CN103068247B - 包含芽孢杆菌的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有针对植物上和/或其种植地上植物线虫的杀线虫效果的、包含枯草芽孢杆菌(DSM17231)和地衣芽孢杆菌(DSM17236)的组合物，涉及其用途和制备方法，枯草芽孢杆菌(DSM17231)和地衣芽孢杆菌(DSM17236)的用途，用于控制、抗击植物线虫和赋予针对植物线虫的特异性抗性的方法，和试剂盒。

Description

包含芽孢杆菌的组合物
发明内容
本发明涉及对植物和/或其种植地上植物线虫具有杀线虫效果的包含枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的组合物，其用途，其制备方法，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的用途，控制、抗击植物线虫和/或赋予对植物线虫特异性抗性的方法，以及试剂盒。特别地，本发明涉及枯草芽孢杆菌(DSM17231)和地衣芽孢杆菌(DSM17236)。
技术领域
农业活动的增强引起了生态失衡，这使得有必要使用不影响害虫与其捕食者、拟寄生物和病原体之间平衡的选择性产品，害虫与其捕食者、拟寄生物和病原体之间平衡负责着很多天然生物控制，因为它们维持害虫种群在可接受水平(DENT，D.，Insectpestmanagement.Cambridge：CabiBioscience2000)。
为了逆转这种情况，推荐开发用于综合害虫控制的项目，其被定义为在基于考虑了对农场主、社会和环境的利益和/或影响的成本/收益的管理策略中单一或者协调组合使用控制战术的决策系统。在可用于这些管理系统的控制措施中有昆虫病原线虫和拟寄生昆虫，其涵盖了害虫生物控制的不同领域。
在关心保护环境的当前现代生态社会背景下，生物控制被认为是常规控制方法的有吸引力的替代方法和/或补充方法。生物控制是使用一种生物(捕食者、寄生虫或病原体)来攻击引起农作物经济损害的另一种生物。这是农业生态系统中以及依赖于综合害虫控制(IPM)的常规农业中极其普通的策略。
虽然生物控制在减少或者取消农药使用中和改善农场主收入中带来积极效果，但是对全世界一组实验的分析显示，结果仍然集中于仅少数农作物上。仍然需要在害虫和疾病控制领域大力开发。
已经高度重视对使用称作根际细菌的寄居在植物根的细菌的生物控制研究。对于促进生长和/或在植物病原细菌生物控制中有作用的有益细菌被称作植物生长促进性根际细菌或者PGPR。PGPR增加植物对营养物的利用率并且可以产生促进生长的物质的组合物和浓缩物。然而，这些根际细菌的主要作用是抑制对这些植物生长有害的植物病原体。对这些有害细菌的抑制是通过产生铁载体或者产生抗生素实现的，铁载体是在低磷可用性条件下通过进一步减少磷对其它根际微生物的可用性而起作用的物质。
背景技术
用环境可接受产品或者生态技术代替杀线虫药的社会压力鼓励研究控制线虫的替代方法。在该背景下，生物控制已经被考虑作为寻求确保农业可持续发展的综合方法中的一种替代方法。天敌的使用已经变成了一个研究领域，其会起作用减少线虫种群使其低于经济损害阈值水平。
使用合成农药呈现出的对人和环境的危险加强了在优化可持续农业系统中对例如生物控制的手段的需要。
欧洲专利申请EP0705807A1涉及用于土壤调节的细菌制剂，其包括属于芽孢杆菌属的细菌，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。制剂可以防止线虫引起的对农作物根的损伤。
巴西专利申请BRPI0604602-9A涉及枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌组合用于控制植物线虫的用途。
Siddiqui和Mahmood(1999)描述了细菌在治理植物寄生性线虫中的作用，显示枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在抗植物线虫，例如根结线虫属(Meloidogynespp.)、异皮线虫属(Heteroderaspp.)和肾状线虫属(Rotylenchulus)中是有用的。
本发明的发明人已经进行了广泛筛选和研究，基于对两种特别能够减少由线虫引起的农作物根损害的两种野生型的枯草芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株的鉴定解决了提供控制线虫的生物学方法的目标。
