ES2610359T3 - Composición nematicida que comprende Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis - Google Patents

Abstract

Composición, que comprende como ingredientes activos un Bacillus subtilis que tiene las características de la cepa depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con número de depósito DSM 17231 y un Bacillus licheniformis que tiene las características de la cepa depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con número de depósito DSM 17236, y excipientes y / o portadores de los mismos aceptables agroquímicamente.

Description

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 Concentración de i.a..: 150 g/Kg  Método de aplicación: terrestre  Modo de empleo: suelo  Clasificación toxicológica: 1 -extremadamente tóxico

[0052] El experimento tuvo seis tratamientos:  Agua: control absoluto;  P1D2: producto japonés a una dosis de 2 kg.ha-1  P1D4: producto japonés a una dosis de 4 kg.ha-1  Producto nemix a una dosis de 2 kg.ha-1  Producto nemix a una dosis de 4 kg.ha-1  Nematicida aldicarb (TEMIK® 150G) a una dosis de 15 kg.ha-1.

Prueba para la evaluación de productos en la actividad del nematodo:

Obtención de juveniles del segundo estadio de Meloidogyne

[0053] Las raíces de café y de tomate infectadas por especies de Meloidogyne fueron lavadas para eliminar el exceso de tierra adherida a ellas, cortadas y procesadas por la técnica de mezcladora (BONETI, J. I. S. & FERRAZ, S.: Modificação de método de Hussey e descortezador para extração de ovos de Meloidogyne exigua de raízes de cafeeiro. Fitopatologia Brasileira, Brasilia, DF, v.6; n.3,553p, 1981).

[0054] Las raíces fueron cortadas en fragmentos de aproximadamente 1 cm de largo, fueron colocadas en una mezcladora, llena de una solución de hipoclorito sódico 0,5% cloro activo para cubrir el material. La mezcladora fue encendida a su velocidad mínima durante una media de 40 segundos. Luego, la suspensión obtenida fue pasada a través de un tamiz de malla 100 superpuesto en una malla 500. Los residuos fueron recogidos de un tamiz de malla 500 con la ayuda de chorros de agua eyectados a un vaso de Becker, cuidadosamente de modo que el volumen final fuera lo más concentrado posible.

[0055] Las suspensiones fueron centrifugadas durante 5 m a una velocidad de 650 gravedades. Cuidadosamente, el sobrenadante fue desechado y la pared interna del tubo del centrifugador fue limpiada para eliminar impurezas orgánicas.

[0056] Se añadió al residuo de cada tubo una solución de sacarosa (de una concentración de 454 g de azúcar por un litro de agua), se mezcló bien y la centrifugadora se encendió a la misma velocidad durante 1 min como se ha descrito anteriormente.

[0057] El sobrenadante fue vertido a través de un tamiz de malla 500, lavado con agua para eliminar el exceso de sacarosa y recogido con la ayuda de chorros de agua a partir de una piseta en un vaso de Becker.

[0058] Había placas de Petri con un diámetro de 5 cm dentro de una capa de toallitas de papel tisú que contenía nylon. La suspensión de huevos fue añadida sobre la capa de papel tisú y las placas de Petri fueron colocadas en una incubadora a 30°C durante 24 horas. Después de 24 h, el filtro con el tejido fue suspendido con la ayuda de fórceps y el fluido de dentro de la placa de Petri fue retirado a una placa de Becker y lavado con agua. El filtro fue sustituido con una placa de papel y se añadió agua. Las placas permanecieron en la incubadora durante 48 h.

[0059] Después de 48 h, los filtros fueron retirados y el líquido fue recogido con la ayuda de chorros de agua de una piseta en un vaso de Becker. La suspensión se calibró para contener 250, 50, 20 y 100 de juveniles del segundo estadio / mL de Meloidogyne incognita, M. Javanica, y M. Paranaensis para ensamblaje de prueba in vitro, respectivamente.

Instalación y evaluación del in vitro

[0060] Unas placas de Petri con un diámetro de 11 cm con una capa de agar de agua 2% recibieron 1 mL de la suspensión de juveniles de segundo estadio y 1 mL de cada tratamiento para ser evaluados: solución de agua destilada TEMIK® 150G (nematicida); solución del producto japonés basado en Bacillus en dos fuerzas; solución Nemix del producto en dos fuerzas. Con agitación, las dos fueron mezcladas íntegramente mL. Las placas fueron mantenidas en la incubadora a 30°C durante 7 días.

