JP6316497B1 - アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を含むスクーチカ虫抑制用組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、アレキサンドリウム属(Alexandrium spp.)渦鞭毛藻類を含むスクーチカ虫成長抑制用の用途に関する。【解決手段】本願は、アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類またはその培養液を含むスクーチカ虫抑制用組成物、または前記組成物を用いたスクーチカ虫の抑制方法を開示する。本願による組成物及び方法は、スクーチカ虫以外の有用な魚類資源に対しては有害性を有しないため安全である。また、本願による組成物及び方法は、スクーチカ虫の成長を効果的に抑制することができるため、海洋魚類の養殖などで大きい損失を誘発するスクーチカ虫によるスクーチカ症の治療、制御及び／または予防に効果的に用いられることができる。【選択図】図１
Description
本発明は、アレキサンドリウム属(Alexandrium spp.)渦鞭毛藻類を含むスクーチカ虫成長抑制用の用途に関する。
スクーチカ虫は、韓国を始めとして日本、地中海沿岸国、スペイン、オーストラリア、米国、及び中国などで、特に韓国における主な海産養殖魚であるヒラメやクロソイを含めて種々の海産魚種、貝類、及びタツノオトシゴなどに感染して被害を誘発するスクーチカ感染症(Scuticocillatosis)またはスクーチカ症を引き起こす原因体である。
スクーチカ虫は、スクーチカ虫目に属する繊毛虫であって、現在まで１０余種が知られている。この種は、目視観察は不可能であり、顕微鏡で見るとキュウリのたねの形状にみえる。韓国及び日本の海産魚、養殖魚、貝類に感染して多くの被害をもたらす種は、主にMiamiensis avidus、Uronema marinum、及びAnophryoides haemophiliaなどである(非特許文献１)。スクーチカ虫に属する繊毛虫は、主に細菌類を餌源とし、溶存酸素濃度の低い環境や、有機物が多い場合に出現する。
この寄生虫は、魚体の鰓、肌、鰭の上皮組織の下層、真皮と筋肉層との間まで侵入して、上皮細胞の増殖、肥厚及び充血、ひいては壊死も誘発する。筋肉では、横筋繊維細胞の間に寄生して組織を崩壊させ、壊死させる。鯛類とクロソイの場合、体表がはがれる擦過傷を引き起こし、スズキの場合、頭部出血が発生し得る。
例えば、ヒラメでは様々な症状が発生するが、体表の炎症、鰭軟条及び尾柄の露出、頭部損傷などが特徴的に生じる。頭部損傷の場合、口の出血や眼球の白濁及び突出、口腔粘膜の鬱血などが発生する。この寄生虫は、また、脳にも侵入して感染を誘発するが、脳に直接侵入する場合もあるが、尾柄の損傷部位に侵入して中枢神経系を介して脳に侵入する場合もある。かかる寄生虫が脳に感染した感染魚は、殆どが斃死すると知られている。
体表や鰓に寄生した軽微な感染の場合は、ホルマリン１００ｐｐｍ〜２００ｐｐｍで１時間薬浴処理し、薬浴後に水槽を掃除して清い海水を供給する。しかし、脳を含めた内部器官に寄生したスクーチカ虫に対しては、有効な治療方法がない状況である。そのため、重感染した魚体の場合、発見し次第収去して廃棄しなければならない。したがって、早期に感染を確認して軽感染状態で治療を行い、脳や内部器官に移行しないようにすることが何より重要である。スクーチカ虫は、感染種苗を含め、換水が十分に行われていない飼育水槽に常存して感染源として作用する。そのため、この寄生虫による被害を予防するためには、飼育地の徹底した消毒と定期的な掃除が必須であり、換水量の増大、及び幼魚や稚魚の周期的な検査が必要である。
しかしながら、前記ホルマリンは、代表的な発癌物質であるホルムアルデヒドを水に溶かして３５％〜３８％の濃度としたものであって、消毒剤、防腐剤として広く用いられており、韓国では、水質環境保全法（第２９条）、有害化学物質管理法（第１５条）、廃棄物管理法（第２５条）などで毒物として分類され、厳格な管理が要求されていて、ホルムアルデヒドは大気環境保全法（第２条）で有害物質として分類されている。このようなホルマリンの有害性により、水産養殖分野において、魚類の抗寄生虫薬としてのホルマリンの使用は、現在、日本では２００３年に養殖フグからホルマリンが検出され、論争後に結局その使用が禁止されており、済州島でも、２００６年７月の済州特別自治道としての出帆に当たって、ホルマリンが水産物から検出されると搬出を禁止することを条例に規定している。しかし、日本で使用が禁止されているホルマリンを、韓国では済州島以外の市道で使用可能にしているため、日本との貿易摩擦と消費者の問題提起を自ら招いている。実際に、過去に海洋水産部の傘下機関が１９９７年に出した報告書（「化学処理による成長期ヒラメの急性毒性効果」）でも、「ホルマリン、二酸化塩素、過酸化水素のうち、ホルマリンは他の２つに比べて低濃度でも致死率が高く、非常に有毒であるため、ホルマリンよりは過酸化水素を使用することが効果的である」と、ホルマリンの使用を控えることを勧告したことがある。
