BR112013002854B1

BR112013002854B1 - Uso de uma composição nematocida compreendendo bacillus subtilis e bacillus licheniformis, e processos para controle e/ou combate de fitonematoides, e para conferir resistência

Info

Publication number: BR112013002854B1
Application number: BR112013002854-8A
Authority: BR
Inventors: Abilio Alessandri; Inge Knap; Luciana Sekito De Freitas Zambelli
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2010-08-10
Filing date: 2011-08-09
Publication date: 2023-03-07
Also published as: WO2012020014A1; CR20130053A; AU2011288495B2; PL2603086T3; EP2603086A1; US8858933B2; HK1180544A1; MX2013001399A; BR112013002854A2; SI2603086T1; AU2011288495A1; MX338032B; PT2603086T; LT2603086T; EA201390225A1; CN103068247A; CN103068247B; US20150050258A1; US20170049112A1; DK2603086T3

Abstract

COMPOSIÇÃO NEMATOCIDA COMPREENDENDO BACILLUS SUBTILIS E BACILLUS LICHENIFORMIS. A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo Bacillus subtilis (DSM 17231) e Bacillus licheniformis (DSM 17236) com efeito nematicida contra fitonematoides em plantas e/ou seu habitat, a seu uso e processo para sua preparação, uso de Bacillus subtilis (DSM 17231) e Bacillus Licheniformis (DSM 17236), processos para controle, combate e conferência de resistência específica a fitonematoides e um estojo.

Description

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis com efeito nematicida contra fitonematoides em plantas e/ou seu habitat, a seu uso, a um processo para sua preparação, ao uso de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis, a processos para controle, combate e/ou conferência de resistência específica a fitonematoides e a um kit. Particularmente, a invenção refere-se a Bacillus subtilis (DSM 17231) e Bacillus licheniformis (DSM 17236).

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] Intensificação de atividade agricultural causou um desequilíbrio ecológico, tornando necessário uso de produtos seletivos que não afetem o equilíbrio entre pestes e seus predadores, parasitoides e patógenos, responsáveis por muito do controle biológico natural, uma vez que eles retêm os níveis de população de peste aceitáveis (DENT, D., Insect pest management. Cambridge: Cabi Bioscience 2000).

[0003] A fim de reverter essa situação, é recomendado desenvolver programas para controle de peste integrado, definidos como um sistema de decisão para o uso de táticas de controle, sozinhos ou combinados harmoniosamente em uma estratégia de tratamento baseada em custo/benefício que leva em consideração o interesse e/ou impacto sobre fazendeiros, sociedade e ambiente. Dentre as medidas de controle disponíveis para esses sistemas de controle estão nematoides entomopatogênicos e parasitoides de inseto, que cobrem áreas diferentes de controle de peste biológico.

[0004] No presente contexto de uma sociedade moderna e ecológica, que está preocupada com preservação do ambiente, controle biológico é considerado uma alternativa e/ou suplemento atraente para métodos de controle convencionais. Controle biológico é o uso de um organismo (predador, parasita ou patógeno) que ataca outro organismo que está causando dano econômico a culturas. Esta é uma estratégia muito comum em sistemas agroecológicos, bem como em agricultura convencional que se apoia nas Estratégias de Proteção Integrada (Integrated Pest Management (IPM).

[0005] Embora o controle biológico traga respostas positivas na redução ou retirada de uso de pesticida e aprimoramento da renda do fazendeiro, a análise do conjunto de experimentos em todo o mundo mostra que os resultados estão ainda concentrados em apenas algumas culturas. Há ainda muito a desenvolver em áreas de controle de pestes e doenças.

[0006] Tem havido uma grande ênfase em pesquisa sobre controle biológico com o uso de bactérias colonizando as raízes de plantas, chamadas rizobactérias. As rizobactérias benéficas para promoção de crescimento e/ou ação no controle biológico de bactérias patogênicas de planta são chamadas rizobactérias de promoção de crescimento de planta ou PGPR. As PGPR aumentam a disponibilidade de nutrientes para a planta e podem produzir combinações e concentrações de substâncias que promovem crescimento. No entanto, o principal efeito dessas rizobactérias é suprimir patógenos de planta prejudiciais para o crescimento dessas plantas. Inibição dessas bactérias prejudiciais é através da produção de sideróforos, substâncias que agem sob condições de baixa disponibilidade de fósforo através da redução adicional do fósforo disponível para outros micro-organismos da rizosfera ou a produção de antibióticos.

ESTADO DA TÉCNICA

[0007] A pressão da sociedade para substituir os nematicidas por produtos ambientalmente aceitáveis ou técnicas ecológicas encorajou a pesquisa por métodos alternativos para controle de nematoides. Neste contexto, o controle biológico tem sido considerado uma das alternativas dentro de uma abordagem integrada, onde alguém procura assegurar desenvolvimento sustentável da agricultura. O uso de inimigos naturais se tornou um campo de pesquisa, que pode agir para reduzir populações de nematoide abaixo do nível limiar de dano econômico.

[0008] Os riscos para humanos e ambientes apresentados pelo uso de pesticidas sintéticos enfatizam a necessidade de ferramentas tal como controle biológico na otimização de sistemas agriculturais sustentáveis.

[0009] O Pedido de Patente Europeu EP 0705807A1 refere-se a uma preparação bacteriana para condicionamento do solo que compreende bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, tais como Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. A preparação pode prevenir as lesões a raízes de culturas causadas por nematoides.

[00010] O Pedido de Patente Brasileiro BR PI 0604602-9A refere-se ao uso de um Bacillus subtilis em conjunto com Bacillus licheniformis para controle de fitonematoides.

[00011] Siddiqui e Mahmood (1999) descrevem o papel de bactérias no controle de nematoides parasíticos de planta mostrando que Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis podem ser úteis contra fitonematoides, tais como Meloidogyne spp., Heterodera spp. e Rotylenchulus.

[00012] Os inventores da presente invenção prosseguiram com avaliação e pesquisa extensivas a fim de atingir o objetivo de prover métodos biológicos de controle de nematoides com base na identificação de duas linhagens de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis do tipo selvagem, que são particularmente capazes de reduzir lesões a raízes de culturas causadas por nematoides.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00013] Figura 1 - Fluxo das condições de operação dos processos de fabricação de mistura.