附图说明
图1–混合制造过程的操作条件流程。
图2–生物制品作用后幼虫的移动抑制百分数。A：南方根结线虫(Meloidogyneincognita)；B：爪哇根结线虫(M.javanica)；C：咖啡根结线虫(M.paranaensis)。
图3–生物制品作用后孵化抑制百分数。A：南方根结线虫；B：爪哇根结线虫；C：咖啡根结线虫。
图4–接种后三周，在番茄“SantaCruzKadaGigante”根中侵入的短小根结线虫(Meloidogyneexigua)二龄幼虫平均数，侵入百分数和侵入抑制百分数。
具体实施方式
根际细菌
土壤是复杂生物群体的家园，其中微生物、原核生物和真核生物在数量和多样性上均形成主体。一些原核生物具有植物根际和/或跟面生态位，在其中它们繁殖、存活和保护自身不受土壤微生物区系的其余拮抗作用。这些生物在种属上已经称作根际细菌。
与植物相关，根际细菌会具有有害作用、无作用或者有益作用。具有有益作用，即促进生长和疾病生物控制的那些根际细菌被称作PGPR(植物生长促进性根际细菌)。据估计仅0.6%的根际细菌对与它们相关的植物而言具有一些有益作用。
作为生物控制剂的PGPR
PGPR已经用于植物疾病的生物控制并且因此提高了农作物产量。这种生物控制是如何起效和为何有效仍是一个需要补充研究的课题。
在一些情况中，有可能通过PGPR施加的对病原体的直接拮抗而产生生物控制，其中涉及已知的抗生作用机制：抗菌物质产生、直接寄生、对营养物和生态位的竞争。研究已经证明某些PGPR似乎作为ISR(诱导系统抗性)激发子起作用，在这种意义上，植物变得全身抵抗一种以上的病原体，与典型的生物控制不同，其目标是实现更加明确的控制。
当PGPR寄居在根系统时，细菌细胞的或者由细菌细胞合成的构成分子作为生物化学信号的激发子起作用。该信号被转导至距其来源远距离的部位。编码用于动态抗性成分合成的基因失效，在诱导系统抗性中被表达。
一些根际细菌产生体外影响线虫移动的毒性代谢物，而另一些根际细菌抑制幼虫孵化和幼虫侵入根的过程。
根际细菌对植物寄生线虫的影响
根际细菌对线虫施加的控制可以不同方式实施并且会影响线虫生命周期的不同阶段：
-卵：根际中细菌产生的抗生素和毒素扩散进入到土壤中并且可以被线虫卵吸收，从而杀死细胞并防止它们进行胚胎发育。
-孵化：根际细菌降解作为许多种类线虫孵化因子起作用的根系分泌物，并且因此有可能由线虫卵吸收的化合物失活或者在发育过程中引起阻止孵化的变形。
-靶向和移动性：根际细菌对代谢副产物中根系分泌物的转化会导致线虫简直不能识别向化性刺激，因此线虫持续地随机移动，并且最终耗竭其能量储备并在未进入到根中的情况下死亡。如果线虫识别根系分泌物并向根移动，则一些细菌产物会呈现抑制线虫的特性(nematostaticcharacteristic)并减少线虫移动以妨碍线虫到达根。
-宿主识别：由根际细菌产生的物质被根吸收并且会改变它们的化学组成，导致线虫不能识别它们的宿主。据信根际细菌还与根表面上的、线虫与其植物宿主之间结合位点特征性的凝集素结合，由此妨碍识别。
-侵入根：由根际细菌在根面区域或者根上皮细胞内容物内所产生的高浓度毒素或驱避剂，会阻碍线虫侵入到宿主植物内。
-食物：根际细菌或者它们的代谢产物会被植物吸收，并且植物会感知线虫的存在，触发巨细胞过敏反应，这是宿主抗根结线虫属(Meloidogyne)线虫的主要机制。这种抗性被称作系统抗性，它不是植物原有的，即由PGPR的存在诱导的植物内的反应。
-生殖：一些根际细菌对减少卵的效应比减少瘿瘤数量的效应大，这可能是一种运行机制。
根际环境
向根环境引入根际细菌的一种最方便的方法是在播种之前的种子上施用。种子发芽过程以种子渗出物形式释放丰富的糖和氨基酸。因此，随种子一起引入到土壤中的这些生物利用分泌物作为营养源并且出现根时寄居在根处。具有更强的利用种子根系分泌物能力的根际细菌分离株在根寄居中会具有选择性优势。