特許文献１では、二酸化塩素及びクエン酸を主要成分とするスクーチカ感染症駆除組成物を提案しているが、二酸化塩素は揮発性が強く、爆発性を示すとともに、気体は紫外線によって分解されやすい光学的分解作用を有するため、養殖業従事者のような一般人が扱いにくいという問題が存在する。そして、特許文献２では、ストレプトコッカス(streptococcus)属細菌を含むワクチン組成物を提案しているが、対象魚類に注射しなければならないという煩わしさが存在する。
寄生性の原生病原菌であるスクーチカ繊毛虫によって引き起こされるスクーチカ虫感染病は、海洋養殖産業において全世界的に最も深刻な疾病を引き起こす原因の１つである。したがって、このような繊毛虫を除去することは、海洋養殖業の管理者や研究者において根本的に台頭される問題の１つであると言える。今まで、ホルマリンと種々の他の毒性化学物質がスクーチカ虫抑制剤として用いられて来た。しかし、それによる二次副作用の問題が存在する。結果として、スクーチカ虫を除去するための安全な技術の開発が必要な状況である。
Song et al.,DisAquat Org 83:133-143,2009;Lavallee et al.,Dis Aquat Org 46:231-236,2001
本発明は、上記のような問題点を解決するために、２次被害の恐れなしに安全に適用可能な生物学的成分を用いたスクーチカ虫の抑制技術を提供することをその目的とする。
上記の課題を解決するために、本願は、アレキサンドリウム属(Alexandriumspp.)渦鞭毛藻類及び／または前記渦鞭毛藻類の培養液を含む、スクーチカ感染症またはスクーチカ症を誘発するスクーチカ虫の抑制剤または抑制用組成物を提供する。
本願の好ましい一実施形態によると、前記アレキサンドリウム属(Alexandriumspp.)渦鞭毛藻類として、アレキサンドリウムアンデルソニ(Alexandrium andersonii)、アレキサンドリウムフラテルクルス(Alexandrium fraterculus)、アレキサンドリウムヒラノイ(Alexandriumhiranoi)、またはアレキサンドリウムインスエタム(Alexandrium insuetum)を用いることができる。
また、本願の好ましい一実施形態によると、前記スクーチカ虫はスクーチカ虫目の寄生虫であって、このスクーチカ虫目の寄生虫は、ミアミエンシスアビダス(Miamiensis avidus)、ミアミエンシスエスピ(Miamiensissp.)、ウロネママリナム(Uronema marinum)、及びアノフリオイデスヘモフィリア(Anophryoides haemophilia)などの寄生虫を含む。
また、他の様態において、本願は、本願による組成物を、スクーチカ虫、または前記スクーチカ虫の胞子(cysts)または前記スクーチカ虫またはその胞子が寄生する魚類、甲殻類、または軟体類を含む海洋魚類、アワビなどの貝類、または前記海洋魚類の稚魚または貝類の稚貝；または前記海洋魚類または貝類または前記海洋魚類の稚魚または稚貝が棲息する棲息地または養殖地と接触するステップを含む、スクーチカ虫の抑制方法を提供する。
本願のアレキサンドリウム属(Alexandrium spp.)渦鞭毛藻類及びその培養液を含むスクーチカ虫抑制用組成物または方法は、スクーチカ虫以外の有用な魚類資源に対しては有害性のない安全な生物学的方法である。したがって、本願による組成物または方法は、スクーチカ虫の成長を効果的に抑制することができるため、海洋魚類の養殖などにおいて大きい損失を誘発するスクーチカ虫によるスクーチカ症の治療、制御及び／または予防に効果的に用いられることができる。
本明細書に添付される次の図面は、本願の好ましい実施形態を例示するものであって、上述の発明の内容とともに本願の技術思想をさらに理解させる役割をするものであるため、本発明はそのような図面に記載された事項にのみ限定されて解釈されてはならない。
本願は、アレキサンドリウム属(Alexandrium spp.)渦鞭毛藻類またはその培養液が、スクーチカ症を誘発するスクーチカ虫の成長を効果的に抑制することができるという見出しに基づくものである。
そこで、本願の一様態において、スクーチカ虫抑制剤は、アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を含む、スクーチカ症を誘発するスクーチカ虫の抑制用組成物に関する。
スクーチカ虫は、繊毛虫の一種である寄生虫であって、魚体に侵透してスクーチカ症を引き起こす。スクーチカ虫に感染した魚体は、細胞組織の壊死及び出血を起こし、最後には死に至ることになる。スクーチカ虫は魚体の鰓や鰭などのような体表から侵透する。かかるスクーチカ虫は、血管に沿って魚体内部に深く侵透する性質を有するため、体表だけでなく、胃腸、腎臓、肝臓などの内臓器官及び脳でも発見される。
魚類、甲殻類、軟体類などの殆どの海洋魚類でスクーチカ症の発病が確認されており、地域的な特性なく、全世界的に発生している疾病である。季節的には、寄生虫が活発に繁殖し得る夏のような高温水期に発生頻度が相対的に高く、スクーチカ虫の繁殖水温範囲は５℃〜３０℃と広いため、一年を通して持続的に発生する疾病と知られている。特に、寄生虫が活発に繁殖し得る富栄養化された海岸や養殖水槽で頻繁に発生する疾病である。感染時に駆除が容易ではなく、大量感染、大量斃死の様相を有するため、養殖産業において大きい被害を起こす疾病として深刻な問題となっている。