[00014] Figura 2 - Porcentagem de inibição de movimento de juvenis após efeito de produtos biológicos. A: Meloidogyne incognita; B: M. javanica, C: M. paranaenses.

[00015] Figura 3 - Porcentagem de inibição de eclosão após efeito de produtos biológicos. A: Meloidogyne incognita; B: M. javanica, C: M. paranaenses.

[00016] Figura 4 - Número médio de juvenis de segundo estágio de Meloidogyne exigua penetrados, porcentagens de penetração e inibição de penetração em raízes de tomate. ‘Santa Cruz Kada Gigante’, três semanas após inoculação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Rizobactérias

[00017] Os solos são a casa de uma comunidade biológica complexa, cujos micro-organismos procariontes e eucariontes formam a maioria, ambos em número e em diversidade. Alguns procariontes têm nichos ecológicos como a rizosfera, e/ou o rizoplano de plantas, onde eles se multiplicam, sobrevivem e se protegem do resto da ação antagonística da microflora do solo. Esses organismos têm sido genericamente chamados rizobactérias.

[00018] Em associação com plantas, as rizobactérias podem ter um efeito prejudicial, nulo ou benéfico. Aquelas que exercem um efeito benéfico - promoção de crescimento e controle biológico de doença - são chamadas PGPR ("Plant Growth-Promoting Rhizobacteria"). É estimado que apenas 0,6% das rizobactérias têm algum efeito benéfico para a planta com a qual elas estão associadas. PGPR como agentes de biocontrole

[00019] PGPR têm sido usados para controle biológico de doenças de planta e então aumentam a produtividade de culturas. Como e por que controle biológico é exercitado é ainda um tópico que precisa de estudos complementares.

[00020] Em algumas situações, é possível que controle biológico ocorra através de antagonismo direto exercido pela PGPR contra o patógeno, com envolvimento dos mecanismos conhecidos de antibiose: produção de substâncias antimicrobianas, parasitismo direto, competição por nutrientes e nichos ecológicos. Pesquisa mostrou que certas PGPR parecem agir como elicitador de ISR (resistência sistêmica induzida) (Induced Systemic Resistance), no sentido que a planta se torna sistemicamente protegida contra mais de um patógeno, diferente do controle biológico clássico, que tem como objetivo implementar o controle mais especificamente.

[00021] Quando PGPR coloniza o sistema de raiz, as moléculas constituintes da célula bacteriana ou sintetizadas por ela agem como elicitadores de um sinal bioquímico. Este sinal é translocado para sítios distantes do sítio de sua origem. Genes codificando a síntese de componentes da resistência dinâmica são desabilitados e expressos na resistência sistêmica induzida.

[00022] Algumas rizobactérias produzem metabolitos tóxicos que afetam o movimento de nematoides in vitro, enquanto outras inibem a eclosão de juvenis e o processo através do qual eles penetram nas raízes. Efeito de rizobactérias sobre nematoides parasíticos de planta

[00023] O controle que as rizobactérias exercem sobre nematoides pode ser implementado de várias maneiras e pode afetar fases diferentes do ciclo de vida do nematoide: - Ovo: Antibióticos e toxinas produzidos por bactérias na rizosfera difundem para o solo e podem ser absorvidos pelos ovos dos nematoides, matando células e prevenindo seu desenvolvimento embriônico. - Eclosão: Rizobactérias degradam os exudatos de raiz que agem como fator de eclosão para muitas espécies de nematoides e então há a possibilidade que compostos absorvidos pelo ovo do nematoide inativem ou causem deformação durante desenvolvimento que previnem eclosão. - Direcionamento e mobilidade: A transformação de exudatos de raiz nos subprodutos metabólicos de rizobactérias pode fazer com que o nematoide simplesmente não reconheça o estímulo quimiotrópico, então ele continuaria a se mover aleatoriamente, e eventualmente esgotaria suas reservas de energia e morreria sem entrar na raiz. Se o nematoide reconhecer os exudatos da raiz e se mover em direção à raiz, alguns produtos bacterianos podem apresentar características nematostáticas e reduzir a mobilidade do nematoide para impedir que ele atinja a raiz. - Reconhecimento do hospedeiro: Substâncias produzidas por rizobactérias são absorvidas pelas raízes e podem alterar sua composição química, fazendo com que os nematoides não reconheçam seu hospedeiro. É também acreditado que as rizobactérias se liguem a lectinas na superfície de raízes, caracterizadas por serem o sítio de ligação entre o nematoide e sua planta hospedeira, desta maneira prevenindo reconhecimento. - Penetração na raiz: toxina ou repelente produzido por rizobactérias em alta concentração na região do rizoplano ou no teor celular da epiderme de raízes pode desencorajar a penetração de nematoides na planta hospedeira. - Alimento: as rizobactérias, ou seus produtos metabólicos, podem ser absorvidos pela planta e a última perceber a presença do nematoide, disparar uma reação hipersensível em células gigantes, que é o mecanismo principal de resistência do hospedeiro contra nematoides do gênero Meloidogyne. Essa resistência, chamada resistência sistêmica, não é intrínseca para a planta, isto é, uma reação que é induzida nela pela presença de PGPR. - Reprodução: Algumas rizobactérias têm um efeito maior sobre a redução de ovos do que na redução do número de verrugas, isto pode ser um dos mecanismos de operação.

O ambiente da rizosfera

[00024] Um dos métodos mais convenientes de introdução de uma rizobactéria no ambiente da raiz é através da aplicação às sementes antes da semeadura. O processo de germinação de semente libera carboidratos e aminoácidos em abundância na forma de exudatos de semente. Desta maneira, esses organismos introduzidos com as sementes no solo utilizam exudatos como uma fonte de nutrição e colonizam as raízes conforme elas emergem. Isolatos de rizobactérias que têm habilidade maior em utilizar exudatos de raiz de sementes podem ter vantagem seletiva na colonização de raízes.

[00025] Rizobactérias do gênero Bacillus foram associadas com controle de nematoide. Sikora, R.A. ("Interrelationship between plant health promoting rhizobacteria, plant parasitic nematodes and soil micro-oganisms". Medicine Faculty Landbouww Rijksuniv Gent., Landbouww, v. 53, n. 2b, p. 867-878, 1988) observou reduções em infecção por Meloidogyne arenaria, M. incognita e Rotylenchulus reniformis em torno de 60-65% com tratamento de sementes de várias culturas com uma linhagem de Bacillus.