已经将芽孢杆菌属(Bacillus)根际细菌与线虫控制关联。Sikora，R.A.(Interrelationshipbetweenplanthealthpromotingrhizobacteria,plantparasiticnematodesandsoilmicroorganisms（促进植物健康的根际细菌、植物寄生线虫和土壤微生物之间的相互关系）.MedicineFacultyLandbouwwRijksunivGent,Landbouww,第53卷,第2b期,第867-878页,1988)观察到用芽孢杆菌属菌株处理不同农作物的种子使花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、南方根结线虫和肾形肾状线虫(Rotylenchulusreniformis)的感染降低大约60-65%。
根际细菌用于商业应用的优势
根际细菌与杀线虫剂相比或者甚至与其它生物控制剂相比具有许多优点，它们容易大量生产、储存，它们对制剂技术的适应性强并且不需要遗传操作。
通过处理基质，将幼苗根系浸入到细菌悬液中，将细菌悬液浇在植物上，通过将种子浸入到根际细菌悬液中或者通过向海藻酸盐造粒化种子施用PGPR，来施用根际细菌。
芽孢杆菌属细菌
芽孢杆菌属物种是革兰氏阳性细菌，特征在于具有厚的细胞壁和缺乏外膜，这与革兰氏阴性细菌不同。很多革兰氏阳性细菌的细胞壁由肽聚糖组成。
革兰氏阳性物种根据它们的形态特征和生物化学特征分为数组。芽孢杆菌属属于生孢子细菌组。具有抵抗环境改变的孢子形成结构的物种可耐受干热和某些化学消毒剂达中等时间阶段。它们在干路地上坚持数年。
芽孢杆菌在线虫控制中的用途
线虫造成农业生产的严重损失。据估计，全世界重要经济作物每年损失大约1000亿美元。
使用抗线虫的栽培种并不一定可行，因为用于繁殖的抗性源缺乏，栽培种缺乏抗某些区域和种植季节的适应性，或者在田野条件下抗性被破坏。通常不推荐化学控制线虫，因为它不是非常有效；它是昂贵的，因为它在食物中留下废物并且它造成环境污染。因为这些缺点，来自社会的限制使用化学药品的压力增加导致农场主需要同时对人和动物无毒、廉价且控制线虫极其有效的产品。
已知许多土壤微生物是线虫的寄生虫或者捕食者。这些微生物的作用源于干扰病原体生命周期步骤的直接作用或者间接作用。
枯草芽孢杆菌
当接近种子或者土壤施用时，枯草芽孢杆菌的有益效果不仅仅是因为针对病原体提供的拮抗作用。也由于产生通过磷的增溶作用而促进生长和改善植物营养的物质，细菌对发芽、生长和农作物产量具有积极影响。
根结线虫属
根结线虫属线虫(根-结线虫)表现出对植物宿主的极大多样性并且在全球不同区域出现，造成不同种植物损失。主要症状是在植物根上出现瘿瘤。这些瘿瘤是根系统畸形或者增厚部分。受影响的植物表现出衰弱、低产量、早落叶和过早凋谢，并且偶尔会出现植物死亡，这是在营养胁迫和干旱条件下可能的症状。
最初，根结线虫属二龄幼虫(J2)穿透根并且在根的中柱区域内建立摄取部位。通过线虫的发育，J2分化成成年雄体或雌体。成年雄体离开根系，并且雌体流在根内。在雌体根结线虫属发育过程中，产下大约500枚卵。它们存留在根外凝胶状基质中，在其中J2孵化，并因此再次感染根系。根-结线虫的生命周期大约4周并且在较不利的温度条件下会延长。低于20℃或者高于35℃的温度和土壤干旱或者水浸条件降低线虫的发育和存活。
取决于所涉及的种植物，可以使用包含某些活性成分例如虫螨威、丙线磷(etoprophos)、涕灭威、硫威钠或者苯线磷等化学药品控制南方根结线虫和爪哇根结线虫。开展农作物轮作在控制中也是重要的，这归因于非宿主农作物例如花生、菠萝、水稻的部署，或者使用例如燕麦的也是非宿主的植物物种作为地被物。
短小根结线虫极具攻击性并且在种植中传播极广。在短小根结线虫感染区的不同化学控制方法包括使用包含许多活性成分特丁磷或者虫螨威的化学药品，这取决于种植的种类。在非宿主农作物当中，突出的是棉花、花生、水稻和燕麦。
与短小根结线虫一样，咖啡根结线虫在咖啡种植中广泛传播，但是在其它种植物中不是大问题。对于它的控制，通过真菌淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)已经得到积极结果，并且这降低了温室内番茄“SantaClara”根内的线虫种群。
已经已知与生物控制有关的根际细菌用途。然而，申请人目前开发了在植物种植中具有针对植物线虫的杀线虫效果的包含两种枯草杆菌属物种，即枯草芽孢杆菌DSM17231(也称作DSM5750)或其突变体和地衣芽孢杆菌DSM17236(也称作DSM5749)或其突变体的组合物。
因此，本发明的第一方面涉及本文所述的新菌株或其突变体。
技术人员明白，通过使用保藏的菌株作为起始材料，技术人员可通过常规诱变或者常规的再分离技术可得到保留本文所述有关特征和优势的更多的其突变体或者衍生物。因此，第一方面中的术语“其突变体”涉及通过使用保藏的菌株作为起始材料得到的突变菌株。