スクーチカ症の原因になるスクーチカ虫はスクーチカ虫目の寄生虫であって、３０μｍ〜４０μｍサイズの繊毛虫の形態を示す。このような前記スクーチカ虫目の寄生虫の中でも、多くの被害を発生させる主要種としては、ミアミエンシスアビダス(Miamiensis avidus)、ミアミエンシスエスピ(Miamiensissp.)、ウロネママリナム(Uronema marinum)、及びアノフリオイデスヘモフィリア(Anophryoides haemophilia)などが代表的なものとして知られている(Songet al.,Dis Aquat Org 83:133-143,2009;Lavallee et al.,Dis Aquat Org46:231-236,2001)。現在、ミアミエンシス属にはミアミエンシスアビダスの１種のみが存在すると知られているが、本発明で用いられたミアミエンシスエスピは、遺伝子分析の結果、ミアミエンシス属には属するが、ミアミエンシスアビダスとは異なる種であると判断される。したがって、当業者であれば、本願による組成物及び方法が、スクーチカ虫を引き起こすスクーチカ虫目に属する様々な種の成長抑制または死滅に用いられることができることが分かるであろう。
本願によると、特に、アレキサンドリウム属の微細藻類がスクーチカ虫の死滅または抑制に効果的であることが確認された。
アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類は、幅が２０μｍ〜５０μｍ、長さが１５μｍ〜４０μｍ程度であり、全体的に丸状であって、中央部分が凹んでいて帯を巻いているような形状を有する単細胞生物である。
本願のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類、及び／またはアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類培養液は、スクーチカ虫を死滅させることができると確認された。すなわち、本願のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類及び／またはその培養液を含むスクーチカ虫抑制剤は、スクーチカ虫の駆除または制御に効果的に用いられることができる。
また、本願のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類及びその培養液を含むスクーチカ虫抑制剤は、スクーチカ虫以外の有用な魚類資源に対しては有害性がないと確認された。
スクーチカ虫抑制効果を有する本願のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類としては、アレキサンドリウムアンデルソニ(Alexandrium andersonii)、アレキサンドリウムフラテルクルス(Alexandriumfraterculus)、アレキサンドリウムヒラノイ(Alexandrium hiranoi)、またはアレキサンドリウムインスエタム(Alexandrium insuetum)などを用いることができるが、特にこれに限定されるものではない。
本願による一実施形態において、本願による組成物は、スクーチカ虫の成長を抑制するのに十分な量が含まれ、特に、処理後２４時間以内に効果を奏するためには、アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類は１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の濃度で含まれ、培養液が用いられる場合には、２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の濃度のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を培養した培養液が用いられることができる。
一実施形態において、培養液が用いられる場合、新鮮な培養液にアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を接種し、前記初期接種された微細藻類が定常期に達するまで培養した後、微細藻類を除去して使用する。微細藻類のような細胞の成長期は、最初接種してから遅延期(log phase)、対数期(exponential phase)、定常期(stationary phase)、及び死滅期(death pahse)で構成され、各期に達したかは、培養中に一部試料を採取して吸光度などを測定して容易に判断することができる。
また、他の様態において、本願はまた、上述の本願による組成物を、スクーチカ虫、または前記スクーチカ虫の胞子(cysts)または前記スクーチカ虫またはその胞子が寄生する魚類、甲殻類、または軟体類を含む海洋魚類、アワビなどの貝類または前記海洋魚類の稚魚または貝類の稚貝；または前記海洋魚類または貝類または前記海洋魚類の稚魚または稚貝が棲息する棲息地または養殖地と接触するステップを含む、スクーチカ症を誘発するスクーチカ虫の抑制方法に関する。
本願による方法において、前記組成物は、スクーチカ虫の成長を抑制するのに十分な量で処理される。