Vantagens de rizobactérias para aplicação comercial

[00026] As rizobactérias têm várias vantagens sobre nematicidas ou até mesmo sobre outros agentes de controle biológico: elas são fáceis de produzir em massa, elas são fáceis de armazenar, elas são adaptáveis à tecnologia de formulação e não requerem nenhuma manipulação genética.

[00027] As rizobactérias podem ser aplicadas através de tratamento do substrato, imersão dos sistemas de raiz da muda em suspensões bacterianas, molhando a planta com suspensão bacteriana através de mergulho das sementes em suspensão de rizobactérias ou através da aplicação de PGPR com a peletização das sementes em alginato.

Bactérias do gênero Bacillus

[00028] A espécie Bacillus são bactérias Gram-positivas caracterizadas por terem paredes de célula espessas e a ausência de membranas externas, o que difere das bactérias Gram-negativas. Grande parte das paredes de bactérias Gram-positivas é composta de peptidoglicano.

[00029] Espécies Gram-positivas são divididas em grupos de acordo com suas características morfológicas e bioquímicas. O gênero Bacillus é pertencente ao grupo de bactérias esporuladas. Espécies com estruturas de formação de esporo que são resistentes a mudanças ambientais, suportam calor seco e certos desinfetantes químicos por períodos de tempo moderados. Elas persistem por anos em terra seca.

Uso de Bacillus spp. no controle de nematoides

[00030] Nematoides são responsáveis por perdas severas em produção agricultural. As perdas estimadas estão em torno de $ 100 bilhões por ano em todo o mundo em culturas economicamente importantes.

[00031] O uso de cultivares resistentes a nematoides não é sempre possível devido à perda de fontes de resistência para reprodução, falta de adaptabilidade de cultivares resistentes a certas regiões e estações de plantio ou a colapso de resistência em condições de campo. Controle químico de nematoides não é geralmente recomendado porque ele não é muito eficaz; é caro, por causa do resíduo que ele deixa em alimento e a contaminação ambiental que ele causa. Devido a essas desvantagens, há uma grande pressão da sociedade para restringir o uso de agentes químicos, o que resulta em uma demanda pelos fazendeiros quanto a produtos que sejam ao mesmo tempo não tóxicos para humanos e animais, baratos e controlem com bastante eficácia os nematoides.

[00032] Muitos micro-organismos do solo são conhecidos como parasitas ou predadores de nematoides. A ação desses microorganismos pode resultar de efeito direto ou indireto através da interferência com etapas no ciclo de vida do patógeno.

Bacillus subtilis

[00033] O efeito benéfico de B. subtilis, quando aplicado próximo da semente ou do solo, não é apenas devido ao antagonismo fornecido a patógenos. A bactéria tem uma influência positiva sobre germinação, desenvolvimento e rendimento de cultura devido também à produção de substâncias que promovem crescimento e aprimoramento em nutrição de planta através da solubilização de fósforo.

Gênero Meloidogyne

[00034] Nematoides do gênero Meloidogyne (nematoides do nó da raiz) exibem grande diversidade sobre hospedeiros de planta e ocorrem em várias regiões do globo, causando perdas em culturas diferentes. O principal sintoma é a presença de verrugas em raízes de planta. Essas verrugas são má formações ou espessamento do sistema de raiz. As plantas afetadas se mostram fracas, têm baixa produção, desfolhação precoce e declínio prematuro, e pode haver ocasionalmente morte da planta, com sintomas potencializados sob condições de estresse de nutriente e seca.

[00035] Inicialmente, os juvenis de segundo estágio (J2) de Meloidogyne penetram nas raízes e estabelecem um sítio de alimentação na região do cilindro central de raízes. Através do desenvolvimento de nematoides, os J2 se diferenciam em machos ou fêmeas adultos. Machos adultos deixam o sistema de raiz e as fêmeas permanecem nas raízes. Durante o desenvolvimento da fêmea Meloidogyne, aproximadamente 500 ovos são postos. Eles são depositados em uma matriz gelatinosa fora das raízes dos quais os J2 eclodem, e eles então reinfectam o sistema de raiz. O ciclo de vida de nematoides do nó da raiz é de aproximadamente quatro semanas e pode se estender sob condições de temperatura menos favoráveis. Temperaturas abaixo de 20°C ou acima de 35°C e condições de seca ou redução de água do solo reduzem o desenvolvimento e a sobrevivência do nematoide.

[00036] O controle de Meloidogyne incognita e M. javanica pode ser feito com o uso de agentes químicos que contêm certos ingredientes ativos tais como carbofurano, etoprofos, aldicarbe, metam-sódio ou fenamifos, dentre outros, dependendo da cultura em questão. A prática de rotação de cultura é também importante no controle devido ao posicionamento estratégico de culturas não hospedeiro tais como amendoins, abacaxi, arroz ou uso de espécies de planta como cobertura de solo também não hospedeiro tais como aveias.

[00037] O nematoide Meloidogyne exigua é muito agressivo e é muito disseminado nas plantações. Métodos diferentes de controle químico em áreas infestadas por M. exigua incluem o uso de agentes químicos que contêm qualquer um dos ingredientes ativos terbufos ou carbofurano, dependendo do tipo de cultura. Dentre as culturas não hospedeiras, as principais são algodão, amendoins, arroz e aveias.

[00038] Tal como M. exigua, M. paranaenses é disseminado na cultura de café, mas não é muito problema em outras culturas. Para seu controle, resultados positivos foram obtidos pelo fungo Paecilomyces lilacinus e isto reduziu as populações de nematoide em raízes do tomate "Santa Clara" na estufa.

[00039] O uso de rizobactérias em relação a controle biológico já é conhecido. No entanto, a Requerente desenvolveu aqui uma composição compreendendo duas espécies de Bacillus, a saber: Bacillus subtilis DSM 17231 (também conhecido como DSM 5750) ou um mutante do mesma e Bacillus licheniformis DSM 17236 (também conhecido como DSM 5749) ou um mutante do mesmo com efeito nematicida contra fitonematoides em uma cultura de planta.