植物线虫是广义上的对商用农作物具有负面影响的任何线虫。使用本发明的组合物可以抗击的线虫包括根结线虫属、短体线虫属(Pratylenchus)、异皮线虫属(Heterodera)、球胞囊属(Globodera)、茎线虫属(Ditylenchus)、半穿刺线虫属(Tylenchulus)、剑线虫属(Xiphinema)、穿孔线虫属(Radopholus)、肾状线虫属(Rotylenchulus)、螺旋属(Helicotylenchus)和刺线虫属(Belonolaimus)的线虫。认为根结线虫属物种特别相关，因为它们占农作物全部感染的大约95%，导致全球大约5%总农作物损失。本发明的组合物除了包含活性成分之外，还包含农业化学可接受的辅料和/或赋形剂。本发明的组合物还包含农业化学可接受的载体、赋形剂和/或佐剂。
本发明的组合物特别用作抗击农作物植物中的线虫。
主要农作物植物有甘蔗、咖啡、大豆、棉花、玉米、马铃薯、番茄、烟草、香蕉、水稻、小麦、鳄梨、菠萝、南瓜、可可树、椰子、燕麦、洋葱、莴苣、甜菜、胡萝卜、木薯、豆类、向日葵、胡椒、芜菁、苹果、草莓、秋葵、萝卜和洋葱。
至于果树种植特别相关的是柑橘、葡萄、番石榴、番木瓜、无花果、桃、李子和枇杷(nespeira)，并且至于园艺种植特别相关的是茄子和十字花科。
至于花卉栽培特别相关的是玫瑰、菊花、洋桔梗(lisianthus)、大丁草、孤挺花、秋海棠和青葙。
本发明涉及包含枯草芽孢杆菌DSM17231，或其突变体，和地衣芽孢杆菌DSM17236，或其突变体的组合物，并且涉及包含通过制备组合物的方法制备的组合物以及说明书和适宜容器的试剂盒。
还提供了制备包含枯草芽孢杆菌DSM17231，或其突变体，和地衣芽孢杆菌DSM17236，或其突变体，以及农业化学可接受载体、赋形剂和/或佐剂的组合物的方法，以及所述组合物用于控制、抗击植物线虫和/或赋予对植物线虫特异性抗性的用途。
此外，本发明涉及有效量的枯草芽孢杆菌DSM17231，或其突变体，和地衣芽孢杆菌DSM17236，或其突变体，在制造具有针对植物种植物中植物线虫的杀线虫效果的农业化学组合物中的用途，以及用于控制、抗击植物线虫和/或赋予对植物线虫特异抗性的方法。
下面给出的示例性实施例用于更好地描述本发明。然而，所述的制剂仅仅涉及本发明一些实施方案的一些手段并且不应该限制其范围。
实施例
本发明的组合物
枯草芽孢杆菌(DSM17231)：1.6x1010ufc/g
地衣芽孢杆菌(DSM17236)：1.6x1010ufc/g
成分 最小百分数(%) 最大百分数(%)
枯草芽孢杆菌(DSM17231) 2.4 3.0
地衣芽孢杆菌(DSM17236) 2.4 3.0
麦芽糊精 94.2 93.0
二氧化硅 1.0 1.0
组合物可作为可湿粉末使用。然而，组合物还可以以任何其它适宜形式例如粉末、溶液、浆液、颗粒等形式提供。
混合制造过程的操作条件：
前期成分/材料：受过训练的人接收以证实并检查所接收的物品货物。根据制造目标，列出成分清单和它们的数量并将信息送至工厂。
成分/材料称重：工厂接收成分，称重并置于不锈钢混合器中。
混合物：按照SOP(标准操作规程)中所述处理将成分混合。
分析：收集样品用于计数菌落数量，以CFU/g计。
装瓶：将产品包装在包含20kg的具有牛皮纸内保护的袋中或者包装在包含1.0或5.0kg的聚乙烯塑料盆中。
封口：将袋密封并缝合。盆用盖密封并通过磁感应。
码垛堆积：还在工厂时将包装置于木制平板架上等待质量控制(QC)检查。
储藏：将终产品储藏、密封和适当鉴定。每一批以电子程序记录，这对于各个有关环节的所有操作者可用。
分派：一旦QC通过，产品仍储藏在仓库中至销售时分派。
该流程如图1所示。
体外测试：
测试1
目的：为了评价基于芽孢杆菌属细菌的生物制品在控制植物线虫即南方根结线虫、爪哇根结线虫和咖啡根结线虫中的体外效果。
材料与方法：
我们研究了根结线虫属的三种植物线虫：南方根结线虫、爪哇根结线虫、咖啡根结线虫和两种不同剂量的两种生物制品：基于芽孢杆菌属物种的日本产品和由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、97.8%乳糖和二氧化硅组成的产品用作效果标准的杀线虫剂是150G(涕灭威)，其特征为：
-商标：150
-注册者：BayerCropScienceLtda.