一実施形態において、スクーチカ虫の成長を抑制するのに十分な量は、特に、処理時間によって変わり得る。例えば、特に処理後２４時間以内に効果を奏するためには、アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類は１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の濃度で含まれ、培養液が用いられる場合には、２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の濃度のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を培養した培養液が用いられることができる。
本願による方法は、様々な海洋魚種に処理されることができるが、特に、養殖魚種であるヒラメまたはクロソイに処理されることができ、養殖場に処理されることができる。
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による実施例は様々な他の形態に変形可能であり、本願の範囲が下記で詳述する実施例に限定されると解釈されてはならない。
（実施例）
（実施例）
＜アレキサンドリウムアンデルソニ(Alexandrium andersonii)の準備＞
アレキサンドリウムアンデルソニは２０１５年５月韓国の鎮海湾から純粋分離し、この時の水温は１５．３℃で、塩分は２７．４であった。アレキサンドリウムアンデルソニはマイクロピペットを用いて１つの細胞のみを純粋分離した後、細胞の密度が増加するにつれて、Ｆ／２‐ｓｉ培地(https://ncma.bigelow.org/algal‐recipes)が入った５０ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬのポリカーボネート瓶に順次移された。培養体は、２０℃の培養室で光度２０μＥ／ｍ２／ｓ、１４：１０の光周期に維持した。
＜ミアミエンシスアビダス(Miamiensis avidus)の準備＞
ミアミエンシスアビダスは、２０１６年２月韓国の済州島に位置したヒラメ養殖場の感染魚（５３０ｇ）から採取した脳から純粋分離した。この時のヒラメ養殖場の水温は１７．３℃であった。純粋分離されたミアミエンシスアビダスは、海水に１ｍｇ／１００ｍＬのプロテオース‐ペプトン(Proteose‐peptone)と酵母(yeast)を入れて培養した。培養体は、２０℃の培養室で光度２０μＥ／ｍ２／ｓ、１４：１０の光周期に維持した。
＜ミアミエンシスエスピ(Miamiensis sp.)の準備＞
ミアミエンシスエスピは２０１６年５月韓国の西海における飛鷹島の海域から純粋分離し、この時の水温と塩分は２０．８℃、３１．３であった。ミアミエンシスエスピは、イシマキガイ(Clithonretropictus)の幼生に感染されたものを発見した。ミアミエンシスエスピは、海水に１ｍｇ／１００ｍＬのプロテオース‐ペプトン(Proteose‐peptone)と酵母(yeast)を入れて培養し、培養体は、２０℃の培養室で光度２０μＥ／ｍ２／ｓ、１４：１０の光周期に維持した。現在、ミアミエンシス属にはミアミエンシスアビダスの１種のみが存在すると知られているが、本発明で用いられたミアミエンシスエスピは、遺伝子分析の結果、ミアミエンシス属には属するが、ミアミエンシスアビダスとは異なる種であると判断される。
＜実施例１．様々なアレキサンドリウム種を用いたスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）の抑制効果＞
それぞれのアレキサンドリウム種を約１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度のミアミエンシスアビダスとともに培養し、４８時間が経過した後に生きているミアミエンシスアビダスの数を計数した。実験に使用された各アレキサンドリウム種と、各種の実験密度は、Alexandrium andersonii(1072cells/mL)、Alexandriumcatenella(1296cells/mL)、Alexandriumfraterculus(308cells/mL)、Alexandriumhiranoi(562cells/mL)、Alexandrium insuetum(1294cells/mL)、Alexandrium leei(1091cells/mL)、Alexandriumminutum(1250cells/mL)、Alexandriumpacificum(1126cells/mL)、Alexandrium pohangense(928cells/mL)、Alexandrium tamarense(1194cells/mL)であった。そのうち、アレキサンドリウムアンデルソニ(Alexandrium andersonii)、アレキサンドリウムフラテルクルス(Alexandriumfraterculus)、アレキサンドリウムヒラノイ(Alexandrium hiranoi)、及びアレキサンドリウムインスエタム(Alexandrium insuetum)がミアミエンシスアビダスの成長を抑制する効果を有すると確認され、図１では、コントロールに対するミアミエンシスアビダスの成長率で示した。
＜実施例２．様々な濃度のアレキサンドリウムアンデルソニを用いたスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）の成長抑制効果＞