[00040] Desta maneira, o primeiro aspecto da invenção refere-se às novas linhagens descritas aqui ou mutantes das mesmas.

[00041] Está claro para o versado na técnica que, usando as linhagens depositadas como material de partida, o leitor versado pode obter rotineiramente mutantes adicionais ou derivados das mesmas através de mutagênese convencional ou técnicas de reisolamento que retêm as características e vantagens relevantes descritas aqui. Desta maneira, o termo "um mutante da mesma" do primeiro aspecto refere- se a linhagens mutantes obtidas usando a linhagem depositada como material de partida.

[00042] Fitonematoides são amplamente considerados qualquer nematoide tendo um impacto negativo sobre culturas comerciais. Nematoides que podem ser combatidos usando a composição da presente invenção incluem nematoides dos gêneros: Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Globodera, Ditylenchus, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus, Helicotylenchus e Belonolaimus. Espécies do gênero Meloidogyne são consideradas de relevância particular uma vez que elas são responsáveis por em torno de 95% de todas as infestações em culturas causando aproximadamente 5% de perdas de cultura em todo o mundo. A composição da presente invenção pode, além dos componentes ativos, conter excipientes e/ou veículos agroquímicos aceitáveis. A composição da invenção compreende ainda carreadores, veículos e/ou adjuvantes agroquimicamente aceitáveis.

[00043] A composição da presente invenção serve particularmente para combater nematoides em plantas de cultura.

[00044] Dentre as principais culturas de plantas estão cana-de- açúcar, café, sojas, algodão, milho, batatas, tomates, tabaco, banana, arroz, trigo, abacate, abacaxi, abóbora, cacau, coco, aveias, cebola, alface, beterraba, cenoura, aipim, feijões, girassol, pimenta, nabo, maçã, morango, quiabo, rabanete e cebola.

[00045] Com relação à fruticultura: cítricos, uva, goiaba, mamão papaya, figo, pêssego, ameixa e nêspera são de relevância particular e com relação à horticultura: berinjela e crucíferas.

[00046] Com relação à floricultura: rosa, crisântemo, lisianto, gérbera, amarílis, begônia e celosia.

[00047] A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo Bacillus subtilis DSM 17231, ou um mutante da mesma, e Bacillus licheniformis DSM 17236, ou um mutante da mesma, e a um estojo compreendendo a composição, ou preparada através do processo de preparação da composição, bem como instruções e um recipiente adequado.

[00048] Um processo para preparação de uma composição compreendendo Bacillus subtilis DSM 17231, ou um mutante da mesma, e Bacillus licheniformis DSM 17236, ou um mutante da mesma, junto com carreadores, veículos e/ou adjuvantes agroquimicamente aceitáveis e uso da dita composição para controle, combate e/ou conferência de resistência específica a fitonematoides são também dados.

[00049] Ainda, a invenção refere-se ao uso de quantidades eficazes de Bacillus subtilis DSM 17231, ou um mutante da mesma, e Bacillus licheniformis, DSM 17236, ou um mutante da mesma, na fabricação de uma composição agroquímica com efeito nematicida contra fitonematoides em uma cultura de planta, bem como processos para controle, combate e/ou conferência de resistência específica a fitonematoides.

[00050] Os exemplos ilustrativos apresentados abaixo servem para descrever melhor a presente invenção. No entanto, as formulações descritas referem-se apenas até certo ponto a algumas modalidades da presente invenção e não devem ser consideradas como limitantes do seu escopo. EXEMPLOS Composição da invenção Bacillus subtilis (DSM 17231): 1,6 x 1010 ufc/g Bacillus licheniformis (DSM 17236): 1,6 x 1010 ufc/g

[00051] A composição pode ser empregada como pó umectante. No entanto, a composição pode ser também provida em qualquer outra forma adequada, por exemplo, como um pó, solução, pasta fluida, grânulos, etc.

Condições de operação dos processos de fabricação de mistura:

[00052] Ingredientes/materiais de recebimento: A recepção é realizada por pessoal treinado para verificação e checagem de produtos recebidos. De acordo com alvos de produção, uma lista de ingredientes e suas quantidades é expedida, e a informação é enviada para a fábrica.

[00053] Pesagem de ingredientes/materiais: Os ingredientes são recebidos na fábrica, pesados e postos em um misturador de aço inoxidável.

[00054] Mistura: Os ingredientes são misturados seguindo o tratamento descrito em SOP (Procedimento de Operação Padrão) (Standard Operating Procedure).

[00055] Análise: Amostras são coletadas para contagem do número de colônias em CFU/g.

[00056] Engarrafamento: O produto é empacotado em bolsas com papel de proteção interno contendo 20 kg ou potes de plástico de polietileno contendo 1,0 ou 5,0 kg.

[00057] Fechamento: As bolsas são vedadas e costuradas. Os potes são vedados com tampa e passados por indução magnética.

[00058] Paletização: Ainda na fábrica as embalagens são postas em paletes de madeira esperando por revisão pelo Controle de Qualidade (QC) (Quality Control).

[00059] Estocagem: O produto final é armazenado, vedado e apropriadamente identificado. Cada batelada é registrada em um programa eletrônico, disponível para todos os operadores em cada setor de interesse.

[00060] Despacho: Uma vez liberado pelo QC, o produto permanece armazenado no depósito de despacho até a hora da venda. Este fluxo é mostrado na Figura 1.

Testes in vitro: Teste 1

[00061] Objetivo: Avaliar o efeito in vitro de produtos biológicos baseados em bactérias Bacillus no controle de fitonematoides, a saber, Meloidogyne incognita, M. javanica e M. paranaenses.