-等级：杀螨剂–杀虫剂–杀线虫剂
-剂型：GR–颗粒状
-活性成分(i.a.)涕灭威
-i.a浓度：150g/Kg
-施用方法：陆地
-应用模式：土壤
-毒理学分类：I–极毒
实验具有6种处理：
-水：绝对对照；
-P1D2：2kg.ha-1剂量的日本产品；
-P1D4：4kg.ha-1剂量的日本产品；
-2kg.ha-1剂量的Nemix产品；
-4kg.ha-1剂量的Nemix产品；
-15kg.ha-1剂量的杀线虫剂涕灭威(150G)。
用于评价产品在线虫活性中的测试：
得到第2龄根结线虫属幼虫
将被根结线虫属物种感染的咖啡和番茄根清洗以去除附着在它们上的过多土壤，切割并通过搅拌器技术处理(BONETI,J.I.S.&FERRAZ,S.:demétododeHusseyeBarkerparadeovosdeMeloidogyneexiguaderaízesdecafeeiro.FitopatologiaBrasileira,Brasília,DF,第6卷,第3期,第553页,1981)。
将根切成1cm长的段，置于搅拌器中，加入0.5%活性氯的次氯酸钠溶液覆盖材料。以最低速度开启搅拌器平均40秒。然后将得到的悬液通过在500目上叠加的100目筛网。借助于从Becker杯压缩喷射的水从500目筛网收集废物，如此小心以致于尽可能地浓缩终体积。
将悬液以650重力的速度离心5分钟。小心丢弃上清并且清洁离心管内壁以去除有机杂质。
向每一管内的残留物中加入蔗糖溶液(454g糖对1升水的浓度)，充分混合并且与先前所述速度相同的速度离心1分钟。
上清夜流经500目筛网，用水洗涤去除过多的蔗糖并借助于来自洗瓶的喷射水收集于Becker杯中。
直径5cm的培养皿内部是一层含有尼龙的面巾纸。在这层纸巾上部加入卵的悬液并将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。24小时后，用镊子悬浮具有纸巾的筛并且培养皿内部的液体移到平板Becker中并用水洗涤。用纸板代替所述筛并加入水。平板在培养箱中保留48小时。
48小时后，去除所述筛并且借助于来自洗瓶的喷射水收集液体至Becker杯。将悬液标定至包含250，50，20和100个第二龄幼虫/mL的南方根结线虫、爪哇根结线虫和咖啡根结线虫分别用于体外测试。
体外设置和评价
包含水-2%琼脂层的直径11cm的培养皿接受1mL第二龄幼虫悬液和1mL的待测试每一处理：蒸馏水溶液150G(杀线虫剂)；两种浓度的基于芽胞杆菌属的日本产品溶液；两种浓度的Nemix产品溶液。通过旋转将两种液体充分混合。将平板在培养箱中于30℃培养7天。
7天后，在放大镜下检查每一平板以证实和计数线虫。
用于评价对二龄根结线虫属幼虫孵化抑制的测试
如先前对于“得到第二龄根结线虫属幼虫”部分所述使用搅拌器制备番茄和咖啡的根(BONETI,J.I.S.;FERRAZ,S.:demétododeHusseyeBarkerparadeovosdeMeloidogyneexiguaderaízesdecafeeiro.FitopatologiaBrasileira,Brasília,DF,第6卷,第3期,第553页,1981)。
将悬液标定至分别包含1500枚卵/mL，100枚卵/mL，500枚卵/mL和200枚卵/mL的南方根结线虫、爪哇根结线虫和咖啡根结线虫。
体外设置和评价
里面包含具有弄湿的面巾纸层的尼龙织物的直径5cm的培养皿，接受1mL的每一测试处理和1mL卵悬液。将平板在培养箱中于30℃保持7天。
7天后，去除屏蔽物并且使用来自洗瓶的喷射水收集每一平板的液体至玻璃。
借助于计数板在显微镜下检查每一悬液以证实和计数J2根结线虫。
设计和统计学分析
完全随机设计实验，对于每一线虫有6种处理和5个重复。每一培养皿是一个实验单位。
将数据用统计学程序Sisvar分析(FERREIRA，D.F.：AnálisesestatísticaspormeiodoSisvarparaWindows4.0.In：ANUALDABRASILEIRADASOCIEDADEINTERNACIONALDEBIOMETRIA.，45，2000，Carlos：UFSCar，2000，第255-258页，2000)。在统计学分析中，将数据进行方差分析并通过Scott-Knott检验以5%的概率比较平均值。(显示没有统计学显著性差异的结果在数字中用相同的小写字母标记)。
在评价杀虫剂控制线虫的效果中，计算移动抑制百分数和幼虫孵化抑制百分数。在计算这些百分数中使用的公式如下：
(B-A)x100，其中：
B
A=每一处理的每一重复中活动线虫或者孵化线虫的数量。
B=在评价移动抑制或者孵化抑制的测定中使用的线虫数量。
结果与讨论
图2和3表明不同杀线虫剂对线虫南方根结线虫(A)、爪哇根结线虫(B)和咖啡根结线虫(C)移动(图2)和孵化(图3)的抑制性作用。
图2A中呈现的数据表明，仅杀线虫剂显著不同于其它处理，特征是南方根结线虫死亡率和幼虫孵化抑制结果最佳。关于幼虫孵化抑制，观察到处理与对照没有差异并且仅用的化学处理降低孵化。
对于爪哇根结线虫抑制，在测试的生物制品与之间没有观察到显著差异，表明生物制品具有抑制线虫移动的满意效果(图2B)。对孵化的影响没有显著性差异并且仅化学产品TEMIK抑制孵化(图3B)。