アレキサンドリウムアンデルソニの濃度が５０、１００、５００、１０００、２５００及び４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように準備した。上記のように準備された、細胞濃度の異なるアレキサンドリウムアンデルソニとともにスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）を培養し、時間による反応を確認して、図２に生存曲線で示した。
アレキサンドリウムアンデルソニとともに培養したミアミエンシスアビダスの細胞濃度は、時間が経過するにつれて急激に減少した。次のアレキサンドリウムアンデルソニの細胞濃度条件（５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、４８時間以後；１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後；２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１２時間以後；４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、６時間以後）でスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）は死滅した。しかし、アレキサンドリウムアンデルソニを次（５０〜１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後）の条件でともに投入した時に、ミアミエンシスアビダスは２５％〜３５％のみが生存した。
上記の結果から、２４時間以内にミアミエンシスを除去しようとする場合には、アレキサンドリウムアンデルソニの濃度を１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の濃度で使用することが効果的であることが分かる。
＜実施例３．アレキサンドリウムアンデルソニを用いた、海洋から分離されたスクーチカ虫（ミアミエンシスエスピ）の成長抑制効果＞
アレキサンドリウムアンデルソニの濃度が５０、１００、５００、１０００、２５００及び４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように準備した。
上記のように準備された、細胞濃度の異なるアレキサンドリウムアンデルソニとともにスクーチカ虫（ミアミエンシスエスピ）を培養し、時間による反応を確認して、図３に生存曲線で示した。
アレキサンドリウムアンデルソニとともに培養したミアミエンシスエスピの細胞濃度は、アレキサンドリウムアンデルソニの濃度によって異なるが、時間が経過するにつれて急激に減少した。これに対し、アレキサンドリウムアンデルソニのない実験群では、ミアミエンシスエスピの細胞濃度は漸次的に減少した。ミアミエンシスエスピは、アレキサンドリウムアンデルソニ（＜１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の条件では生存した。ミアミエンシスエスピは、アレキサンドリウムアンデルソニ（５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、４８時間後）の条件で１０％のみが生存した。しかし、ミアミエンシスエスピは、アレキサンドリウムアンデルソニ（１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、６時間後）の条件では殆どが死滅したことが確認された。
上記の結果から、海洋から分離されたミアミエンシスエスピの場合も、２４時間以内にミアミエンシスを除去しようとする場合には、アレキサンドリウムアンデルソニの濃度を１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の濃度で使用することが効果的であることが分かる。
＜実施例４．アレキサンドリウムアンデルソニ培養液を用いたスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）の抑制効果＞
アレキサンドリウムアンデルソニ培養液に含まれた細胞の濃度が５０、１００、５００、１０００、２５００及び４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように準備した。
上記のように準備された、濃度の異なるアレキサンドリウムアンデルソニ培養液とともにスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）を培養し、時間による反応を確認して、図４に生存曲線で示した。
アレキサンドリウムアンデルソニの培養液とともに培養したスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）の細胞濃度は、時間が経過するにつれて急激に減少した。次のアレキサンドリウムアンデルソニ培養液の濃度条件（２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後；４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後）でスクーチカ虫が殆ど死滅した。しかし、アレキサンドリウムアンデルソニ培養液の濃度条件（１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後；５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後；１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間以後）でのスクーチカ虫（ミアミエンシスアビダス）は、それぞれ６０、４０、２０％の生存率を示した。２４時間以後にもこの生存率は維持された。