Materiais e Métodos

[00062] A requerente estudou três espécies de fitonematoides do gênero Meloidogyne: M. incognita, M. javanica, M. paranaenses e dois produtos biológicos em duas doses diferentes: Um produto Japonês baseado em uma espécie Bacillus e o produto Nemix® composto de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis, lactose 97,8% e dióxido de silício. O nematicida usado como um padrão de eficácia foi 150G TEMIK® (aldicarbe), cujas características são: - Marca registrada: TEMIK® 150 - Dona do registro: Bayer CropScience Ltd. - Grau(s): Miticida - inseticida - nematicida - Formulação: GR- Granular - Ingrediente ativo (i.a.) aldicarbe - Concentração de i.a.: 150 g/Kg - Método de aplicação: terrestre - Modo de emprego: solo - Classificação toxicológica: I - Tóxico exemplar O experimento teve seis tratamentos: - Água: controle absoluto; - P1D2: Produto Japonês em uma dose de 2 kg.ha-1; - P1D4: Produto Japonês em uma dose de 4 kg.ha-1; - Produto Nemix em uma dose de 2 kg.ha-1; - Produto Nemix em uma dose de 4 kg.ha-1; - Nematicida aldicarbe (TEMIK® 150G) em uma dose de 15 kg.ha-1. Teste para avaliação de produtos na atividade do nematoide:

Obtenção de juvenis de 2° estágio de Meloidogyne

[00063] Raízes de café e tomate infectadas pela espécie Meloidogyne foram lavadas para remover excesso de solo aderido a elas, cortadas e processadas através da técnica de misturador (BONETI, J. I. S. & FERRAZ, S.: "Modificação de método de Hussey e Barker para extração de ovos de Meloidogyne exigua de raízes de cafeeiro". Fitopatologia Brasileira, Brasília, DF, v. 6, n. 3, 553p, 1981).

[00064] As raízes foram cortadas em fragmentos de cerca de 1 cm de comprimento, foram postas em um misturador, cheio com uma solução de hipoclorito de sódio cloro ativo 0,5% para cobrir o material. O misturador foi ligado em sua velocidade mais baixa por 40 segundos em média. Então a suspensão obtida foi passada por uma peneira de 100 mesh posta em cima de uma de 500 mesh. O refugo foi coletado de uma peneira de 500 mesh com o auxílio de jatos de água de uma garrafa de espremer para um copo de Becker, cuidadosamente de maneira que o volume final fosse concentrado o máximo possível.

[00065] As suspensões foram centrifugadas por 5 minutos em uma velocidade de 650 gravidades. Cuidadosamente, o sobrenadante foi descartado e a parede interna do tubo da centrífuga foi limpa para remover impurezas orgânicas.

[00066] Ao resíduo de cada tubo uma solução de sacarose (de uma concentração de 454 g de açúcar para um litro de água) foi adicionada, misturada bem e a centrífuga foi ligada na mesma velocidade por 1 minuto conforme descrito antes.

[00067] O sobrenadante foi despejado através de uma peneira de 500 mesh, lavado com água para remover sacarose em excesso e coletado com a ajuda de jatos de água de uma piseta em um copo de Becker.

[00068] Placas de Petri com um diâmetro de 5 cm tinham dentro uma camada contendo náilon de papel de seda facial. A suspensão de ovos foi adicionada à camada de papel de seda e as placas de Petri foram postas em incubadora a 30°C por 24 horas. Depois de 24 horas, a tela com o tecido foi suspensa com auxílio de fórceps e o fluido dentro da placa de Petri foi removido para uma placa de Becker e lavado com água. A tela foi substituída com uma placa de papel e água foi adicionada. As placas permaneceram na incubadora por 48 h.

[00069] Depois de 48 h, as telas foram removidas e o líquido coletado com o auxílio de jatos de água de uma piseta para um copo de Becker. A suspensão foi calibrada para conter 250, 50, 20 e 100 juvenis de 2° estágio/mL de Meloidogyne incognita, M. javanica e M. paranaenses para montagem de teste in vitro, respectivamente.

Instalação e avaliação do in vitro

[00070] Placas de Petri com um diâmetro de 11 cm contendo uma camada de água-ágar 2% receberam 1 mL da suspensão de juvenil de 2° estágio e 1 mL de cada tratamento a ser testado: solução de água destilada TEMIK® 150G (nematicida); solução do produto Japonês à base de Bacillus em duas resistências; solução Nemix do produto em duas resistências. Com rotação, os dois foram totalmente misturados mL. As placas foram mantidas na incubadora a 30°C por 7 dias.

[00071] Depois de 7 dias, cada placa foi examinada sob uma lupa para verificação e contagem de ativos de nematoides.

Testes quanto à avaliação da inibição de eclosão de juvenil no estágio 2 de Meloidogyne

[00072] Raízes de tomate e café foram preparadas para o misturador (BONETI, J. I. S.; FERRAZ, S.: "Modificação de método de Hussey e Barker para extração de ovos de Meloidogyne exigua de raízes de cafeeiro". Fitopatologia Brasileira, Brasília, DF, v. 6, n. 3, 553 p., 1981), previamente descrito na seção "Obtenção de juvenis de 2° estágio de Meloidogyne".

[00073] As suspensões foram calibradas para conter 1500 ovos/mL, 100 ovos/mL, 500 ovos/mL e 200 ovos/mL de M. incognita, M. javanica e M. paranaenses, respectivamente.

Instalação e avaliação do in vitro

[00074] Placas de Petri com um diâmetro de 5 cm, contendo em seu interior tecido de náilon com uma camada de papel de seda umedecido, receberam 1 mL de cada tratamento sendo testado e 1 mL da suspensão de ovos. As placas foram mantidas em incubadora a 30°C por 7 dias.

[00075] Depois de 7 dias, as telas foram removidas e o líquido de cada placa foi coletado, usando jatos de água de uma piseta para um vidro.

[00076] Cada suspensão foi examinada sob o microscópio com o auxílio de uma câmara de contagem para verificação e contagem de J2 de Meloidogyne.

Projeto e Análise Estatística

[00077] O experimento era um projeto completamente aleatorizado com seis tratamentos e cinco réplicas para cada nematoide. Cada placa de Petri era a unidade experimental.

[00078] Os dados foram submetidos ao programa de procedimentos estatísticos Sisvar (FERREIRA, D.F.; "Análise estatística por meio do Sisvar para Windows versão 4.0". Em: REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45, 2000, São Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-258, 2000). Em análise estatística, os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Scott-Knott em 5% de probabilidade. (Os resultados não mostrando nenhuma diferença estatisticamente significante são marcados com letras minúsculas idênticas nas figuras).

[00079] Na avaliação do efeito de pesticidas em controle de nematoides, foram calculadas inibição percentual de movimento e inibição percentual de eclosão de juvenis. A fórmula usada no cálculo dessas porcentagens foi como segue: (B-A) x 100 onde: B A = número de nematoides ativos ou eclodidos em cada repetição de cada tratamento. B = número de nematoides usados no ensaio para avaliar inibição de movimento ou a inibição de eclosão.