对于对咖啡根结线虫的抑制，4kg/公顷剂量的Nemix给出与杀线虫剂显著相同的结果(图2C)。接着是，2kg/公顷和4kg/公顷剂量的日本产品和2kg/公顷剂量的Nemix，并且所有有机产品比对照处理均具有更大的作用。关于对幼虫孵化的抑制，两个剂量的产品Nemix具有相似的效果，表明了在所测试生物制品中的最佳结果(图3C)。所测试的所有产品均与绝对对照不同并且杀线虫剂效果优于所有其它处理。
4kg/公顷剂量的产品和Nemix是最有效的并且在咖啡根结线虫死亡率方面没有显著差异。关于孵化抑制，显著不同于所有其它处理，并且优于它们。然而，Nemix产品比日本产品更有效(图3C)。
因此，成分Nemix显示出与化学产品TEMIK可比的爪哇根结线虫和咖啡根结线虫抑制。
测试2
目标：为了评价温室条件下不同剂量的包含枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的生物制品Nemix有关的爪哇根结线虫向番茄根内的侵入。
得到接种物
从被爪哇根结线虫感染的咖啡根的样品处理中得到接种物。将样品带到农业科学研究所的农业线虫学实验室，并且为了进行处理，将根剁成2cm的段并置于包含次氯酸钠溶液(1份漂白剂：4份水)的家用搅拌器杯中。
将溶液旋转离心20秒。此阶段之后，将悬液分别通过一组重叠的200和500目筛网。借助于挤压水收集500目筛网上的残留物至becker。得到的悬液标定至包含800枚线虫卵/mL。
设置和进行试验
完全随机设计试验，有5种处理和5次重复。
使用的番茄栽培种是“SantaCruzKadaGigante”，使用的剂量是4、6和8kg/公顷的生物制品NEMIX。杀线虫剂涕灭威(20G150kg/公顷)用作标准检查并且没有任何番茄产品的对照和植物寄生线虫爪哇根结线虫用作标准侵入。
将番茄栽培种“SantaCruzKadaGigante”的种子播种在充满有底土层的128孔泡沫聚苯乙烯盘中。为了接种，根据幼苗的茎开深2cm间隔2cm的3个孔。在这三个孔中加入5ml悬液标定的接种物(4000个线虫/塑料杯)。之后，将所述剂量的产品以小塑料杯加入每一幼苗周围的漏天坑中。
评价爪哇根结线虫二龄幼虫向番茄根内的侵入
在接种3周后开展评价，在切下枝并分离土壤之后，制备根用于植物组织内的线虫染色(ByrdJr.等，Animprovedtechniqueforclearingandstainingplanttissuesfordetectionofnematodes（用于清洗和染色植物组织以检测线虫的改进技术）.JournalofNematology,Lakeland,第5卷,第1期,第142-143页,1983)。将根破碎成1-2cm的碎片并转移至包含50mL水的Becker杯中，向其中加入20mL商业化漂白剂(5.25%NaOCl)，获得终浓度1.5%的NaOCl。将根段在该溶液中保持6分钟，以1分钟的间隔手动摇动10秒。用流动的水洗涤根30至45秒并且置于水中15秒以去除残留的次氯酸钠。
然后，完全排干水并加入30mL蒸馏水加1mL染料溶液(3.35g酸性品红+25mL冰醋酸+75mL水)。将该溶液中的根加热至沸点，将它们沸腾30秒，并且马上将容器置于台面上至达到室温。接着，去除仍残留的染料溶液，并将材料在自来水中洗涤并置于以几滴5NHCl酸化的20-30mL甘油中。将根段压在显微镜载玻片之间并用光学显微镜观察。计数侵入到根内的二龄幼虫。
统计学分析
将数据进行统计学程序SISVAR分析(FERREIRA，D.F.AnálisesestatísticaspormeiodoSisvarparaWindows4.0.In：ANUALDABRASILEIRADASOCIEDADEINTERNACIONALDEBIOMETRIA.，45，2000，Carlos：UFSCar，2000，第255-258页，2000)。在统计学分析中，通过Tukey检验以5%的概率比较平均值。
结果与讨论
根据表3中给出的数据，很明显与没有任何产品的对照相比在所有处理中爪哇根结线虫二龄幼虫的侵入受影响。用20kg/公顷的涕灭威产品处理显示具有最低的侵入。在不同剂量的NEMIX当中，最佳的是8kg/公顷，其提供比其它所测试剂量更大的抑制。
表3–接种3周后，番茄栽培种“SantaCruzKadaGigante”根中侵入的爪哇根结线虫二龄幼虫数量和侵入百分数。UFU，2007。
C.V(%)=12,5
*5个重复的平均值
**在该列中后面有相同字母的平均值表示通过Tukey检验在5%的概率上彼此无差异
***%侵入=J2数量/4.000枚卵
发现线虫侵入百分数从涕灭威剂量中的0.26至没有施用产品的对照中的2.13。
至于生物制品，其在爪哇根结线虫二龄幼虫的定位中具有作用，引起幼虫分散，妨碍幼虫侵入，或者这种减少会是因为干扰爪哇根结线虫幼虫出现过程而引起。仍有可能被卵吸收的化合物灭活了线虫或者在发育过程中引起变形阻止孵化。
在基于芽孢杆菌的生物制品所评价的三种剂量中，剂量8kg/公顷显示在降低爪哇根结线虫二龄幼虫向番茄栽培种“SantaCruzKadaGigante”根内的侵入中具有更好的结果，其中侵入百分数为0.72%。
测试3