[0061] Después de 7 días, cada placa fue examinada bajo una lupa para verificar y contar los nematodos. Se prepararon pruebas para la evaluación de la inhibición de la eclosión de juveniles del segundo estadio de

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Con respecto a la inhibición de la eclosión de juveniles, el producto Nemix con dos dosis tuvo efectos similares, mostrando los mejores resultados entre los productos biológicos evaluados (figura 3C). Todos los productos evaluados difirieron del control absoluto y el efecto del nematicida fue superior a todos los otros tratamientos.

[0072] El producto TEMIK® y Nemix en una dosis de 4 kg ha-1 fueron los más eficaces y no difieren significativamente respecto a la mortalidad de M. parananensis. Con relación a la inhibición de la eclosión, TEMIK® difirió significativamente de todos los otros tratamientos al ser superior a ellos. Sin embargo, el producto Nemix fue más eficaz que el producto japonés (figura 3C).

[0073] Así, la composición Nemix mostró una inhibición significativa de los nematodos M. Javanica y M. Paranaensis, una inhibición comparable al producto químico TEMIK.

Prueba 2

[0074] Objetivo: evaluar la penetración de Meloidogyne javanica en las raíces de tomate respecto a dosis diferentes del producto biológico Nemix que comprende Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis según la reivindicación 1 bajas condiciones de invernadero. Obtención del inóculo

[0075] La obtención del inóculo se realizó a partir del procesamiento de muestras de raíces de café infectadas por M. javanica. Las muestras se llevaron al Agricultural Nematology Laboratory of Institute of Agricultural Sciences y, para el tratamiento, las raíces fueron cortadas en fragmentos de 2 cm y colocadas en un vaso mezclador del hogar que contenía solución de hipoclorito sódico (1 parte de lejía: 4 partes de agua).

[0076] La solución fue agitada durante 20 segundos. Después de este periodo, la suspensión pasó a través de un conjunto de tamices de malla 200 y 500, respectivamente, superpuestos. El residuo de los tamices de malla 500 fue recogido con la ayuda de una botella comprimible a un vaso de precipitados. La suspensión obtenida se calibró para contener 800 huevos de nematoide.mL -1.

Instalación y prueba de transmisión

[0077] El diseño experimental fue un diseño completamente aleatorizado con cinco tratamientos y cinco reproducciones.

[0078] El cultivar de tomate usado fue "Santa Cruz Kada Gigante", con las dosis usadas del producto biológico NEMIX de 4, 6 y 8 kg ha-1. El nematicida aldicarb (TEMIK® 20 G 150 kg ha-1) fue usado como un control estándar y control sin ningún producto de tomate y el nematodo parasitario vegetal M. javanica para la penetración estándar.

[0079] Las semillas de cultivar de tomate "Santa Cruz Kada Gigante" fueron sembradas en bandejas de poliestireno extruido de 128 alveolos llenas de substrato Plantmax®. Para la inoculación, se abrieron tres agujeros con 2 cm de profundidad y separados 2 cm del tallo de la plántula. En estos tres agujeros se distribuyeron 5 ml de inóculo de suspensión calibrada (4000 nematodos / vaso de plástico). Poco después, las dosis de los productos fueron añadidas en pequeños vasos de plástico en fosas abiertas alrededor de cada plántula.

Evaluación de la penetración de juveniles del segundo estadio de M. javanica en raíces de tomate

[0080] La evaluación se llevó a cabo después de 3 semanas de inoculación, donde las raíces, después del corte de los brotes y la separación del suelo, fueron preparadas para la coloración de los nematodos en los tejidos vegetales (Byrd Jr. Et al., An improved technique for clearing and staining plant tissues for detection of nematodes. Journal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, p. 142-143, 1983). Las raíces fueron cortadas en trozos de 1-2 cm y transferidas a un vaso de Becker con 50 mL de agua a la que se añadieron 20 mL de lejía comercial (5,25% de NaOCl), lo que resultó en una concentración final de 1,5% de NaOCl. Los segmentos de raíz permanecieron 6 min en esta solución, promoviendo una agitación manual durante 10 s en intervalos de 1 min. Las raíces fueron lavadas bajo agua corriente durante 30 a 45 s y se mantuvieron en reposo durante 15 s en agua para eliminar el hipoclorito sódico residual.