Resultados e Discussão

[00080] As Figuras 2 e 3 ilustram o efeito inibidor de nematocidas diferentes sobre movimentos (Figuras 2) e eclosão (Figuras 3) dos nematoides M. incognita (A), M. javanica (B) e M. paranaenses (C).

[00081] Os dados apresentados na Figura 2A ilustram que apenas o nematicida TEMIK® diferiu significantemente de outros tratamentos caracterizando o melhor resultado para mortalidade e inibição de eclosão de juvenil de M. incognita. Com relação à inibição de eclosão de juvenis, foi observado que os tratamentos não diferiram do controle e apenas o tratamento químico com TEMIK® reduziu eclosão.

[00082] Para a inibição de Meloidogyne javanica nenhuma diferença significante foi observada entre os produtos biológicos testados e TEMIK®, mostrando que os produtos biológicos tiveram efeito satisfatório sobre a inibição de movimento do nematoide (Figura 2B). O efeito sobre eclosão não foi significante e apenas o produto químico TEMIK inibiu eclosão (Figura 3B).

[00083] Para a inibição de Meloidogyne paranaenses a dose de Nemix de 4 kg ha-1 deu um resultado significantemente igual a nematicida (Figura 2C). Em seguida, os produtos Japoneses estão em doses de 2 e 4 kg ha-1 e Nemix em uma dose de 2 kg ha-1, e todos os produtos orgânicos tinham efeito maior do que o tratamento controle. Com relação à inibição de eclosão de juvenis, o produto Nemix com duas doses teve efeitos similares mostrando os melhores resultados dentre os produtos biológicos testados (Figura 3C). Todos os produtos testados diferiram do controle absoluto e o efeito nematicida foi superior a todos os outros tratamentos.

[00084] Os produtos TEMIK® e Nemix em uma dose de 4 kg ha-1 foram os mais eficazes e não diferiram significantemente com relação à mortalidade de M. paranaenses. Com relação à inibição de eclosão, TEMIK® diferiu significantemente de todos os outros tratamentos sendo superior a eles. No entanto, o produto Nemix foi mais eficaz do que o produto Japonês (Figura 3C).

[00085] Desta maneira, a composição Nemix mostrou uma inibição significante dos nematoides M. javanica e M. paranaenses, uma inibição comparável ao produto químico TEMIK.

Teste 2

[00086] Objetivo: avaliar a penetração de Meloidogyne javanica em raízes de tomate em relação a doses diferentes do produto biológico Nemix compreendendo Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis sob condições de estufa.

Obtenção do inóculo

[00087] Obtenção do inóculo foi feita a partir de processamento de amostra de raízes de café infectadas por M. javanica. As amostras foram levadas para o Agricultural Nematology Laboratory of Institute of Agricultural Sciences e para processamento, as raízes foram cortadas em fragmentos de 2 cm e postas em um copo de misturador doméstico contendo solução de hipoclorito de sódio (1 parte alvejante : 4 partes de água).

[00088] A solução foi girada por 20 segundos. Depois deste período, a suspensão foi passada por um conjunto de peneiras de 200 e 500 mesh, respectivamente, sobrepostas. O resíduo da peneira de 500 mesh foi coletado com o auxílio de uma garrafa de espremer com água para um béquer. A suspensão obtida foi calibrada para conter 800 ovos de nematoide.mL-1.

Instalação e teste de condução

[00089] O projeto experimental era projeto completamente aleatorizado com cinco tratamentos e cinco réplicas.

[00090] A cultivar de tomate usada foi ‘Santa Cruz Kada Gigante’, com doses usadas do produto biológico NEMIX de 4, 6 e 8 kg ha-1. O nematicida aldicarbe (TEMIK® 20 G 150 kg ha-1) foi usado como uma checagem padrão e controle sem nenhum produto de tomate e o nematoide parasítico de planta M. javanica para a penetração padrão.

[00091] As sementes da cultivar de tomate ‘Santa Cruz Kada Gigante’ foram semeadas em bandejas de isopor de 128 células cheias com substrato Plantmax®. Para inoculação, três buracos foram abertos com 2 cm de profundidade e espaçados 2 cm do caule da muda. Nesses três buracos foram distribuídos 5 ml de inóculo calibrado em suspensão (4000 nematoide/copo plástico). Logo em seguida, três doses dos produtos foram adicionadas em copos plásticos pequenos em buracos abertos em torno de cada muda.

Avaliação da penetração de juvenil de segundo estágio de M. javanica em raízes de tomate

[00092] A avaliação foi feita após 3 semanas de inoculação, onde as raízes após corte dos brotos e a separação de solo foram preparadas para tingimento de nematoides em tecidos de planta (Byrd, Jr. e outros, "An improved technique for clearing and staining plant tissues for detection of nematodes". Journal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, p. 142-143, 1983). As raízes foram quebradas em pedaços de 1-2 cm e transferidas para um copo de Becker de 50 mL de água ao qual foram adicionados 20 mL de alvejante comercial (NaOCl 5,25%), que resultou em uma concentração final de NaOCl 1,5%. Os segmentos de raiz permaneceram por 6 min nesta solução, promovendo uma agitação manual por 10 s em intervalos de 1 min. As raízes foram lavadas sob água corrente por 30 a 45 s e mantidas em descanso por 15 s em água para remover hipoclorito de sódio residual.

[00093] Então, houve drenagem completa e adicionados 30 mL de água destilada mais 1 mL de solução corante (3,35 g de fucsina ácida + 25 mL de ácido acético glacial + 75 mL de water style). As raízes desta solução foram aquecidas para o ponto de ebulição, deixando-as por 30 segundos em ebulição, e logo depois o recipiente foi posto no contador para ir para a temperatura ambiente. Subsequentemente, foi removido o que restou da solução corante e o material foi lavado em água da torneira e posto em 20-30 mL de glicerina acidificada com algumas gotas de HCl 5N. Os segmentos de raiz foram prensados entre lâminas de microscópio e observados em microscópio óptico. Os juvenis de segundo estágio que penetraram as raízes foram contados.