目标：为了评价短小根结线虫向温室条件下暴露于不同剂量基于芽孢杆菌的生物制品番茄根中的侵入。
得到接种物
从被短小根结线虫感染的咖啡根的样品处理中得到接种物。将样品带到农业科学研究所的农业线虫学实验室，并且为了进行处理，将根剁成2cm的段并置于包含次氯酸钠溶液(1份漂白剂：4份水)的家用搅拌器杯中。
低速旋转研磨20秒。此阶段之后，将悬液分别通过一组重叠的200和500目筛网。借助于挤压水收集500目筛网上的残留物至becker(BONETI，J.I.S.；FERRAZ，S.demétododeHusseyeBarkerparadeovosdeMeloidogyneexiguaderaízesdecafeeiro.FitopatologiaBrasileira，Brasília，DF，第6卷，第3期，第553页，1981)。得到的悬液标定至包含800枚线虫卵/mL。
设置和进行试验
完全随机设计试验，有5种处理和5次重复。所使用的番茄基因型是“SantaCruzKadaGigante”，基于芽孢杆菌的产品()的使用剂量是4、6和8kg/公顷，20kg商业产品/公顷剂量的杀线虫剂涕灭威(150G)用作标准检查并且没有使用任何产品的番茄对照用作标准侵入。
将番茄栽培种“SantaCruzKadaGigante”的种子播种在的128孔泡沫聚苯乙烯盘中，并且8天后将幼苗移植到填充有底土层的500mL容量塑料杯中。为了接种，据幼苗的茎开深2cm间隔2cm的3个孔。在这三个孔中加入5ml悬液标定的接种物(4000个线虫/塑料杯)。之后，将各种剂量的基于芽孢杆菌的产品挤压加入到塑料杯中。在接种后立即在每一幼苗周围的漏天坑中加入杀线虫剂涕灭威。
评价短小根结线虫二龄幼虫向根内的侵入
在接种3周后开展评价，在切下枝并分离土壤之后，制备根用于植物组织内的线虫染色(ByrdJr.等，Animprovedtechniqueforclearingandstainingplanttissuesfordetectionofnematodes（用于清洗和染色植物组织以检测线虫的改进技术）.JournalofNematology,Lakeland,第5卷,第1期,第142-143页,1983)。将根破碎成1-2cm的碎片并转移至包含50mL水的Becker杯中，向其中加入20mL商业化漂白剂(5.25%NaOCl)，获得最终浓度为1.5%的NaOCl。将根段在该溶液中保持6分钟，以1分钟的间隔手动摇动10秒。用流动的水洗涤根30至45秒并且置于水中15秒以去除残留的次氯酸钠。
然后，完全排干水并加入30mL蒸馏水加1mL染料溶液(3.35g酸性品红+25mL冰醋酸+75mL水)。将该溶液中的根加热至沸点，将它们沸腾30秒，并且马上将容器置于台面上至达到室温。接着，去除仍残留的染料，并将材料在自来水中洗涤并置于以几滴5NHCl酸化的20-30mL甘油中。将根段压在显微镜载玻片之间并用光学显微镜观察。观察根段并确定侵入到番茄根内的二龄幼虫数量。
温室内空气的最大和最小温度
为了计算试验期间的平均值，记录温室内空气的每日最大和最小温度。
空气的平均最大和最小温度分别是35.9℃和15.3℃。
统计学分析
将数据进行统计学程序SISVAR分析(FERREIRA，D.F.AnálisesestatísticaspormeiodoSisvarparaWindows4.0.In：ANUALDABRASILEIRADASOCIEDADEINTERNACIONALDEBIOMETRIA.，45，2000，Carlos：UFSCar，2000，第255-258页，2000)，证实方差齐性和残差正态。在统计学分析中，通过Tukey检验以5%的概率比较平均值。
结果与讨论
根据表4中给出和图3中示例的数据，显示与没有使用任何产品的对照相比在所有处理中短小根结线虫二龄幼虫的侵入显著性地受影响。用20kg/公顷的涕灭威产品(TEMIK)处理侵入的影响最大。在不同剂量的NEMIX当中，最佳的是8kg/公顷，与显示具有81.95%显著性抑制的杀线虫剂涕灭威相比具有较高的抑制百分数54.13%。
表4-接种3周后，在番茄“SantaCruzKadaGigante”根中侵入的短小根结线虫二龄幼虫数量和侵入百分数和抑制百分数。UFU，2007。
C.V(%)13.04
*5个重复的平均值
**在该列中后面有相同字母的平均值表示通过Tukey检验在5%的概率上彼此无差异
***%侵入=J2数量/4.000枚卵
***与4000枚短小根结线虫卵的最初种群相比的数值
还观察到在NEMIX产品的4kg/公顷和6kg/公顷的剂量之间影响没有差异，侵入百分数分别是1.65和2.02%。对于最初种群，线虫侵入百分数在对照和侵入对照型中的范围分别为0.48%和2.66%之间。
杀虫剂对短小根结线虫迁移的影响表明，存在引起幼虫分散的方向干扰。与对照相比侵入到番茄根内的幼虫的减少还是因为干扰短小根结线虫幼虫孵化和定位过程而引起。
线虫侵入根内降低的假设可由产品中所包含细菌与表面凝集素结合或连接的能力证明，在该例中这种能力因革兰氏阳性细菌而最小。
