉素抗性平板(Amp^R，终浓度为100μg/mL)。将抗性平板置于37℃培养箱中培养12-16h，待转化子长到一定大小以后，通过质粒快检(大肠杆菌质粒快检方法参考：张桂敏等，一种简便快速筛选重组子的方法，湖北大学学报(自然科学版)，2005，27(3)：280-281.)对转化子进行筛选。将筛选到的转化子用5mL的液体LB培养基活化培养，然后抽提质粒进行酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致。最后将筛选到的阳性转化子用5mL的液体LB培养基活化培养，取1mL的过夜培养物送样测序(由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。

cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba扩增片段经测序后得到的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，将其分别与数据库中cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba的CDS序列进行Blast比对，比对结果分别如图8、图9、图10和图11所示。Blast比对结果显示，测序得到的核苷酸序列与数据库中cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4BaCDS序列的同源性均在98％以上，排除测序误差的影响，可以肯定，苏云金芽胞杆菌YBT-008中含有能编码Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba的杀虫晶体蛋白基因。

表2YBT-008 SDS-PAGE切胶样品①的LC-MS结果

表3YBT-008SDS-PAGE切胶样品②的LC-MS结果

表4YBT-008SDS-PAGE切胶样品③LC-MS结果

表5YBT-008SDS-PAGE切胶样品④LC-MS结果

表6YBT-008SDS-PAGE切胶样品⑤LC-MS结果

表7YBT-008SDS-PAGE切胶样品⑥LC-MS结果

Claims (1)

1.一株杀甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)的苏云金芽胞杆菌菌株，其特征在于，所述的菌株为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株YBT-008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011039。

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