Análise estatística

[00094] Os dados foram submetidos a programa de procedimentos estatísticos SISVAR (FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. Em: REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45, 2000, São Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-253, 2000). Em análise estatística, as médias foram comparadas pelo teste Turkey em 5% de probabilidade.

Resultados e Discussão

[00095] A partir dos dados apresentados na Tabela 3 parece que a penetração de juvenis de segundo estágio de M. javanica foi afetada em todos os tratamentos quando comparado com o controle sem nenhum produto. Tratamento com produto aldicarbe para 20 kg ha-1 mostrou a penetração mais baixa. Das doses diferentes de NEMIX, a melhor foi 8 kg ha-1, que proveu inibição maior do que as outras doses testadas.

[00096] Tabela 3 - Número de juvenis de segundo estágio de Meloidogyne javanica penetrados e porcentagem de penetração em cultivar de raízes de tomate. ‘Santa Cruz Kada Gigante’, 3 semanas depois da inoculação. Uberlândia, UFU, 2007.

C.V. (%) = 12,5 *Média de cinco repetições **Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem uma da outra pelo teste Tukey em 5% de probabilidade ***% de Penetração: No de J2/4.000 ovos

[00097] Foi constatado que a porcentagem de penetração de nematoides variou de 0,26 para a dose de aldicarbe e 2,13 para o controle sem aplicação de produto.

[00098] Com relação ao produto biológico, este pode ter agido na orientação de juvenis de segundo estágio de M. javanica causando dispersão de juvenis, impedindo sua penetração, ou tal redução pode ter sido causada por interferência no processo de eclosão de juvenis de M. javanica. Há ainda a possibilidade que compostos absorvidos pelo ovo inativaram nematoide ou causaram deformação durante desenvolvimento que previne eclosão.

[00099] Dentre as três doses que avaliaram o produto biológico com base em Bacillus spp., a dose de 8 kg ha-1 mostrou melhores resultados na redução da penetração de juvenis de segundo estágio de M. javanica em raízes da cultivar de tomate ‘Santa Cruz Kada Gigante’ com penetração de 0,72 por cento.

Teste 3

[000100] Objetivo: Avaliar a penetração de Melodoigyne exigua nas raízes de tomate expostas a doses diferentes de produto biológico com base em Bacillus spp. sob condições de estufa.

Obtenção do inóculo

[000101] A obtenção do inóculo foi feita a partir do processamento da amostra de raízes de café infectadas por M. exigua. As amostras foram levadas para o Agricultural Nematology Laboratory of Institute of Agricultural Sciences e para processamento, as raízes foram cortadas em fragmentos de 2 cm e postas em um copo de misturador doméstico contendo solução de hipoclorito de sódio (1 parte de alvejante : 4 partes de água).

[000102] Houve moagem na rotação inferior por 20 segundos. Depois deste período, a suspensão foi passada por um conjunto de peneiras de 200 e 500 mesh, respectivamente, sobrepostas. O resíduo da peneira de 500 mesh foi coletado, com o auxílio de uma garrafa de espremer com água em um béquer (BONETI, J. I. S.; FERRAZ, S., "Modificação de método de Hussey e Barker para extração de ovos de Meloidogyne exígua de raízes de cafeeiro". Fitopatologia Brasileira, Brasília, DF, v.6, n.3, 553p., 1981). A suspensão obtida foi calibrada para conter 800 ovos de nematoide/mL.

Instalação e teste de condução

[000103] O projeto experimental era projeto completamente aleatorizado com cinco tratamentos e cinco réplicas. O genótipo do tomate usado foi o ‘Santa Cruz Kada Gigante’, com as doses usadas do produto à base de Bacillus (NEMIX®) de 4, 6 e 8 kg ha-1, nematicida Aldibarbe (Temik® 150 G) em uma dose de 20 kg de produto comercial por hectare como uma checagem padrão e plantas de tomate controle sem qualquer produto para a penetração padrão.

[000104] As sementes da cultivar de tomate ‘Santa Cruz Kada Gigante’ foram semeadas em bandejas de isopor de 128 células e depois de 8 dias, as mudas foram transplantadas para copos plásticos com capacidade de 500 mL cheios com substrato Plantmax®. Para inoculação, três buracos foram abertos com 2 cm de profundidade e espaçados 2 cm do caule da muda. Nesses três buracos foram distribuídos 5 ml de inóculo calibrado em suspensão (4000 nematoides/copo plástico). Logo em seguida, as doses do produto à base de Bacillus spp. foram adicionadas em copos plásticos com uma garrafa de espremer. O nematicida aldicarbe foi também adicionado imediatamente após inoculação, ranhura aberta em torno de cada muda.

Avaliação da penetração de juvenis de segundo estágio de M. exigua em raízes

[000105] A avaliação foi feita após 3 semanas de inoculação, onde as raízes depois do corte dos brotos e a separação do solo foram preparadas para tingimento de nematoides em tecidos de planta (Byrd, Jr. e outros, "An improved technique for clearing and staining planta tissues for detection of nematodes". Journal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, p. 142-143, 1983). As raízes foram quebradas em pedaços de 1-2 cm e transferidas para um copo de Becker contendo 50 mL de água ao qual foram adicionados 20 mL de alvejante comercial (NaOCl 5,25%), que resultou em uma concentração final de 1,5% de NaOCl. Os segmentos de raiz permaneceram por 6 min nesta solução, promovendo uma agitação manual por 10 s em intervalos de 1 min. As raízes foram lavadas sob água corrente por 30 a 45 s e são mantidas em repouso por 15 s em água para remover hipoclorito de sódio residual.

[000106] Então, houve drenagem completa e adicionados 30 mL de água destilada mais 1 mL de solução corante (3,35 g de fucsina ácida + 25 mL de ácido acético glacial + 75 mL de water style). As raízes desta solução foram aquecidas para o ponto de ebulição, deixando-as por 30 segundos em ebulição, e logo depois o recipiente foi posto no contador para atingir temperatura ambiente. Subsequentemente, a requerente removeu o corante restante e o material foi lavado em água da torneira e posto em 20-30 mL de glicerina acidificada com algumas gotas de HCl 5N. Os segmentos de raiz foram prensados entre lâminas de microscópio que foram observadas no microscópio óptico. A requerente observou os fragmentos de raiz e determinou o número de juvenis de segundo estágio que penetraram nas raízes de tomate. Temperaturas máximas e mínimas de ar dentro da estufa

[000107] As temperaturas máximas e mínimas diárias de ar dentro da estufa foram registradas para os propósitos de cálculo de média para o período do experimento.