＜実施例５．アレキサンドリウムアンデルソニ培養液を用いたスクーチカ虫（ミアミエンシスエスピ）の抑制効果＞
アレキサンドリウムアンデルソニ培養液の細胞濃度が５０、１００、５００、１０００、２５００及び４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように準備した。
培養条件はアレキサンドリウムアンデルソニの培養条件と同一である。要約すると、Ｆ／２‐ｓｉ培地を使用し、培養体は２０℃の培養室で光度２０μＥ／ｍ２／ｓ、１４：１０の光周期に維持した。培養時間は、初期に接種した個体数がそれ以上増加しない、成長定常期(stationary stage)に達するまでの時間であり、上記の温度と光度条件下で２〜３週程度培養した。培養後に、培養体をポア(pore)サイズ５μｍのフィルターを用いてフィルタリングして細胞を除去し、細胞のない培養液のみを実験に使用した。
上記のように準備されたアレキサンドリウムアンデルソニ培養液とともにスクーチカ虫（ミアミエンシスエスピ）を培養し、時間による抑制効果を確認して、図５に生存曲線で示した。
それに示されたように、全ての濃度で、アレキサンドリウムアンデルソニ培養液とともに培養したスクーチカ虫（ミアミエンシスエスピ）の細胞濃度は時間が経過するにつれて急激に減少した。但し、５０ｃｅｌｌｓ／ｍｌの低濃度の培養液ではミアミエンシスエスピが生存した。ミアミエンシスエスピは、アレキサンドリウムアンデルソニ培養液（５０〜５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、４８時間後）の条件では、アレキサンドリウムアンデルソニ培養液のないコントロール条件と類似の生存率を示した。
培養液を使用した時に、ミアミエンシスエスピはアレキサンドリウムアンデルソニ培養液（１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間後）の条件で２０％の生存率を示し、これは２４時間がさらに経過した後にも類似に維持された。ミアミエンシスエスピは、アレキサンドリウムアンデルソニ培養液（２５００〜４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２４時間後）の条件で殆どが死滅した。
上記の結果から、培養液を使用して２４時間以内にミアミエンシスを除去しようとする場合には、アレキサンドリウムアンデルソニ培養液の準備に必要な細胞濃度は、２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上で使用することが効果的であることが分かる。
前記実施例４及び５によると、アレキサンドリウムアンデルソニ細胞及びアレキサンドリウムアンデルソニ培養液がスクーチカ虫の成長を抑制することが確認され、一定の濃度以上では完全な死滅に至ることが確認された。
＜参考例１．アレキサンドリウムアンデルソニを含むスクーチカ虫抑制剤の毒性試験＞
アルテミアサリーナ（Artemia salina、ブラインシュリンプ）幼生に対するアレキサンドリウムアンデルソニの毒性実験のために、アルテミアサリーナの卵をきれいな海水に入れ、２０℃の培養室で光度２０μＥ／ｍ２／ｓ、１４：１０の培養室で２日間培養した。
孵化に成功して活発に動くアルテミアサリーナ幼生を毒性試験に使用した。
１０匹のアルテミアサリーナを、高密度に培養されたアレキサンドリウムアンデルソニ細胞を最終密度５０、１００、５００、１０００、２５００、４５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように投入した６ウェルプレートのそれぞれのウェルに入れ、濾過された海水を用いて最終体積が５ｍＬとなるようにした。そして、対照群として、きれいに濾過された海水に１０匹のアルテミアサリーナ幼生を投入した。１、２、４、６、２４時間が経過するについて死滅されたアルテミアサリーナ幼生の数を観察した。
２４時間が経過した後、アレキサンドリウムアンデルソニ細胞の密度が５０、１００、５００、１０００、２５００、４５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように投入したものの何れでも、死んだアルテミアサリーナ(Artemia salina)幼生は発見されなかった。
＜参考例２．アレキサンドリウムアンデルソニ培養液を用いたスクーチカ虫抑制剤の毒性試験＞
アルテミアサリーナ（Artemia salina、ブラインシュリンプ）幼生に対するアレキサンドリウムアンデルソニ培養液の毒性実験のために、アルテミアサリーナの卵をきれいな海水に入れ、２０℃の培養室で光度２０μＥ／ｍ２／ｓ、１４：１０の培養室で２日間培養した。
孵化に成功して活発に動くアルテミアサリーナ幼生を実験に使用した。