温室内的温度也影响幼虫向根内的侵入。一些作者报导，一些微生物对根结线虫种群的拮抗作用在23-25℃范围温度下比18-32℃的温度下大(AL-HAZMI,A.S.;SCHIMITT,D.P.;SASSER,J.N.TheeffectofArthrobotrysconoidesonMeloidogyneincognitapopulationsdensitiesincornasinfluencedbytemperature,fungusinoculumdensityandoffungusintroductioninthesoil（圆锥节丛孢对玉米中南方根瘤线虫群密度的作用受温度、接种的真菌密度和真菌在土壤中的引入的影响）.JournalofNematology,DeLeonSprings,第14卷,第2期,第168-174页,Apr.,1982)。
在基于芽孢杆菌的生物制品所测试的三种剂量中，证明剂量8kg/公顷更有效地降低短小根结线虫二龄幼虫向番茄栽培种“SantaCruzKadaGigante”根内的侵入，其中侵入百分数为1.22%并且抑制为54.13%。
结论
枯草芽孢杆菌菌株与地衣芽孢杆菌菌株诸如例如枯草芽孢杆菌(DSM17231)与地衣芽孢杆菌(DSM17236)的特定组合经证明是化学杀线虫产品的强有力的替代物，并且与现有的生物制品相比是改善的组合物。两种菌株的组合效应有益于抑制引起农作物损失的线虫。
保藏与专家方案
申请人要求下面所述保藏的微生物样品仅对于专家是可得到的，直到专利被授权之日。
枯草芽孢杆菌菌株于2005年4月7日保藏在德国微生物菌种保藏中心GmbH，MascheroderWeg1b，D-38124Braunschweig(DSMZ)中并且给出保藏号：DSM17231。
地衣芽孢杆菌菌株于2005年4月7日保藏在德国微生物菌种保藏中心GmbH，MascheroderWeg1b，D-38124Braunschweig(DSMZ)中并且给出保藏号：DSM17236。
保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行。
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Claims (11)

1.组合物，包含作为活性成分的、具有以保藏号DSM17231保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株特征的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，和具有以保藏号DSM17236保藏于德国微生物菌种保藏中心的菌株特征的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，及其农业化学可接受辅料和/或载体。
2.根据权利要求1的组合物，包含处在麦芽糊精和二氧化硅的混合物中的所述枯草芽孢杆菌和所述地衣芽孢杆菌，其中所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、麦芽糊精和二氧化硅存在的最低比率分别为2.4％、2.4％、94.2％和1.0％并且最高比率分别为3.0％、3.0％、93.0％和1.0％。
3.根据权利要求1和2任一项的组合物，其为可湿粉剂形式。
4.制备如权利要求1至3任一项所定义组合物的方法，包括以希望的比例、有效量的用于施用的所述枯草芽孢杆菌和所述地衣芽孢杆菌与农业化学可接受的载体、赋形剂和/或佐剂一起混合。
5.根据权利要求1至3任一项的组合物或者根据权利要求4中所定义的方法可得到的组合物的用途，用于控制、抗击植物线虫和/或赋予对植物线虫特异性抗性。
6.根据权利要求5的用途，其中植物线虫选自由根结线虫属(Meloidogyne)、短体线虫属(Pratylenchus)、异皮线虫属(Heterodera)、球胞囊属(Globodera)、茎线虫属(Ditylenchus)、半穿刺线虫属(Tylenchulus)、剑线虫属(Xiphinema)、穿孔线虫属(Radopholus)、肾状线虫属(Rotylenchulus)、螺旋属(Helicotylenchus)和刺线虫属(Belonolaimus)组成的组。
7.根据权利要求6的用途，其中植物线虫选自由南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、短小根结线虫(Meloidogyneexigua)、咖啡根结线虫(Meloidogyneparanaensis)、大豆胞囊线虫(Heterorderaglycines)和玉米短体线虫(Pratylenchuszeae)组成的组。
8.根据权利要求5至7任一项的用途，其中植物栽培物选自由甘蔗、大豆、马铃薯、胡萝卜、咖啡和香蕉组成的组。
9.用于控制和/或抗击植物上和/或其种植地上植物线虫的方法，其中使如权利要求1至3中任一项所定义的组合物作用在植物线虫和/或其种植地上。
10.用于赋予对植物线虫特异性抗性的方法，包括将有效量的权利要求1至3中任一项所定义的组合物施用于植物和/或其种植地上。
11.试剂盒，包含如权利要求1至3中任一项所定义的的组合物或者根据权利要求4所定义方法可得到的组合物、说明书和适宜容器。
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