[000108] As temperaturas máximas e mínimas médias de ar foram 35,9°C e 153°C, respectivamente.

Análise estatística

[000109] Os dados foram submetidos ao programa de procedimentos estatísticos SISVAR (FERREIRA, D.F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. Em: REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45, 2000, São Carlos, Anais. São Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-258, 2000), verificando a homogeneidade de variância e normalidade de erros. Em análise estatística, as médias foram comparadas pelo teste Tukey em nível de probabilidade de 5%.

Resultados e Discussão

[000110] A partir dos dados apresentados na Tabela 4 e ilustrados na Figura 3, parece que a penetração de juvenis de segundo estágio de M. exigua foi significantemente afetada em todos os tratamentos quando comparado com o controle sem nenhum produto. Tratamento com o produto aldicarbe (TEMIK) para 20 kg ha-1 foi a penetração mais afetada. Dentre as doses de produto NEMIX, a melhor foi 8 kg ha-1, que mostrou porcentagem maior de inibição 54,13% comparado com o nematicida aldicarbe que mostrou uma inibição significante de 81,95%.

[000111] Tabela 4. Número de juvenis de segundo estágio de Meloidogyne exigua penetrados, a porcentagem de penetração e a porcentagem de inibição em raízes de tomate. ‘Santa Cruz Kada Gigante’ três semanas depois da inoculação. Uberlândia, UFU, 2007.

C.V (%) 13,04 *Média de cinco repetições * *Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem umas das outras pelo teste Tukey em 5% de probabilidade * **% Penetração = No. de J2/4.000 ovos * **Valores comparados com a população inicial de 4000 ovos de M. exígua Petição 870220082193, de 09/09/2022, pág. 31/44

[000112] Foi também observado que não houve nenhuma diferença em efeito entre as doses de 4 e 6 kg ha-1 do produto NEMIX com as porcentagens de penetração de 1,65 e 2,02%, respectivamente. A porcentagem de penetração de nematoides variou entre 0,48 e 2,66% em controle e padrão de controle de penetração, respectivamente, para a população inicial.

[000113] O efeito de pesticidas sobre a migração de M. exigua mostra que há interferência na condução causando a dispersão de juvenis. A redução na presença de juvenis penetrados nas raízes de tomate com relação a controle pode também ter sido devido à interferência nos processos de eclosão e orientação de M. exigua juvenis.

[000114] A hipótese de redução em penetração de nematoide em raízes pode ser explicada como a habilidade da bactéria, que compreende o produto, em juntar-se ou conectar-se às lectinas da superfície, que neste caso podem ser mínimas devido a bactérias gram-positivas.

[000115] As temperaturas dentro da estufa podem também influenciar a penetração de juvenis nas raízes. Alguns autores relatam que a ação antagonista de alguns micro-organismos sobre populações de Meloidogyne spp. é maior em temperaturas variando de 23-25°C do que 18-32°C (AL-HAZMI, A. S.; SCHIMITT, D. P.; SASSER, J. N. "The effect of Arthrobotrys conoides on Meloidogyne incógnita populations densities in corn as influenced by temperature, fungus inoculum density and of fungus introduction in the soil". Journal of Nematology, DeLeon Springs, v. 14, n. 2, p. 168-174, abril, 1982).

[000116] Dentre as três doses testadas do produto à base de Bacillus spp., a dose de 8 kg ha-1 provou ser mais eficaz na redução da penetração de juvenis de segundo estágio de M. exigua em raízes de cultivar de tomate ‘Santa Cruz Kada Gigante’ com a porcentagem de penetração de 1,22% e 54,13% de inibição.

Conclusão

[000117] A combinação específica de uma linhagem de Bacillus subtilis com uma linhagem de Bacillus licheniformis tal como, por exemplo, Bacillus subtilis (DSM 17231) e Bacillus licheniformis (DSM 17236) provou ser uma alternativa consistente para produtos nematocidas químicos e também uma composição aperfeiçoada comparado com produtos biológicos disponíveis. O efeito combinado das duas linhagens é benéfico para inibição dos nematoides que causam perdas de cultura.

Claims

1. Uso de uma composição que compreende como ingredientes ativos um Bacillus subtilis tendo as características da linhagem depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen com No. de acesso DSM 17231 e um Bacillus licheniformis tendo as características da linhagem depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen com No. de acesso DSM 17236 e seus excipientes e/ou veículos agroquimicamente aceitáveis ou obtenível a partir de um processo que compreende misturar, em razões desejadas, quantidades eficazes do Bacillus subtilis e do Bacillus licheniformis para aplicação, junto com carreadores, veículos e/ou adjuvante agroquimicamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de que é para controle, combate e/ou conferência de resistência específica a fitonematoides.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os fitonematoides são selecionados do grupo consistindo em Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Globodera, Ditylenchus, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus, Helicotylenchus e Belonolaimus.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fitonematoide é selecionado do grupo consistindo em Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne exigua, Meloidogyne paranaensis, Heterordera glycines e Pratylenchus zeae.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cultura de planta é selecionada do grupo consistindo em cana-de-açúcar, soja, batata, cenoura, café e banana.

5. Processo para controle e/ou combate de fitonematoides em plantas e/ou seu habitat, caracterizado pelo fato de que compreende permitir que a composição que compreende como ingredientes ativos um Bacillus subtilis tendo as características da linhagem depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen com No. de acesso DSM 17231 e um Bacillus licheniformis tendo as características da linhagem depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen com No. de acesso DSM 17236 e seus excipientes e/ou veículos agroquimicamente aceitáveis aja sobre fitonematoides e/ou seu habitat.

6. Processo para conferir resistência específica a fitonematoides, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade eficaz de uma composição que compreende como ingredientes ativos um Bacillus subtilis tendo as características da linhagem depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen com No. de acesso DSM 17231 e um Bacillus licheniformis tendo as características da linhagem depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen com No. de acesso DSM 17236 e seus excipientes e/ou veículos agroquimicamente aceitáveis a plantas e/ou seu habitat.