アレキサンドリウムアンデルソニ培養液を、アレキサンドリウムアンデルソニ細胞の最終密度５０、１００、５００、１０００、２５００、４５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬのそれぞれの密度に応じて６‐ウェルプレートに入れ、濾過された海水を用いて最終体積が５ｍＬとなるようにした。それぞれのウェルに１０匹のアルテミアサリーナを入れた。そして、対照群として、きれいに濾過された海水に１０匹のアルテミアサリーナ幼生を投入した。１、２、４、６、２４時間が経過するにつれて死滅されたアルテミアサリーナ幼生の数を観察した。
２４時間が経過した後、アレキサンドリウムアンデルソニ細胞の密度が５０、１００、５００、１０００、２５００、４５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように投入したものの何れでも、死んだアルテミアサリーナ(Artemia salina)幼生は発見されなかった。
前記参考例１及び２によると、アレキサンドリウムアンデルソニ細胞及びアレキサンドリウムアンデルソニ培養液は、アルテミアサリーナ幼生の成長に影響しないことが確認され、何れの濃度でも死んだアルテミアサリーナ幼生が発見されなかった。すなわち、アレキサンドリウム属の一種であるアレキサンドリウムアンデルソニにより、スクーチカ虫以外の生物には毒性がないことを確認することができた。
Claims (10)
- アレキサンドリウム属(Alexandrium spp.)渦鞭毛藻類または前記アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類の培養液を含む、スクーチカ症を誘発するスクーチカ虫抑制用組成物。
- 前記アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類は、アレキサンドリウムアンデルソニ(Alexandrium andersonii)、アレキサンドリウムフラテルクルス(Alexandriumfraterculus)、アレキサンドリウムヒラノイ(Alexandrium hiranoi)、及びアレキサンドリウムインスエタム(Alexandrium insuetum)からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のスクーチカ虫抑制用組成物。
- 前記スクーチカ虫は、スクーチカ虫目に属する寄生虫であることを特徴とする、請求項１に記載のスクーチカ虫抑制用組成物。
- 前記スクーチカ虫目に属する寄生虫は、ミアミエンシスアビダス(Miamiensisavidus)、ミアミエンシスエスピ(Miamiensis sp.)、ウロネママリナム(Uronema marinum)、及びアノフリオイデスヘモフィリア(Anophryoideshaemophilia)からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項３に記載のスクーチカ虫抑制用組成物。
- 前記アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類は１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の濃度で含まれ、
前記培養液は２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の濃度のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を培養した培養液である、請求項１に記載のスクーチカ虫抑制用組成物。 - 請求項１乃至４の何れか一項に記載の組成物を、スクーチカ虫；前記スクーチカ虫の胞子(cysts)；前記スクーチカ虫もしくはその胞子が寄生する魚類、甲殻類もしくは軟体類を含む海洋魚類、貝類または前記海洋魚類の稚魚もしくは貝類の稚貝；または前記海洋魚類、貝類または前記海洋魚類の稚魚もしくは稚貝が棲息する棲息地もしくは養殖地と接触するステップを含む、スクーチカ症を誘発するスクーチカ虫の抑制方法。
- 前記組成物に含まれたアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類の濃度は１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上である、請求項６に記載の方法。
- 前記組成物に含まれた培養液は、２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上のアレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を培養した培養液である、請求項６に記載の方法。
- 前記培養液は、前記アレキサンドリウム属渦鞭毛藻類を新鮮な培養液に接種した後、前記渦鞭毛藻類を成長段階の定常期(stationary phase)まで培養した培養液である、請求項８に記載の方法。
- 前記海洋魚類はヒラメまたはクロソイまたはその稚魚であり、前記貝類はアワビまたはその稚貝である、請求項６に記載の方法。
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