[0081] Después, se realizó un drenaje completo y se añadieron 30 mL de agua destilada más 1 mL de solución de tinte (3.35 g fucsina ácida + 25 mL de ácido acético glacial + 75 mL de modo acuoso). Las raíces de esta solución fueron calentadas hasta el punto de ebullición, se las dejó en ebullición durante 30

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segundos, y poco después el contenedor fue colocado en la mesa para alcanzar una temperatura ambiente. Posteriormente, se eliminó la solución de tinte restante, y el material fue lavado con agua del grifo y colocado en 2030 mL de glicerina acidificada con unas pocas gotas de 5N HCl. Los segmentos de raíz fueron prensados entre portaobjetos de microscopio y observadas con un microscopio óptico.

5 Se contaron los juveniles del segundo estadio que penetraron en las raíces.

Análisis estadístico

[0082] Los datos fueron sometidos al programa de procedimientos estadísticos SISVAR (FERREIRA, D. F. Análises

10 estatísticas por meio do Sisvar para Windows versão 4.0. In: REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA., 45, 2000, São Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-258, 2000). En el análisis estadístico, las medias se compararon mediante la prueba de Tukey a una probabilidad del 5%.

Resultados y discusión

15 [0083] A partir de los datos presentados en la tabla 3 parece que la penetración de los juveniles del segundo estadio de M. javanica se vio afectada en todos los tratamientos en comparación con el control sin ningún producto. El tratamiento con el producto aldicarb a 20 kg ha-1 mostró la penetración más baja. De las diferentes dosis de NEMIX, la mejor fue la de 8 kg ha-1, que proporcionó una mayor inhibición que las otras

20 dosis evaluadas.

Tabla 3 - Número de juveniles del segundo estadio de Meloidogyne javanica penetrados y porcentaje de penetración en cultivar de raíces de tomate "Santa Cruz Kada Gigante", 3 semanas después de la inoculación. Uberlândia, UFU, 2007.

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Productos

Penetrado Penetración % % Inhibición de la

penetración

Aldicarbe (TEMIK 150 G® 20 kg. Ha-1 )referencia

10,20* a** 0,26***a 88,00

Bacillus spp. (NEMIX 8 kg. Ha-1)

28,80 b 0,72b 66,12

Bacillus spp. (NEMIX6 Kg. Ha-1)

50,40 c 1,26c 40,70

Bacillus spp. (NEMIX4 Kg. Ha-1)

62,20 d 1,57d 26,82

Control (sin aplicación de

85,00 e 2,13e -

producto)

C.V (%)= 12,5

* promedio de cinco repeticiones

** Las medias seguidas por la misma letra en la columna no difieren entre sí por prueba de Tukey a probabilidad del 5% *** % Penetración= N° de J2 / 4.000 huevos

[0084] Se ha observado que el porcentaje de penetración de nematodos osciló entre 0,26 para la dosis de aldicarb y 2,13 para el control sin aplicación de producto.

30 [0085] Con respecto al producto biológico, este puede haber participado en la orientación de los juveniles del segundo estadio de M. Javanica causando la dispersión de juveniles, obstaculizando su penetración, o tal reducción puede haber sido provocada por interferencia en el proceso de emergencia de los juveniles de M. Javanica. Sigue existiendo la posibilidad de que los compuestos absorbidos por el huevo inactiven los nematodos o causen deformaciones durante el desarrollo que eviten la eclosión.

35 [0086] Entre las tres dosis evaluadas del producto biológico basado en Bacillus spp., la dosis de 8 kg ha-1 mostró mejores resultados para la reducción de la penetración de los juveniles del segundo estadio de M. Javanica en raíces de cultivar de tomate "Santa Cruz Kada Gigante" con penetración de 0,72 por ciento.

40 Prueba 3

[0087] Objetivo: evaluar la penetración de Melodogyne exigua en las raíces de tomate expuestas a dosis diferentes de producto biológico según la reivindicación 1 basado en Bacillus spp. bajo condiciones de invernadero.

45 Obtención del inóculo

[0088] La obtención del inóculo fue realizada a partir del procesamiento de muestras de raíces de café infectadas por M. exigua.

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Claims (1)

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